Характеристика человеческого моноклонального антитела C6D7-RBD, специфичного к рецепторсвязывающему домену S белка вируса SARS-CоV-2

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Новая коронавирусная инфекция COVID-19 — это острое вирусное заболевание, поражающее преимущественно верхние дыхательные пути. Этиологическим агентом COVID-19 является РНК-содержащий вирус SARS-CоV-2 (сем. Coronaviridae, род Betacoronavirus, подрод. Sarbecovirus). Нами получено высокоаффинное человеческое моноклональное антитело с авторским названием C6D7-RBD, специфичное к рецепторсвязывающему домену (RBD) S белка вируса SARS-CоV-2 вариант Wuhan-Hu-1, обладающее вируснейтрализующей активностью в тесте с рекомбинантными антигенами: ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АСЕ2) и RBD.

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ COVID-19 – (COronaVIrus Disease 2019); SARS-CoV-2– коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2); ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения; FDA – Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (U.S. Food and Drug Administration); чМКА – человеческое моноклональное антитело; МКА – моноклональное антитело; ACE-2 – ангиотензинпревращающий фермент 2; TMPRSS2 – трансмембранная сериновая протеаза 2; RBD – рецепторсвязывающий домен; ФСБ – фосфатно-солевой буфер; ФБС – фетальная сыворотка крупного рогатого скота; ИФА – иммуноферментный анализ; TMB – 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин; ФСБ-Тв – фосфатно-солевой буфер с добавлением Tween-20; ПААГ – полиакриламидный гель.

ВВЕДЕНИЕ

Новая коронавирусная инфекция COVID-19 (COronaVIrus Disease 2019), вызываемая вирусом SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2), впервые была зарегистрирована в конце 2019 года в городе Ухань – столице китайской провинции Хубэй. Несмотря на все попытки сдержать заболевание в Китае, вирус распространился по всему миру и вскоре Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила COVID-19 пандемией [1]. На сегодняшний день продолжающаяся пандемия этой инфекции не перестает уносить жизни людей. За небольшой промежуток времени в мире создано немало эффективных вакцин. Однако есть необходимость в создании средств пассивной иммунотерапии людей в умеренно тяжелых и тяжелых случаях заболевания, к которым относятся препараты на основе человеческих моноклональных антител (чМКА).

Геном вируса SARS-CoV-2 кодирует четыре структурных белка: поверхностный шиповидный гликопротеин S, мембранный M, белок нуклеокапсида N и оболочечный белок E. Белок S обуславливает возможность прикрепления, слияния и проникновения вируса в клетку хозяина. Под действием трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2) белок S расщепляется на две субъединицы – S1 и S2 [2, 3]. Непосредственно рецепторное взаимодействие вируса с клеткой хозяина осуществляется через RBD, который расположен в субъединице S1, а затем с помощью субъединицы S2 происходит соединение мембраны вируса и клетки хозяина [4]. Поэтому RBD является основной мишенью для получения чМКА, потенциально способных нейтрализовать вирус [5].

Исследователи всего мира в условиях быстро нарастающей заболеваемости и высокой смертности в ускоренные сроки разрабатывают инновационные лекарственные препараты, которые, в свою очередь, должны обладать большой клинической эффективностью и безопасностью.

В октябре 2020 года Министерство здравоохранения РФ утвердило применение плазмы от доноров-реконвалесцентов (лиц с подтвержденным случаем COVID-19 в стадии выздоровления) для лечения пациентов с тяжелым течением новой коронавирусной инфекции в связи с отсутствием препаратов для специфического лечения. В методических рекомендациях говорится, что возрастной диапазон донора должен быть от 18 до 55 лет, иметь массу тела более 55 кг, а забор плазмы крови должен проводиться не ранее чем через 14 дней после исчезновения клинических симптомов и двукратном отрицательном результате на РНК SARS-CoV-2 в орофарингеальном мазке, взятом с интервалом не менее 24 ч. Плазма крови должна обладать вируснейтрализующей активностью в разведении 1 : 160, концентрация общего белка в крови не менее 65 г/л [6].

