Механизмы регуляции Р-гликопротеина в условиях экзогенного и эндогенного окислительного стресса in vitro

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода; БСО – DL-бутионинсульфоксимин; ОС – окислительный стресс; CAR – конститутивный андростановый рецептор; HIF1a – фактор 1a, индуцируемый гипоксией; Nrf2 – ядерный фактор эритроидного происхождения 2; PXR – Х-рецептор прегнана; Pgp – P-гликопротеин.

ВВЕДЕНИЕ

Р-гликопротеин (Pgp, АВСВ1) − продукт гена множественной лекарственной устойчивости (MDR1) − АТР-зависимый белок-транспортер, локализованный на цитоплазматических мембранах энтероцитов кишечника, гепатоцитов, эпителиальных клеток почечных канальцев, эндотелиальных клеток гистогематических барьеров [1].

Pgp обладает широкой субстратной специфичностью и работает как транспортер оттока, ограничивая проникновение в клетку веществ, служащих его субстратами, таких, как противоопухолевые, гипотензивные, антигистаминные лекарственные средства, сердечные гликозиды, антиагреганты, антикоагулянты, стероидные и тиреоидные гормоны, антибиотики, ингибиторы протеиназы ВИЧ, иммунодепрессанты. Учитывая эти свойства, принято считать, что Pgp играет важную роль в защите опухолевых клеток от цитостатиков (формирование множественной лекарственной устойчивости опухолей), в ограничении транспорта субстратов в ткани плода и забарьерные органы (головной мозг, тестикулы), а также участвует в фармакокинетике (всасывании, распределении, выведении) лекарственных веществ [2, 3].

Активность и экспрессия Pgp могут изменяться под воздействием ряда веществ и факторов. Например, изменение экспрессии Pgp наблюдается в гематоэнцефалическом барьере при неврологических (эпилепсия) заболеваниях [4] и в клетках рака желудка, остеосаркомы [5, 6].

Окислительный стресс (ОС) – типовой патологический процесс, возникающий в результате сдвига баланса между оксидантами и антиоксидантами в пользу оксидантов, что приводит к нарушению окислительно-восстановительной сигнализации и контроля и/или к повреждению биомакромолекул [7]. ОС играет важную роль в патогенезе широкого спектра заболеваний, включая сердечно-сосудистые, онкологические, бронхолегочные, офтальмологические и т.д. [8]. Показано, что инкубация культуры гепатоцитов крысы с H₂O₂ (0.5−1 мМ, 72 ч) вызывает повышение экспрессии гена Pgp, количества и активности кодируемого им белка-транспортера [9]. Установлено также, что воздействие H₂O₂ в концентрации до 500 мкМ в течение 48 ч на первичную культуру клеток эндотелия крыс приводит к повышению экспрессии Pgp и в меньшей степени влияет на активность белка-транспортера [10]. В то же время обработка клеток hCMEC/D3 (модель гематоэнцефалического барьера in vitro) H₂O₂ (0.5−5 мМ, 20 мин) снижает транспортную активность Pgp [11]. На культуре эндотелиальных клеток сосудов головного мозга крыс показано, что Н₂О₂ в концентрации 200 мкМ вызывает развитие ОС и повышает экспрессию мРНК генов mdr1a и mdr1b, кодирующих Pgp, а также синтез самого белка Pgp. Предварительная обработка клеток полиэтиленгликоль-каталазой нивелировала данные изменения [12]. Воздействие ингибитора каталазы 3-амино-1,2,4-триазола (2−4 мМ в течение 72 ч или 10 мМ, 1 ч) на гепатоциты крысы приводило к усилению экспрессии мРНК mdr1b и Pgp [9]. Напротив, антиоксиданты (1 мМ аскорбат, 10 мМ маннит) заметно подавляли экспрессию мРНК mdr1b и избыточную экспрессию Pgp [13, 14]. Культивирование клеток Caco-2 в среде, содержащей 1 мкмоль/л Н₂О₂, повышало экспрессию в них Pgp, тогда как Н₂О₂ в концентрации 10 ммоль/л приводила к снижению экспрессии транспортера [15]. Н₂О₂ усиливал экспрессию Pgp в митохондриях клеток D407 (эпителиальный сегмент сетчатки), в то время как антиоксиданты ее подавляли [16].