На территории РФ нет опыта использования препаратов на основе моноклональных антител у тяжело больных пациентов, но есть одно запатентованное чМКА, обладающее нейтрализующей активностью, селективно взаимодействующее с RBD-фрагментом в составе S-белка вируса SARS-CoV-2 [7].

Получение чМКА, специфичных к RBD-домену белка S SARS-CоV-2, является перспективным направлением. В данном исследовании охарактеризовано полученное нами чМКА, которое может быть использовано для лечения COVID-19.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для выполнения данной работы нами был выбран донор крови, переболевший новой коронавирусной инфекцией COVID-19 и через 6 месяцев после выздоровления иммунизированный вакциной «Спутник Лайт» (пр-во ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия). От донора получено письменное информированное согласие на участие в работе. На 7 сутки после вакцинации был проведен забор периферической крови с последующим выделением из нее фракции В-лимфоцитов с помощью коммерческого набора RossetteSep™ Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell technologies, Канада) в соответствии с инструкцией производителя. Выделенные В-лимфоциты подвергали электрослиянию с миеломной клеточной линией K6H6/B5 (ATCC® CRL1823™) на приборе ECM 2001 (BTX Harvard Apparatus, США) согласно раннее опубликованной методике [8].

Культивирование полученных гибридом проводили при температуре 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2. Замену культуральной среды проводили 1 раз в трое суток. По достижении монослоя гибридной культуры проводили иммуноферментный анализ (ИФА) с целью выявления гибридом, синтезирующих специфические МКА к RBD-домену S-белка SARS-CoV-2.

Иммуноферментный анализ

Культуральную жидкость из лунок, в которых наблюдался рост гибридных клеток, тестировали с помощью ИФА в отношении специфического взаимодействия с рекомбинантным RBD вируса SARS-CoV-2 вариант Wuhan-Hu-1 (his-sars2-rbd, Invivogen). Для этого в лунки 96-луночного полистиролового планшета вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного белка RBD (his-sars2-rbd, Invivogen) в концентрации 1 мкг/мл на лунку в ФСБ и инкубировали при температуре 37°С в течение 2 ч на планшетном орбитальном шейкере (Elmi, Латвия) при скорости вращения платформы 370 об/мин. Затем каждую лунку планшета трехкратно отмывали, внося по 200 мкл ФСБ с добавлением 0.05% Tween-20 (ФСБ-Тв). Затем свободные валентности пластика блокировали молоком с массовой долей жира не более 0.5%, внося по 200 мкл в лунку, и инкубировали при температуре 37°C в течение 1 ч при тех же условиях. После инкубации лунки планшета трехкратно отмывали ФСБ-Тв. Далее в планшет вносили по 100 мкл культуральной жидкости, инкубацию и отмывку планшета проводили при тех же условиях. В качестве отрицательного контроля использовали лунки с чистым ФСБ, в качестве положительного контроля – ранее проверенную сыворотку крови донора с высоким титром антител к RBD-белку в разведении 1 : 25. После инкубации лунки планшета трижды отмывали ФСБ-Тв. Далее в лунки добавляли антитела кролика против цельной молекулы IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США), в разведении 1 : 20000. Планшет инкубировали при тех же условиях в течение 40 мин. По окончании инкубации планшет отмывали 6 раз, затем в лунки планшета вносили по 100 мкл проявочного раствора на основе 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (TMB). Реакцию оценивали по появлению синего окрашивания. Интенсивность окрашивания измеряли на планшетном спектрофотометре (Bio-Rad xMark) при длине волны 655 нм.

Колонии гибридных клеток, показавшие высокую (трехкратно превышающую значение отрицательного контроля) оптическую плотность в ИФА, клонировали и масштабировали в культуральных флаконах Corning® T-25 и T-75. Далее для наработки чМКА гибридную культуру культивировали в колбах 1.6 л Optimum Growth™ Flasks (Thomson Instrument Company, США).

Аффинная хроматография

Для получения чМКА C6D7-RBD культуральную жидкость, в которой культивировались одноименные гибридомы, очищали методом аффинной хроматографии на колонке с Protein G-сефарозой (HiTrapTM Protein G, Швеция) с использованием системы ÄKTA Start (GE Healthcare, США). Выделенные IgG переводили в ФСБ и доочищали методом гель-фильтрации на сорбенте Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, США). Чистоту полученной иммуноглобулиновой фракции проверяли методом SDS-электрофореза по Лэммли в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в редуцирующих и не редуцирующих условиях. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R-250.

Иммуноблот-анализ

Оценку иммунологической специфичности очищенного чМКА C6D7-RBD проводили методом иммуноблотинга. Для этого рекомбинантный RBD (1 мкг на дорожку) разделяли с помощью ПААГ-электрофореза в редуцирующих условиях, после чего проводили горизонтальный перенос белка из геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (GE Healthcare) стандартным методом. По окончании переноса мембрану погружали в обезжиренное (не более 0.5% жирности) молоко для блокировки свободных валентностей нитроцеллюлозы и инкубировали в течение 1 ч при покачивании и температуре 37°С. По окончании инкубации мембрану трижды отмывали ФСБ-Тв и погружали в раствор с чМКА C6D7-RBD с концентрацией 10 мкг/мл в ФСБ. Инкубацию и отмывку мембраны проводили при тех же условиях. чМКА детектировали на мембране козьими антителами против IgG человека, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma), в разведении 1 : 10 000 в ФСБ. Мембрану инкубировали в течение 40 мин при тех же условиях. После инкубации мембрану отмывали 6 раз ФСБ-Тв и проявляли 1% раствором диаминобензидина в ФСБ с добавлением хлоридов никеля и кобальта, а также 33% пероксида водорода в количестве 1 мкл на 1 мл проявочного раствора.

Определение классовой принадлежности чМКА C6D7-RBD

Для определения подкласса и изотипа очищенного чМКА C6D7-RBD использовали иммунохроматографический экспресс-тест (Iso-Gold™ Rapid Human Antibody Isotyping Kit, Канада). Перед проведением экспресс-теста все реагенты доводили до комнатной температуры. Опытный образец чМКА C6D7-RBD разводили в 200 мкл буфера для разведения образца (Part Number SDB-004) в соотношении 1 : 100. Затем в пробирку с опытным образцом погружали тест-полоску. Результат анализировали через 5–10 мин.

Определение параметров равновесной константы диссоциации чМКА C6D7-RBD с белком-мишенью RBD

Параметры равновесной константы диссоциации чМКА C6D7-RBD с белком-мишенью RBD определяли с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIAcore X-100 (Biacore, Швеция). Эксперимент проводили на сенсорном чипе CM5 в буфере HBS-EP (10 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0.005% поверхностно-активного вещества P20, pH 7.4). Антитела к гистидину конъюгировали с сенсорным чипом с использованием наборов His Capture Kit type 2 и Amine Coupling Kit (Cytiva, Швеция) в соответствии с инструкцией производителя. Рекомбинантный RBD (10 мкг/мл) наносили на подготовленный чип со скоростью 30 мкл/мин в течение 3 мин. После 10-минутной стабилизации антитело (концентрация от 6.25 до 100 нМ) вводили в течение 3 мин при постоянной скорости потока 40 мкл/мин. Диссоциацию контролировали в течение 90 мин, после чего чип регенерировали 10 мМ глицином pH 1.7 в течение 30 с при скорости потока 50 мкл/мин. Сенсорограммы нормализовали путем вычитания базовых значений RU из эталонной проточной кюветы (без захвата чМКА) и анализировали путем подгонки данных к модели связывания Ленгмюра 1 : 1 с помощью программного обеспечения Biacore T200 Evaluation Software.