В исследованиях, выполненных в нашей лаборатории на клетках линии Caco-2, показано, что кратковременное (3 ч) воздействие H₂O₂ в концентрации 10 и 50 мкМ приводило к понижению активности Pgp, а в концентрации 100 мкМ − еще и к снижению количества белка-транспортера. Увеличение длительности экспозиции до 24 и 72 ч выявило индукцию Pgp при низких концентрациях H₂O₂ (0.1−1 мкМ, 24 ч и 10 мкМ, 72 ч), а также снижение количества и активности Pgp при повышении концентрации H₂O₂ до 100 мкМ и выше [17].

Таким образом, в большинстве исследований показано, что воздействие прооксидантов повышает экспрессию и активность Pgp, которые могут подавляться при срыве адаптационных процессов и развитии декомпенсированного ОС.

Считается, что снижение количества Pgp в условиях ОС связано с повреждением молекулы белка-транспортера активными формами кислорода (АФК), однако механизмы повышения экспрессии Pgp не установлены. Предполагается, что в этом процессе могут участвовать транскрипционные факторы Nrf2 и HIF1 [17, 18]. Цель нашей работы состояла в изучении механизмов регуляции Pgp при развитии ОС.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток

В работе использовали линию клеток Caco-2 аденокарциномы ободочной кишки человека (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали при 37ºС и 5% содержании СО₂ в инкубаторе WS-189C (World Science, Корея) в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) с добавлением L-глутамина (4 мМ), 15% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед./мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (все Sigma-Aldrich, США). Клетки высевали в шестилуночные планшеты (Сorning, США), площадь поверхности лунки 9.6 см², количество клеток в лунке − 1.8–2.0 × 10⁶, рабочий объем питательной среды – 1.5 мл. Клетки культивировали в течение 21 сут, поскольку на данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в энтероцитоподобные клетки, сверхэкспрессирующие Pgp [19].

В ходе исследования были сформированы следующие экспериментальные группы:

1) контроль (n = 3) – клетки инкубировали в питательной среде с добавлением в эквивалентном объеме воды для инъекций (растворитель Н₂О₂ и БСО);

2) индукция Pgp в условиях моделирования ОС.

Экзогенный ОС моделировали, добавляя в питательную среду Н₂О₂ в концентрации 0.1, 0.5, 1 мкМ на 24 ч (5–50 × 10^-17 моль/клетка) и 10 мкМ на 72 ч (5 × 10^-15 моль/клетка).

Эндогенный ОС воспроизводили с помощью ингибитора синтеза глутатиона – DL-бутионинсульфоксимина (БСО, ингибитор γ-глутамилцистеин-синтетазы) [20] в конечной концентрации 10, 50 и 100 мкМ в питательной среде (5–50 × 10^-15 моль/клетка).

Концентрации прооксидантов и длительность экспозиции выбирали в соответствии с результатами предварительных экспериментов, в которых было доказано их индуцирующее действие на Pgp [17, 21].

3) Ингибирование ОС – одновременно с добавлением прооксидантов в питательную среду вносили глутатион в концентрации 1 мМ [22].

4) Оценка роли Nrf2-опосредованного механизма в индукции Pgp при развитии ОС – к клеткам в питательную среду за 30 мин до добавления Н₂О₂/ БСО вносили ингибитор N-(1,3-бензодиоксол-5-илметил)-5-(4-фторфенил)-тиено[2, 3-d]пиримидин-4-амин (AEM1, Sigma-Aldrich) в концентрации 5 мкМ [23].

5) Оценка роли HIF1-опосредованного механизма в индукции Pgp при развитии ОС – к клеткам в питательную среду за 30 мин до добавления Н₂О₂/БСО вносили N,N’-(дисульфандиилбис(этан-2,1-диил))-бис(2,5-дихлорбензолсульфонамид) (KC7F2, Sigma-Aldrich) в концентрации 7.5 мкМ [24].

6) Оценка роли CAR-опосредованного механизма в индукции Pgp при развитии ОС – к клеткам в питательную среду за 30 мин до добавления Н₂О₂/ БСО вносили ингибитор этиловый эфир [5-[(диэтиламино)ацетил]-10,11-дигидро-5Н-дибензо[b,f]азепин-3-ил]-карбаминовой кислоты (CINPA1, TOCRIS, Великобритания) в концентрации 10 мкМ [25].

7) Оценка роли PXR-опосредованного механизма в индукции Pgp при развитии ОС – к клеткам в питательную среду за 30 мин до добавления Н₂О₂/ БСО вносили кетоконазол, 10 мкМ (Sigma-Aldrich) [26].

Каждый эксперимент выполняли в трех повторностях. При экспозиции в течение 72 ч смену питательной среды, содержащей прооксидант и ингибитор, проводили каждые 24 ч.