Определение способности чМКА C6D7-RBD ингибировать взаимодействие белка АСЕ-2 с RBD

Определение вируснейтрализующей активности чМКА C6D7-RBD проверяли в конкурентном ИФА. С этой целью в лунки 96-луночного полистиролового планшета иммобилизовали рекомбинантный вариант белка RBD в концентрации 1 мкг/мл по описанной выше методике. Затем в лунки вносили чМКА C6D7-RBD в концентрации от 10 до 0.078125 мкг/мл с двухкратным серийным шагом разведения. Планшет инкубировали при температуре 37°C в течение 1 ч. После инкубации лунки планшета трижды отмывали ФСБ-Тв. Следующим этапом в лунки планшета вносили рекомбинантный белок человеческого ACE-2 (fc-hace2, Invivogen), конъюгированный с пероксидазой хрена, с использованием набора LYNX Rapid HRP Antibody Conjugation Kit (Bio-Rad). Инкубацию и отмывку планшета проводили при тех же условиях. Затем в лунки планшета вносили по 100 мкл проявочного раствора TMB. Реакцию оценивали по появлению синего окрашивания раствора. Интенсивность окрашивания измеряли на планшетном спектрофотометре (Bio-Rad xMark) при длине волны 655 нм. За 100% нейтрализующую активность принимали среднее значение оптической плотности фона (контрольные лунки без иммобилизации RBD, что равносильно случаю, когда он полностью заблокирован антителами), а за отсутствие нейтрализующей активности (0%) принимали среднее значение оптической плотности контрольных лунок, где ACE-2-HRP взаимодействует с RBD без внесения антитела. По контрольным значениям получали линейную функцию, с помощью которой значения оптической плотности в опытных лунках с различным количеством антитела переводили в процентное значение нейтрализующей активности.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате электрослияния плазмобластов с клетками-партнерами K6H6/B5 получено 5 гибридом, из которых по итогам скрининга на специфичность синтезируемых ими антител к RBD была выбрана одна гибридома, названная C6D7-RBD. Последующее масштабирование объема культивирования гибридом позволило получить большой объем супернатанта, в котором содержались антитела. Для получения чистой фракции иммуноглобулинов использовали методы хроматографической очистки.

Результаты хроматографической очистки чМКА C6D7-RBD

Чистоту иммуноглобулиновой фракции, полученной методом аффинной хроматографии с последующей доочисткой методом гель-фильтрации, проверяли с помощью SDS-электрофореза по Лэммли в 10% ПААГ в редуцирующих и не редуцирующих условиях (рис. 1). Положение очищенного чМКА C6D7-RBD на электрофореграмме соответствует его молекулярной массе. Степень чистоты очищенного чМКА C6D7-RBD составила, по данным денситометрии (GE Typhoon FLA 9500, Швеция), не менее 95%.

 

Рис. 1. Электрофореграмма чМКА C6D7-RBD. 1 – маркеры молекулярных масс PageRuler™ SM1811 (Fermentas, США). 2 – образец чМКА С6D7-RBD в редуцирующих условиях. 3 – образец чМКА С6D7-RBD в не редуцирующих условиях

 

Иммунологическая специфичность чМКА C6D7-RBD к рецепторсвязывающему домену S-белка вируса SARS-CoV-2

Специфичность чМКА C6D7-RBD в отношении рекомбинантного белка RBD доказали методом иммуноблотинга. Показано, что чМКА C6D7-RBD характеризуется специфической активностью в отношении рекомбинантного белка RBD (рис. 2).

 

Рис. 2. Определение специфичности чМКА C6D7-RBD в отношении рекомбинантного белка RBD. 1 – маркеры молекулярных масс PageRuler™ SM1811 (Fermentas, США). 2 – рекомбинантный RBD, детектированный чМКА C6D7-RBD

 

Результаты иммунохроматографического теста

Согласно данным иммунохроматографического теста исследуемое чМКА C6D7-RBD относится к изотипу G1 иммуноглобулинов класса G и содержит κ-цепь (рис. 3).

 

Рис. 3. Классовая принадлежность чМКА C6D7-RBD. 1 – тест-полоска для определения типа легкой цепи и классовой принадлежности иммуноглобулина. 2 – тест-полоска для определения подкласса иммуноглобулина G

 

Определение равновесной константы диссоциации чМКА C6D7-RBD с белком-мишенью RBD (Ухань)

Параметры аффинного взаимодействия чМКА C6D7-RBD с рекомбинантным белком RBD определяли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Величина равновесной константы диссоциации (KD) для чМКА C6D7-RBD составила: KD = 5.525 × 10-9 М (рис. 4).

 

Рис. 4. Результаты определения KD чМКА C6D7-RBD в отношении белка-мишени RBD

 

Определение RBD-ACE2-нейтрализующей активности чМКА C6D7-RBD

Из представленных на рис. 5 данных видно дозозависимое повышение нейтрализующей активности чМКА C6D7-RBD. При максимальной концентрации 10 мкг/мл чМКА C6D7-RBD наблюдалось практически полное (97%) ингибирование взаимодействия АСЕ-2 и RBD (Ухань). Добавление чМКА C6D7-RBD в концентрации 0.625 мкг/мл ингибировало АСЕ-2 – RBD (Ухань) взаимодействие на 36%, а при минимальной концентрации чМКА C6D7-RBD (0.078125 мкг/мл) нейтрализующая активность практически отсутствовала (2%).

 

Рис. 5. Определение RBD-ACE2-нейтрализующей активности чМКА C6D7-RBD

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Получение чМКА с физиологически спаренными тяжелой и легкой цепями, специфичного в отношении выбранной мишени и к тому же обладающего вируснейтрализующей активностью – довольно сложная задача. Нами использованы современные методы цитометрического сортинга с целью получения пула плазмобластов. Мы выбрали стратегию сортинга всей популяции плазмобластов (независимо от их специфичности), но забор крови проводили на 7-e сутки после вакцинации донора вакциной «Спутник Лайт». В ряде работ показано, что количество специфических плазмобластов увеличивается в крови на 7–8 сутки после вакцинации или заболевания [9–11]. Далее для увеличения количества получаемых нами гибридом мы применили метод электрослияния, эффективность которого на порядок выше, чем слияние с ПЭГ [8]. Использование клеточной линии K6H6/B5 в качестве клеток-партнеров позволило снизить вероятность последующей сегрегации хромосом человека из гибридомы [12]. В результате проведенной нами работы получено 12 гибридом, но только пять оказались специфичными в отношении RBD и только одна гибридома (C6D7-RBD) сохранила способность стабильно синтезировать антитело.

Дальнейший анализ показал, что C6D7-RBD относится к подклассу IgG1 и содержит легкую цепь типа κ. чМКА C6D7-RBD специфично к RBD SARS-CоV-2 с KD = 5.525 × 10-9 М.

Традиционные методы выявления способности МКА нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 основаны на оценке способности антител ингибировать бляшкообразование или цитопатогенное действие вируса на чувствительной культуре клеток. Работа с вирусом дикого типа SARS-CoV-2 подразумевает необходимость биоизоляции и проведения исследований в лабораториях, отвечающих требованиям безопасности работ с патогенными биологическими объектами II группы патогенности. Для облегчения скрининга нейтрализующей активности моноклональных антител или сывороток переболевших/вакцинированных доноров можно использовать «суррогатные» методы. К таким методам относится конкурентный ИФА, с использованием которого анализируется влияние антител на способность взаимодействия рекомбинантных белков RBD и ACE-2 друг с другом. Этот метод отражает способность антител подавлять проникновение вируса внутрь клетки. В ряде работ показано, что большая часть вируснейтрализующих антител имеет специфичность к RBD поверхностного гликопротеина S SARS-CoV-2, и механизм их действия обусловлен ингибированием способности вируса связываться с вирусным рецептором ACE-2 на поверхности клетки-мишени. С использованием этого метода показано, что чМКА C6D7-RBD в концентрации 10 мкг/мл способно практически полностью блокировать взаимодействие RBD-ACE-2.