Сверхпродукцию АФК под действием прооксидантов подтверждали с помощью флуоресцентных зондов

Клетки культивировали в 24-луночных планшетах. После инкубации с Н₂О₂ в течение 3 ч и с БСО в течение 24 ч в тестируемых концентрациях уровень внутриклеточных АФК оценивали с помощью окрашивания клеток MitoTracker Red CM-H₂ XRos (Invitrogen, США). Зонды MitoTracker Red (нефлуоресцентная форма) содержат восстановленный дигидроксирозамин, который проникает в живые клетки, связывается с тиоловыми группами в митохондриях и флуоресцирует при окислении АФК.

Клетки визуализировали с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX-53 (Olympus, Япония), затем снимали с лунок и лизировали с помощью 0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/M7513). Уровень свободных радикалов в лизате клеток определяли по интенсивности флуоресценции (λ_ex = 579 нм, λ_em = 599 нм) с помощью спектрофлуориметра (Shimadzu RF-6000, Япония) и пересчитывали на количество клеток (счетчик и анализатор жизнеспособности клеток Countess 3 Automated Cell Counter, США).

В остальных экспериментах клетки культивировали в шестилуночных планшетах.

Получение полных клеточных лизатов

После окончания экспозиции с Н₂О₂ и БСО клетки снимали с лунок шестилуночных планшетов раствором трипсин-EDТА (0.25% трипсина и 0.2% EDТА, Sigma-Aldrich), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторид гидрохлорид (AEBSF) 2 мМ, апротинин 0.3 мкМ, бестатин 130 мкМ, EDТА 1 мМ, транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо(4-гуанидино)бутан (Е-64) 14 мкМ, лейпептин 1 мкМ, Sigma-Aldrich) в течение 30 мин при +4°С и постоянном перемешивании из расчета 10⁷ клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 5000 g (CM-50, Eppendorf, Германия). Супернатант использовали для выполнения биохимических анализов.

Количество белка в пробах анализировали методом Брэдфорд (Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, ThermoFisher, США) [27].

Определение относительного количества Pgp в клетках линии Сасо-2 методом вестерн-блотинга

Белки супернатанта (20 мкг) подвергали электрофорезу с использованием 7.5% TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit (BioRad, США) в буферной системе Laemmli (BioRad). Образцы смешивали с буфером Laemmli, содержащим 50 мМ β-меркаптоэтанола (Helicon, США) в соотношении 1:3, инкубировали в течение 10 мин при 70°C. Электрофорез проводили при 100 В в течение 90 мин.

Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Trans-Blot Turbo Mini-Size nitrocellulose, BioRad) с использованием Mini Trans-Blot (BioRad) в течение 10 мин при 25 В и 1.3 А.

Белки на мембране блокировали 1% раствором Casein Blocker (BioRad), содержащим 0.1% Tween-20 (Sigma, Германия), в течение 1 ч и комнатной температуре.

Белок Pgp детектировали с использованием первичных моноклональных антител мыши (P-Glycoprotein Antibody MA5-13854, Invitrogen) в концентрации 1:200 в блокирующем растворе Casein bloсker (BioRad) в течение 2 ч при 37°C. Первичные антитела визуализировали с использованием вторичных антител кролика (Rabbit-anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP, Invitrogen) в разведении 1:4000 и инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре. Хемилюминесценцию фиксировали с использованием ChemiDocXRS+ (BioRad). Интенсивность полос определяли денситометрически с помощью программного обеспечения ImageLab (BioRad).

Молекулярная масса Pgp подтверждена путем сравнения с маркерами молекулярной массы (Precision plus protein standards Dual Color, BioRad).

Содержание Pgp нормировали по содержанию белка домашнего хозяйства GAPDH (первичные антитела GAPDH Loading Control Monoclonal Antibody (GA1R), DyLight 68 (Invitrogen), разведение 1:1000, вторичные кроличьи антитела – Rabbit-anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (Invitrogen), разведение 1:4000).

Статистический анализ

Полученные результаты анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (M±SD). Статистическую значимость различий оценивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью теста Даннетта. Статистически значимыми считали различия при p<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Продукция АФК при моделировании окислительного стресса

Экспозиция клеток линии Caco-2 с H₂O₂ в диапазоне концентраций 0.1, 0.5, 1.0, 10 мкМ в течение 3 ч приводила к повышению интенсивности флуоресценции клеток после окраски MitoTracker Red CM-H₂ XRos на 21.5 (р = 0.05), 27.3 (р = 0.046), 45.4 (р = 0.004), 61.1% (р = 0.001) соответственно по сравнению с контролем, принятым за 100% (рис. 1).

 

Рис. 1. Изменение уровня АФК под действием пероксида водорода (Н₂О₂) в клетках линии Сасо-2. А – окрашивание с помощью MitoTracker Red CM-H₂ XRos, увеличение ×400 раз. Б – интенсивность флуоресценции в лизате клеток. *р ≤ 0.05; **р < 0.01; ***р ≤ 0.001 по сравнению с контролем (тест Даннетта)

 

Аналогичным образом при воздействии БСО в концентрациях 10, 50 и 100 мкМ в течение 24 ч интенсивность флуоресценции клеток Сасо-2 после окраски MitoTracker Red CM-H₂ XRos возрастала на 38.8 (р = 0.001), 46.5 (р = 0.0004) и 70.2% (р = 0.0001) соответственно по сравнению с контролем (рис. 2).

 

Рис. 2. Изменение уровня АФК под действием DL-бутионинсульфоксимина в клетках линии Сасо-2. А – окрашивание с помощью MitoTracker Red CM-H₂ XRos, увеличение ×400 раз. Б – интенсивность флуоресценции в лизате клеток. ***р ≤ 0.001; ****р ≤ 0.0001 по сравнению с контролем (тест Даннетта)

 

Полученные результаты свидетельствуют о повышении продукции АФК в используемых экспериментальных моделях.

Изменение относительного количества Pgp в клетках линии Caco-2 в условиях экзогенного и эндогенного окислительного стресса

Воздействие Н₂О₂ (моделирование экзогенного ОС) в течение 24 ч в концентрации 0.1, 0.5 и 1 мкМ вызывало повышение количества Pgp на 78.9 (р = 0.0013), 67.1 (р = 0.0019) и 44.6% (р = 0.029) соответственно (рис. 3А) по сравнению с контролем. Увеличение длительности экспозиции до 72 ч приводило к повышению уровня Pgp при концентрации Н₂О₂ 10 мкМ – на 68.9% (р = 0.0033) по сравнению с контролем (рис. 3А).

 

Рис. 3. Относительное количество P-гликопротеина в клетках линии Сасо-2 при воздействии Н₂О₂ (А, экзогенный окислительный стресс) и DL-бутионинсульфоксимина (Б, эндогенный окислительный стресс). А) 1 – контроль; 2, 3, 4, 5 – пероксид водорода в концентрации 10 мкМ (72 ч), 0.1, 0.5 и 1 мкМ (24 ч) соответственно; Б) 1 – контроль; 2, 3, 4 – DL-бутионинсульфоксимин в концентрации 10, 50 и 100 мкМ (24 ч) соответственно. *р < 0.05; **р < 0.01; ****р < 0.0001, статистически значимые отличия от контроля (тест Даннетта)

 

Инкубация клеток линии Сасо-2 с БСО (моделирование эндогенного стресса) в концентрации 10, 50 и 100 мкМ в течение 24 ч приводила к увеличению относительного количества Pgp на 71.6 (р < 0.0001), 51.6 (р < 0.0001) и 25.4% (р = 0.007) соответственно (рис. 3Б).

При увеличении экспозиции до 72 ч эффект БСО нивелировался и количество Pgp не отличалось значимо от показателей в контроле.

Добавление GSH в концентрации 1 мМ в питательную среду с Н₂О₂ при всех концентрациях и сроках инкубации предотвращало повышение количества Pgp; его уровень не отличался значимо от показателей в контроле (рис. 4А).

 

Рис. 4. Относительное количество P-гликопротеина в клетках линии Сасо-2 при воздействии Н₂О₂ (А, экзогенный окислительный стресс) и DL-бутионинсульфоксимина (Б, эндогенный окислительный стресс) в сочетании с глутатионом (1 мМ). А) 1 – контроль; 2, 3, 4, 5 – пероксид водорода в концентрации 10 мкМ (72 ч), 0.1, 0.5 и 1 мкМ (24 ч) соответственно; Б) 1 – контроль; 2, 3, 4 – DL-бутионинсульфоксимин в концентрации 10, 50 и 100 мкМ (24 ч) соответственно. **р < 0.01, статистически значимые отличия от контроля (тест Даннетта)

 

При сочетанном использовании 1 мМ глутатиона и БСО в концентрации 100 мкМ и инкубации в течение 24 ч относительное количество Pgp возрастало на 19.7% (р = 0.003) по сравнению с контролем, однако это повышение было менее выраженным, чем при изолированном применении прооксиданта. При этом GSH предотвращал повышение уровня Pgp, вызванное воздействием БСО в течение 24 ч в более низких концентрациях 10 и 50 мкМ (рис. 4Б).

Таким образом, воздействие Н₂О₂ и БСО на клетки линии Cacо-2 (моделирование экзогенного и эндогенного ОС) приводит к повышению количества Pgp, а применение эндогенного антиоксиданта глутатиона нивелирует данную индукцию, за исключением воздействия БСО (100 мкМ) в течение 24 ч.

Изучение механизмов повышения количества Pgp под действием пероксида водорода и DL-бутионинсульфоксимина

Механизмы, приводящие к повышению количества Pgp в условиях экзогенного и эндогенного ОС, изучали с использованием ингибиторов транскрипционных факторов Nrf2 – AEM1, HIF1a – KC7F2, CAR – CINPA1, PXR – кетоконазола, стимулирующих экспрессию гена MDR1, кодирующего Pgp.

Ингибитор Nrf2 – AEM1 (5 мкМ) при совместной инкубации с Н₂О₂ при всех концентрациях и сроках экспозиции предотвращал повышение относительного количества Pgp, его уровень не отличался статистически значимо от уровня в контроле (рис. 5А).

 

Рис. 5. Относительное количество P-гликопротеина в клетках линии Сасо-2 при одновременном воздействии ингибитора ядерного фактора эритроидного происхождения 2 (АЕМ1, 5 мкМ) и Н₂О₂ (А) или DL-бутионинсульфоксимина (Б): А) 1 – контроль; 2, 3, 4, 5 – пероксид водорода в концентрации 10 мкМ (72 ч), 0.1, 0.5 и 1 мкМ (24 ч) соответственно; Б) 1 – контроль; 2, 3, 4 – DL-бутионинсульфоксимин в концентрации 10, 50 и 100 мкМ (24 ч) соответственно

 

Добавление к клеткам AEM1 в сочетании с БСО (10, 50 и 100 мкМ) и инкубации в течение 24 ч также препятствовало повышению относительного количества Pgp (уровень белка-транспортера не отличался от значений в контроле) (рис. 5Б).

Ингибитор HIF1a KC7F2 (7.5 мкМ) препятствовал повышению уровня транспортера в присутствии H₂O₂ (24 ч, все использованные концентрации) – относительное количество Pgp не отличалось статистически значимо от значений в контроле. При инкубации в течение 72 ч KC7F не влиял значимо на относительное количество Pgp – его содержание увеличивалось на 37% относительно значений в контроле (р = 0.0004) (рис. 6А).

 

Рис. 6. Относительное количество P-гликопротеина в клетках линии Сасо-2 при воздействии ингибитора фактора, индуцируемого гипоксией HIF1a (KC7F2, 7.5 мкМ) в сочетании с Н₂О₂ (А) и DL-бутионинсульфоксимином (Б): А) 1 – контроль; 2, 3, 4, 5 – пероксид водорода в концентрации 10 мкМ (72 ч), 0.1, 0.5 и 1 мкМ (24 ч) соответственно; Б) 1 – контроль; 2, 3, 4 – DL-бутионинсульфоксимин в концентрациях 10, 50 и 100 мкМ (24 ч) соответственно. ***р < 0.001, статистически значимые отличия от значений в контроле (тест Даннетта)

 

Добавление KC7F2 к клеткам, инкубируемым с БСО (10, 50 и 100 мкМ), также приводило к нормализации относительного количества Pgp, его уровень не отличался статистически значимо от уровня в контроле (рис. 6Б).

Добавление ингибитора CAR CINPA1 (10 мкМ) к клеткам, инкубируемым в присутствии 0.1, 0.5 и 1 мкМ H₂O₂ в течение 24 ч, не подавляло эффект прооксиданта: относительное количество Pgp увеличивалось на 51.5 (р = 0.0008), на 46.5 (р = 0.0019), на 31.3% (р = 0.02) соответственно по сравнению со значениями в контроле (рис. 7А).

 

Рис. 7. Относительное количество P-гликопротеина в клетках линии Сасо-2 при воздействии ингибитора конститутивного андростанового рецептора CAR (CINPA1, 10 мкМ) в сочетании с Н₂О₂ (А) и DL-бутионинсульфоксимином (Б): А) 1 – контроль; 2, 3, 4, 5 – пероксид водорода в концентрации 10 мкМ (72 ч), 0.1, 0.5 и 1 мкМ (24 ч) соответственно; Б) 1 – контроль; 2, 3, 4 – DL-бутионинсульфоксимин в концентрации 10, 50 и 100 мкМ (24 ч) соответственно. *р < 0.05; **р<0.01; ***р < 0.001, статистически значимые отличия от контроля (тест Даннетта)

 

Однако при длительности воздействия 72 ч CINPA1 препятствовал повышению уровня Pgp под действием 10 мкМ Н₂О₂ (рис. 7А).

CINPA1 при его совместном применении с БСО (10, 50 и 100 мкМ) предотвращал повышение относительного количества Pgp, уровень белка-транспортера не отличался значимо от показателей в контроле (рис. 7Б).

Ингибитор PXR кетоконазол (10 мкМ) при его совместном применении с Н₂О₂ не подавлял эффект индуктора окислительного стресса. Относительное количество Pgp возрастало на 64.6, 53.5 и 36.4% при воздействии Н₂О₂ (24 ч, 0.1, 0.5 и 1 мкМ) и на 62.6% при воздействии Н₂О₂ (72 ч, 10 мкМ) соответственно. р < 0.0001 в каждой серии опытов, рис. 8А.

 

Рис. 8. Относительное количество P-гликопротеина в клетках линии Сасо-2 при воздействии ингибитора Х-рецептора прегнана (кетоконазол, 10 мкМ) в сочетании с Н₂О₂ (А) и DL-бутионинсульфоксимином (Б): А) 1 – контроль; 2, 3, 4, 5 – пероксид водорода в концентрации 10 мкМ (72 ч), 0.1, 0.5 и 1 мкМ (24 ч) соответственно; Б) 1 – контроль; 2, 3, 4 – DL-бутионинсульфоксимин в концентрации 10, 50 и 100 мкМ (24 ч) соответственно. *р < 0.05; **р < 0.01; ****р < 0.0001, статистически значимые отличия от контроля (тест Даннетта)

 

В то же время кетоконазол предотвращал повышение количества Pgp под действием БСО в концентрации 100 мкМ и не влиял на эффекты прооксиданта в концентрациях 10 и 50 мкМ, уровень Pgp повышался на 18.8 (р = 0.0027) и 14.1% (р = 0.015) соответственно по сравнению с контролем (рис. 8Б).

Таким образом, при развитии экзогенного ОС (Н₂О₂) регуляция Pgp осуществляется в основном через сигнальный путь Nrf2-Кeap1, тогда как в случае эндогенного ОС (БСО) в регуляции Pgp принимают участие все изученные транскрипционные факторы.

ОБСУЖДЕНИЕ

Окислительный стресс – это редокс-зависимый процесс, на фоне которого протекает множество патологий различного генеза. Причина развития ОС может быть экзогенной (воздействие прооксиданта) и/или эндогенной (подавление внутриклеточной антиоксидантной защиты) [28].

В настоящем исследовании экзогенный ОС моделировали добавлением к клеткам линии Caco-2 пероксида водорода. H₂O₂ способен проникать через клеточные мембраны. При взаимодействии с металлами переменной валентности (Fe²⁺ или Cu⁺) в ходе реакций Фентона и Хабера–Вайса Н₂О₂ образует в клетках кислородсодержащие высокотоксичные свободные радикалы (гидроксильный радикал ^·ОН и супероксид-анион О₂^·-), которые могут вызывать окислительные повреждения биомакромолекул клетки [29]. Учитывая использованный в работе микромолярный диапазон концентраций Н₂О₂ и быструю скорость элиминации Н₂О₂ клетками [30], выявленные изменения количества Pgp, скорее всего, обусловлены сигнальными каскадами, которые запустил прооксидант.

Эндогенный ОС воспроизводили инкубацией клеток с БСО, который ингибирует фермент γ-глутамилцистеин-синтетазу (γ-GCS), играющий ключевую роль в синтезе и поддержании клеточного уровня глутатиона. Глутатион (GSH) – тиолсодержащий трипептид, обладающий собственной антиоксидантной активностью и необходимый для функционирования антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы). Снижение уровня эндогенного глутатиона уменьшает емкость эндогенной антиоксидантной системы, что провоцирует развитие ОС [31].

Динамика развития ОС подтверждена в нашем исследовании путем детекции АФК по интенсивности флуоресценции MitoTracker Red CM-H₂ XRos. При воздействии H₂O₂ повышение АФК наблюдалось уже через 3 ч, в то время как БСО повышал концентрацию АФК через 24 ч экспозиции, когда происходило истощение эндогенного пула глутатиона.

Развитие как экзогенного, так и эндогенного ОС приводило к повышению относительного количества Pgp. При этом добавление антиоксиданта глутатиона к клеткам вместе с используемыми прооксидантами предотвращало индукцию Pgp под действием Н₂О₂ и снижало (100 мкМ) или подавляло (10 и 50 мкМ) ее под действием БСО.

Частичное подавление индукции Pgp под действием глутатиона может быть связано с тем, что БСО, будучи ксенобиотиком, сам может повышать количество Pgp за счет стимуляции экспрессии гена MDR1.

На данный момент известно несколько механизмов регуляции Pgp, основным из которых является изменение экспрессии гена MDR1, кодирующего белок-транспортер [31].

В ходе настоящего исследования была оценена роль транскрипционных факторов Nrf2, HIF1a, CAR и PXR, которые активируются при окислительном стрессе [17, 33–35] и гипотетически могут повышать экспрессию Pgp.

Сигнальный путь Nrf2 считается основным механизмом регуляции антиоксидантной защиты клетки при ОС. В физиологических условиях ядерный фактор транскрипции Nrf2 входит в состав комплекса Keap1-Nrf2-Cullin-3, что обеспечивает его локализацию в цитозоле и блокирует специфическую активность. Nrf2 является редокс-чувствительным транскрипционным фактором, при окислении SH-групп в составе Keap1 происходит активация фактора, его транслокация в ядро и изменение биологических эффектов – индукция антиоксидантных ферментов [36].

Фактор, индуцируемый гипоксией (HIF1) – это транскрипционный фактор, играющий ключевую роль в адаптации клеток к снижению содержания кислорода в тканях [37]. HIF1 представляет собой гетеродимер, состоящий из двух белковых субъединиц – HIF1α и HIF1β. Функциональный статус HIF1 определяется экспрессией и активностью его α-субъединицы, регуляция которой осуществляется на нескольких уровнях: транскрипции, трансляции, посттрансляционных изменений, транслокации в ядро [38]. В условиях нормоксии кислород-зависимые пролингидроксилазы модифицируют пролин в структуре HIF1α. При ОС пролингидроксилазы неактивны, в этих условиях α- и β-субъединицы способны связываться друг с другом, проникать в ядро и активировать экспрессию целевых генов.

Конститутивный андростановый рецептор (CAR, NR1I3, подсемейство 1, группа I, член 3) и Х-рецептор прегнана (PXR, steroid and xenobiotic receptor – SXR, R1I2 – Nuclear Receptor Subfamily 1, Group I, Member 2) – входят в суперсемейство ядерных рецепторов, представленное в основном факторами транскрипции [39].

Эти рецепторы локализуются преимущественно в печени и кишечнике, где регулируют экспрессию ферментов I фазы биотрансформации, таких, как изоферменты CYP3A и CYP2B цитохрома P450, а также белков-транспортеров, в частности Pgp.

Относительное количество CAR и PXR увеличивается в условиях ОС в ответ на накопление продуктов пероксидации [34, 35].

Роль Nrf2 в регуляции Pgp оценивали с использованием AEM1 (ARE expression modulator 1), блокирующим взаимодействие Nfr2 с ARE (antioxidant respons(iv)e element) и подавляющим экспрессию генов, контролируемых данным транскрипционным фактором. В ходе исследования показано, что АЕМ1 блокировал способность Н₂О₂ и БСО (во всех применяемых концентрациях и сроках экспозиции) индуцировать Pgp.

Таким образом, Nrf2 принимает участие в регуляции Pgp в условиях как экзогенного, так и эндогенного ОС.

Ингибитор HIF1a KC7F2 (controls the biological activity of HIF1α) представляет собой симметричное соединение, которое избирательно подавляет клеточный синтез белка HIF1α, но не HIF1β, не влияя на транскрипцию мРНК HIF1α или стабильность белка HIF1α. KC7F2 при воздействии H₂O₂ и БСО в течение 24 ч нормализовал количество Pgp (препятствовал индуцирующему действию прооксидантов), а при воздействии в сочетании с Н₂О₂ в течение 72 ч не оказывал значимого эффекта (относительное количество Pgp возрастало под действием пероксида водорода).

Таким образом, известны два транскрипционных фактора – Nrf2 и HIF1, которые принимают участие в регуляции Pgp при развитии как эндогенного, так и экзогенного ОС. Можно предположить, что оба фактора могут связываться с промотором гена MDR1, кодирующего Pgp, и повышать его экспрессию. Ранее нами было показано, что при развитии ОС Nrf2 вызывает повышение экспрессии HIF1α [33], т.е. действие Nrf2 может реализоваться через HIF1α. Поскольку ингибирование Nrf2, в отличие от HIF1α, препятствовало индукции Pgp во всех при инкубации 24 и 72 ч в условиях экзогенного и эндогенного ОС, то в клетке, видимо, одновременно функционируют два описанных механизма.

В представленной работе в качестве ингибитора CAR использовали CINPA1 (CAR inhibitor not PXR activator 1), который взаимодействует и блокирует лигандсвязывающий домен CAR и подавляет его связывание с коактиваторами [40]. Для ингибирования PXR использовали противогрибковый препарат группы азолов – кетоконазол, который связывается с областью AF-2 (activation function) на N-концевом лигандсвязывающем домене PXR и таким образом подавляет его активацию [41].

CINPA1 не подавлял индукцию Pgp под действием Н₂О₂ при инкубации в течение 24 ч, а при воздействии в течение 72 ч препятствовал повышению уровня Pgp. Показано, что Н₂О₂ вызывает индукцию CAR [34], который, в свою очередь, видимо, повышает экспрессию Pgp при экспозиции 72 ч.

Сочетанное применение БСО и CINPA1 предотвращало повышение относительного количества Pgp; уровень белка-транспортера не отличался достоверно от показателей в контроле.

Ингибитор PXR кетоконазол, применяемый совместно с Н₂О₂, не подавлял эффект индуктора ОС. В то же время кетоконазол полностью предотвращал повышение количества Pgp под действием БСО в концентрации 100 мкМ и лишь частично – при концентрациях 10 и 50 мкМ. CAR и PXR являются основными ксеносенсорными внутриклеточными рецепторами, т.е. они взаимодействуют с ксенобиотиками и запускают внутриклеточный ответ, направленный на их обезвреживание и выведение.

Можно предположить, что БСО, являясь ксенобиотиком, самостоятельно активирует CAR и PXR, а они, в свою очередь, повышают экспрессию Pgp. Сохранение повышенного уровня Pgp при совместном применении БСО и глутатиона, выявленное в нашем исследовании, подтверждает данное предположение.

Интересно отметить, что при моделировании как экзогенного, так и эндогенного окислительного стресса, несмотря на одновременное участие в индукции Pgp разных транскрипционных факторов, ингибирование только одного из них приводило к подавлению повышения количества Pgp, что свидетельствует о том, что для индукции Pgp в определенных ситуациях необходимо совместное действие нескольких механизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в повышении количества Pgp при развитии экзогенного ОС, вызванного инкубацией клеток линии Сасо-2 с H₂O₂, вероятно, первостепенная роль принадлежит сигнальному пути Nrf2-Keap1, который участвует в регуляции белка-транспортера при длительности воздействия 24 и 72 ч. Транскрипционный фактор HIF принимает участие в регуляции Pgp при воздействии H₂O₂ в течение 24 ч, а транскрипционный фактор CAR – при времени инкубации 72 ч. PXR, видимо, не вносит существенный вклад в регуляцию белка-транспортера при данной модели ОС.

При моделировании эндогенного ОС на клетках Сасо-2 с помощью ингибитора синтеза глутатиона – БСО – установлено, что все протестированные транскрипционные факторы и сигнальные пути участвуют в индукции Pgp. Скорее всего, это связано с бимодальным влиянием БСО на Pgp. С одной стороны, он вызывает развитие ОС, с другой – будучи ксенобиотиком, может стимулировать PXR и CAR.

Об авторах

Юлия Владимировна Абаленихина

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: abalenihina88@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0427-0967
SPIN-код: 4496-9027

к.б.н., доцент, доцент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО

Россия, Рязань, 390026

Алексей Владимирович Щулькин

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: alekseyshulkin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-1688-0017
SPIN-код: 2754-1702

д.м.н., доцент, профессор кафедры фармакологии

Россия, Рязань, 390026

Павел Юрьевич Мыльников

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: abalenihina88@mail.ru

ассистент кафедры фармакологии

Россия, Рязань, 390026

Егор Дмитриевич Рокунов

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: abalenihina88@mail.ru

студент 6 курса лечебного факультета

Россия, Рязань, 390026

Елена Николаевна Якушева

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: abalenihina88@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6887-4888
SPIN-код: 2865-3080

д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии

Россия, Рязань, 390026

Список литературы

Дополнительные файлы