В мировой практике уже есть опыт использования препаратов, основой которых являются чМКА. В настоящее время FDA утвердило только три таких препарата для экстренного лечения COVID-19. В 2021 году британская фармацевтическая компания GSK (GlaxoSmithKline) и ее американский партнер Vir Biotechnology выпустили препарат Sotrovimab (VIR-7831) [13]. Препарат состоит из одного чМКА, специфичного к RBD S-белка вируса SARS-CоV-2 [14]. В том же 2021 году компанией AbCellera совместно с Исследовательским центром вакцин США в Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) разработан препарат LY-CoV555/бамланивимаб и LY-CoV016/этесевимаб [15]. Этот препарат состоит из коктейля чМКА, специфичных к RBD S-белка, а также специфичных к ACE-2 [16]. Третий утвержденный препарат Казиривимаб и Имдевимаб (REGN10933 и REGN10987), разработанный американской биотехнологической компанией Regeneron Pharmaceuticals, состоит из двух чМКА, специфичных к RBD S-белка вируса SARS-CоV-2 [17, 18]. Клинические испытания показывают, что для большей эффективности нейтрализации вируса SARS-CoV-2 необходимо использовать коктейль моноклональных антител, специфичных к RBD S-белка вируса SARS-CоV-2.

Таким образом, полученное нами чМКА C6D7-RBD перспективно для дальнейшего изучения эффективности его применения в качестве отдельного чМКА или в составе коктейля МКА для нейтрализации вируса SARS-CоV-2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С использованием методов цитометрического сортинга и гибридомной технологии нами получена гибридома, синтезирующая чМКА C6D7-RBD. чМКА C6D7-RBD относится к подклассу 1 IgG, легкая цепь представлена изотипом κ. чМКА C6D7-RBD специфично к RBD SARS-CоV-2 с KD = 5.525 × 10-9 М и проявляет способность ингибировать взаимодействие между АСЕ-2 и RBD-белками, что позволяет рассматривать возможную способность данного чМКА нейтрализовать проникновение вируса SARS-CоV-2 в клетку.

Работа выполнена в рамках государственного задания НИОКР 3.1.3.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

Об авторах

Яна Олеговна Романенко

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Марина Владимировна Силкина

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Алена Сергеевна Карцева

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Максим Александрович Марьин

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Мария Андреевна Шкуратова

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Мария Александровна Макарова

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Алена Константиновна Рябко

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Дарья Андреевна Конышкова

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Наталья Андреевна Зенинская

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Анна Евгеньевна Хлынцева

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Игорь Георгиевич Шемякин

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Виктория Валерьевна Фирстова

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Email: muntian.jana@yandex.ru
Россия, Оболенск, Московская обл., 142279

Список литературы

  1. Yan Y., Chang L., Wang L. // Rev. Med. Virol. 2020. V. 30. № 3. P. e2106.
  2. Huang Y., Yang C., Xu X.F., Xu W., Liu S.W. // Acta Pharmacologica Sinica. 2020. V. 41. № 9. P. 1141–1149.
  3. Kumar S., Chandele A., Sharma A. // PLoS Pathogens. 2022. V. 17. № 9. P. e1009885.
  4. Raybould M.I., Kovaltsuk A., Marks C., Deane C.M. // Bioinformatics. 2021. V. 37. № 5. P. 734–735.
  5. Xia S., Yan L., Xu W., Agrawal A.S., Algaissi A., Tseng C.T.K., Wang Q., Du L., Tan W., Wilson I.A., et al. // Sci. Adv. 2019. V. 5. № 4. P. eaav4580.
  6. Камкин Е.Г. Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19). Временные методические рекомендации. М.: Министерство здравоохранения РФ, 2020.
  7. Шахпаронов М.И., Павлюков М.С., Антипова Н.В. Моноклональное антитело к RBD-фрагменту в составе S-белка вируса SARS-CoV-2. Патент РФ на изобретение № 2744274. 2021.
  8. Силкина М.В., Карцева А.С., Рябко А.К., Марьин М.А., Романенко Я.О., Калмантаева О.В., Хлынцева А.Е., Шемякин И.Г., Дятлов И.А., Фирстова В.В. // Биотехнология. 2021. Т. 37. № 2. С. 77–87.
  9. Scholzen A., Nahrendorf W., Langhorne J., Sauerwein R.W. // PLoS One. 2014. V. 9. № 7. P. e102885.
  10. Traggiai E., Becker S., Subbarao K., Kolesnikova L., Uematsu Y., Gismondo M.R., Murphy B.R., Rappuoli R., Lanzavecchia A. // Nat. Мedicine. 2004. V. 10. № 8. P. 871–875.
  11. Ušaj M., Trontelj K., Miklavčič D., Kandušer M. // J. Membrane Biol. 2010. V. 236. № 1. P. 107–116.
  12. Yu X., McGraw P.A., House F.S., Crowe J.E., Jr. // J. Immunol. Meth. 2008. V. 336. № 2. P. 142‒151.
  13. Tuccori M., Ferraro S., Convertino I., Cappello E., Valdiserra G., Blandizzi C., Maggi F., Focosi D. // MAbs. 2020. V. 12. № 1. P. 1854149.
  14. Cathcart A.L., Havenar-Daughton C., Lempp F.A., Ma D., Schmid M.A., Agostini M.L., Guarino B., Di Julio J., Rosen L.E., Tucker H., et al. // bioRxiv. 2021. P. 2021.03.09.434607.
  15. Jones B.E., Brown-Augsburger P.L., Corbett K.S., Westendorf K., Davies J., Cujec T.P., Wiethoff C.M., Blackbourne J.L., Heinz B.A., Foster D., et al. // Sci. Translat. Med. 2021. V. 13. № 593. P. eabf1906.
  16. Chen P., Nirula A., Heller B., Gottlieb R.L., Boscia J., Morris J., Huhn G., Cardona J., Mocherla B., Stosor V., et al. // New Engl. J. Med. 2021. V. 384. № 3. P. 229–237.
  17. Hansen J., Baum A., Pascal K.E., Russo V., Giordano S., Wloga E., Fulton B.O.¸ Yan Y., Koon K., Patel K., et al. // Science. 2020. V. 369. № 6506. P. 1010–1014.
  18. VanBlargan L.A., Errico J.M., Halfmann P., Zost S.J., Crowe J.E., Purcell L.A., Kawaoka Y., Corti D., Fremont D.H., Diamond M.S. // Nat. Мedicine. 2022. V. 28. № 3. P. 490–495.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
2. Рис. 1. Электрофореграмма чМКА C6D7-RBD. 1 – маркеры молекулярных масс PageRuler™ SM1811 (Fermentas, США). 2 – образец чМКА С6D7-RBD в редуцирующих условиях. 3 – образец чМКА С6D7-RBD в не редуцирующих условиях

Скачать (102KB)
3. Рис. 2. Определение специфичности чМКА C6D7-RBD в отношении рекомбинантного белка RBD. 1 – маркеры молекулярных масс PageRuler™ SM1811 (Fermentas, США). 2 – рекомбинантный RBD, детектированный чМКА C6D7-RBD

Скачать (72KB)
4. Рис. 3. Классовая принадлежность чМКА C6D7-RBD. 1 – тест-полоска для определения типа легкой цепи и классовой принадлежности иммуноглобулина. 2 – тест-полоска для определения подкласса иммуноглобулина G

Скачать (158KB)
5. Рис. 4. Результаты определения KD чМКА C6D7-RBD в отношении белка-мишени RBD

Скачать (59KB)
6. Рис. 5. Определение RBD-ACE2-нейтрализующей активности чМКА C6D7-RBD

Скачать (71KB)

© Романенко Я.О., Силкина М.В., Карцева А.С., Марьин М.А., Шкуратова М.А., Макарова М.А., Рябко А.К., Конышкова Д.А., Зенинская Н.А., Хлынцева А.Е., Шемякин И.Г., Фирстова В.В., 2023

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах