Изменение профиля экспрессии микроРНК в лейкоцитах пациентов с болезнью Паркинсона

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БП – болезнь Паркинсона; REM-фаза – фаза быстрых движений глаз (rapid eye movement); UPDRS – унифицированная рейтинговая шкала оценки болезни Паркинсона (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale); NMSQ – опросник немоторных симптомов (Non-Motor Symptoms Questionnaire); HADS – госпитальная шкала тревоги и депрессии (Hospital Anxiety and Depression Scale); MоCA – Монреальская шкала когнитивной оценки (Montreal Cognitive Assessment); PDQ-39 – опросник качества жизни пациентов с болезнью Паркинсона (Parkinson’s Disease Questionnaire).

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Паркинсона (БП) – одно из наиболее распространенных двигательных расстройств, представляющее серьезную медицинскую и социальную проблему. Согласно современным представлениям, БП относится к синуклеинопатиям – заболеваниям, которые характеризуются формированием патологических агрегатов альфа-синуклеина в центральной и периферической нервной системе [1]. К синуклеинопатиям относятся, помимо БП, деменция с тельцами Леви, мультисистемная атрофия, изолированная вегетативная недостаточность. Важным предиктором развития синуклеинопатий является нарушение поведения в REM-фазу сна [1].

Диагностика БП до настоящего времени остается, в первую очередь, клинической. При этом по данным патоморфологической верификации даже специалисты в области двигательных расстройств ставят правильный клинический диагноз БП лишь примерно в 80% случаев [2]. Существующие методы радиоизотопной нейровизуализации (позитронно-эмиссионная и однофотонно-эмиссионная компьютерная томография) позволяют точно оценить состояние дофаминергических проводящих путей и тем самым значительно улучшить точность диагностики БП [3]. Однако это дорогостоящие методы, связанные с лучевой нагрузкой, и они не позволяют дифференцировать БП с синдромами атипичного паркинсонизма [4]. Недостаточная точность прижизненной диагностики, особенно на ранних стадиях заболевания, считается одной из важных причин неудач в испытаниях препаратов для патогенетического лечения БП [5]. Таким образом, весьма актуальна разработка информативных и доступных диагностических биомаркеров БП.

Молекулярный патогенез БП носит сложный характер. Одним из его компонентов предположительно является нарушение эпигенетической регуляции экспрессии генов, в том числе с участием микроРНК [6]. На данный момент в геноме человека выявлено более 5000 различных микроРНК (http://www.mirbase.org). Изученный механизм действия микроРНК заключается в реализации РНК-сайленсинга. В составе РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISK) микроРНК связывается с 3’-концом комплементарной мРНК, что приводит к ее деградации и предотвращению трансляции белка [7]. Описаны и другие механизмы регуляции экспрессии с участием микроРНК [8]. Немаловажно, что одна микроРНК может связываться более чем с 200 различными мРНК, индуцируя таким образом сдвиги в регуляции целых белковых ансамблей [9]. Подобные изменения могут быть основой для развития самых разнообразных патологических процессов, в том числе, приводящих к нейродегенерации.

При БП сдвиги концентраций микроРНК, определяемых в крови, могут в значительной степени отражать вовлечение в патологический процесс множества органов и систем – именно с полиорганной патологией связывают развитие столь характерных для БП немоторных проявлений (желудочно-кишечных, кардиальных и др.). Таким образом, знание особенностей концентраций микроРНК в крови позволило бы создать новый информативный биомаркер БП, в том числе для ранней и дифференциальной диагностики заболевания, прогнозирования характера его течения, более точной оценки соотношения моторных и немоторных проявлений и т.д.

Изучена возможность использования тех или иных микроРНК в диагностике БП [10–12]. В некоторых работах в качестве биомаркера БП изучали панели из нескольких микроРНК [13–16]. При этом следует учитывать, что профиль микроРНК достаточно динамичен и подвержен изменениям под воздействием различных факторов. Так, показано, что на профиль микроРНК влияет текущая противопаркинсоническая терапия [17–20] и проводимая пациенту глубинная стимуляция мозга [21]. По результатам анализа опубликованных данных мы выбрали 15 микроРНК, экспрессия которых в крови и головном мозге пациентов с БП значимо отличалась от экспрессии в контрольной группе, как минимум, в двух исследованиях.

В нашей работе оценена значимость выбранных микроРНК для диагностики БП и их взаимосвязь с клиническими характеристиками заболевания.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В исследование были включены 70 пациентов с БП и 40 здоровых добровольцев. Группа БП состояла из 35 мужчин и 35 женщин (средний возраст 60.5 ± 11.8 лет). Пациенты контрольной группы были сопоставимы по полу и возрасту с основной группой. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Научного центра неврологии, все участники исследования подписывали информированное согласие.

Диагноз БП устанавливали в соответствии с критериями Международного общества по болезни Паркинсона и расстройствам движений – MDS [22]. Возраст дебюта – 53 ± 13 лет, длительность заболевания 6.4 ± 7.0 лет. Смешанная форма БП отмечена у 52 пациентов (74.3%), акинетико-ригидная форма – у 18 (25.7%). Средняя оценка выраженности клинических проявлений по унифицированной рейтинговой шкале оценки болезни Паркинсона (UPDRS) составила 65.6 ± 27.1 балла, средняя стадия заболевания по функциональной шкале Hoehn–Yahr – 2.4 ± 0.9.

Все пациенты заполняли опросник немоторных симптомов – NMSQ; средняя сумма баллов составила 9.0 ± 5.2. Проведено тестирование по госпитальной шкале тревоги и депрессии – HADS (средняя сумма баллов 6.4 ± 4.0 и 7.0 ± 4.6 для тревоги и депрессии соответственно), а также по Монреальской шкале когнитивной оценки – MoCA (23.1 ± 4.2 балла). Пациенты заполняли опросник качества жизни для пациентов с болезнью Паркинсона – PDQ-39 (44 ± 30 баллов).

Большинство пациентов с БП получали противопаркинсонические препараты, в том числе: леводопу (41 пациент, 58.6%), агонисты дофаминовых рецепторов (30 пациентов, 42.6%), препараты амантадина (20, 28.6%). Двадцать три пациента (32.9%) не получали какой-либо терапии на момент включения в исследование.

В работе исследованы следующие 15 микроРНК: miR-7-1-5p, miR-24-1-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-30c-1-5p, miR-106a-5p, miR-126-3p, miR-129-1-5p, miR-132-3p, miR-135b-5p, miR-146a-5p, miR-185-5p, miR-214-3p, miR-221-3p, miR-520d-5p.

Из венозной крови всех обследуемых выделяли лейкоцитарную фракцию. Далее с помощью набора для выделения РНК RNeasy mini kit (Qiagen) выделяли тотальную РНК по стандартному протоколу производителя. После выделения РНК проводили специфичную для каждой микроРНК обратную транскрипцию с использованием праймеров stem-loop и набора для обратной транскрипции («Синтол»). Относительную концентрацию каждой РНК определяли при проведении полимеразной цепной реакции в реальном времени с помощью соответствующего набора (ООО «Синтол»), в качестве референсной РНК использовали miR-191-5p. Концентрацию РНК рассчитывали по методу 2(-ΔΔC(T)).

Статистическую обработку проводили в программе IBM SPSS и Statistica 10.0. Нормальность распределения значений проверяли с помощью теста Шапиро–Уилка. В связи с тем, что распределение значений микроРНК не соответствовало нормальному, использовали непараметрические критерии: критерий Манна–Уитни, критерий Краскила–Уоллиса, коэффициент корреляции Спирмена. Также использовали логистический регрессионный анализ и ROC-анализ. Статистический уровень значимости принимали равным 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В группе БП по сравнению с контрольной группой выявлено статистически значимое повышение уровня экспрессии трех микроРНК – miR-7-1-5p, miR-29c-3p и miR-185-5p, и снижение экспрессии двух микроРНК – miR-29a-3p и miR-30c-1-5p (табл. 1). Однако, несмотря на статистическую значимость выявленных различий, наблюдалось значительное перекрывание значений относительной экспрессии в исследованных группах.

 

Таблица 1. Экспрессия микроРНК у пациентов с болезнью Паркинсона и в контрольной группе

МикроРНК	Болезнь Паркинсона	Контрольная группа	р (U)
miR-7-1-5p	0.68 [0.19; 1.7]	0.2 [0.04; 1.5]	0.024*
miR-24-1-3p	455.72 [0.43; 654.6]	480.88 [0.83; 602.4]	0.684
miR-29a-3p	0.63 [0.41; 1.01]	0.97 [0.66; 1.4]	0.003**
miR-29c-3p	1.76 [0.93; 3.58]	0.77 [0.59; 1.98]	0.003**
miR-30c-1-5p	0.53 [0.34; 1.43]	1.03 [0.46; 1.77]	0.043*
miR-106a-5p	1.41 [0.43; 3.5]	1.39 [0.76; 2.8]	0.691
miR-126-3p	0.23 [0.15; 0.44]	0.4 [0.11; 0.8]	0.194
miR-129-1-5p	0.47 [0.2; 2.21]	0.4 [0.23; 0.71]	0.403
miR-132-3p	1.01 [0.4; 2.01]	0.87 [0.37; 1.39]	0.209
miR-135b-5p	54.5 [4.02; 2479.78]	284.29 [1.02; 149791.83]	0.946
miR-146a-5p	0.11 [0.03; 1.37]	0.07 [0.03; 0.34]	0.337
miR-185-5p	13631.02 [380.56; 21875.07]	863.02 [0.17; 14684.43]	0.017*
miR-214-3p	15.23 [6.97; 22.65]	15.75 [6.01; 27.3]	0.709
miR-221-3p	0.63 [0.42; 1.04]	0.72 [0.49; 0.99]	0.443
miR-520d-5p	0.27 [0.05; 1.02]	0.52 [0.04; 1.77]	0.374

*р<0.05; **р < 0.01. Жирным шрифтом выделены все случаи, где p<0.05.

 

Далее оценили возможность использования отдельных микроРНК в качестве биомаркеров БП. При проведении ROC-анализа установили, что некоторые микроРНК позволяют дифференцировать БП от контроля: miR-7-1-5p (AUC = 0.63, p = 0.024; 95% CI 0.517–0.742), miR-185-5p (AUC = 0.638; p = 0.016; 95% CI 0.53–0.744), miR-29c-3p (AUC = 0.673; p = 0.003; 95% CI 0.56–0.778). Однако очевидно, что чувствительность и специфичность этих биомаркеров недостаточны для применения в диагностике БП. Для поиска наиболее оптимальной комбинации микроРНК, которая могла иметь наибольшую информативность в качестве биомаркера, использовали логистический регрессионный анализ с помощью обратного метода Вальда. Наиболее информативной оказалась комбинация miR-29c-3p и miR-185-5p. При последующем проведении ROC-анализа площадь под кривой составила 0.715 (рис. 1). Таким образом, данная модель с двумя микроРНК позволяет с вероятностью 71.5% дифференцировать пациентов с БП от здоровых лиц.

 

Рис. 1. ROC-анализ модели логистической регрессии с miR-29c-3p и miR-185-5p для диагностики болезни Паркинсона

 

Нами изучена взаимосвязь экспрессии микроРНК с клиническими характеристиками БП. Не выявлено значимых корреляций уровней микроРНК с возрастом дебюта, тогда как выявлена одна корреляционная связь слабой силы (R < |0.3|) возраста на момент исследования с miR-135b-5p. Исследование корреляций уровней микроРНК с длительностью заболевания выявило шесть слабых, но значимых корреляций (miR-132-3p, miR-146a-5p, miR-106a-5p, miR-24-1-3p, miR-29a-3p, miR-30c-1-5p), а также две корреляции умеренной силы – с miR-126-3p (R = 0.316; p = 0.07) и miR-129-1-5p (R = 0.385; p = 0.001). Указанные микроРНК могут служить маркерами прогрессирования заболевания.

Анализ экспрессии микроРНК при разных формах БП показал, что при акинетико-ригидной форме уровень miR-29a-3p был значимо выше, чем при смешанной форме – 1.06 [0.6; 1.59] и 0.6 [0.43; 0.85] (p = 0.018) соответственно. Выявлена отрицательная корреляция между уровнем miR-30c-1-5p и стадией заболевания по шкале Hoehn–Yahr (R = –0.303; p = 0.19). При этом обнаружена дифференциальная экспрессия обеих указанных микроРНК (см. табл. 1) при БП и в контрольной группе. Корреляции уровней микроРНК с суммой баллов по шкале UPDRS и ее подшкалами не обнаружено. Выявлена отрицательная корреляция уровня miR-106a-5p с суммой баллов по шкале немоторных симптомов NMSQ (R = –0.358, p = 0.011). Не выявлено корреляций с баллами по шкалам тревоги и депрессии HADS. Корреляций с выраженностью когнитивных нарушений по шкале МоСА также не найдено.

Экспрессия miR-29a-3p (p = 0.045) была статистически значимо снижена в группе пациентов, которые получали терапию леводопой, у пациентов, принимавших как агонисты дофаминовых рецепторов, так и амантадин, наблюдалось снижение miR-7-1-5p (p = 0.0048 и р = 0.037 соответственно). Интересно, что экспрессия и miR-7-1-5p, и miR-29a-3p при БП отличается от экспрессии в контрольной группе (см. табл. 1).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время проведено значительное количество исследований биомаркерной роли микроРНК при БП, однако их результаты во многом противоречивы: это связано с тем, что разные исследователи изучают разные компоненты крови (плазма, лейкоциты, сыворотка, везикулы), а также с большим разнообразием изучаемых микроРНК и различиями в методах их детекции [23].

В настоящей работе мы использовали 15 микроРНК, экспрессия которых при БП, как показано в предшествующих исследованиях, значимо отличалась от экспрессии в контроле. По нашим данным, наибольшей диагностической значимостью при БП обладает комбинация двух микроРНК – miR-29c-3p и miR-185-5p. Отмечено также значимое повышение уровня miR-7-1-5p и снижение miR-29а-3p при БП, однако на уровень этих микроРНК, как показано в нашей работе, существенно влияет противопаркинсоническая терапия. Кроме того, показано значимое снижение miR-30c-1 при БП. Уровень этой микроРНК неуклонно снижается по мере течения болезни и нарастания ее тяжести по функциональной шкале Hoehn–Yahr, поэтому он может использоваться как маркер прогрессирования заболевания (т.е. маркер развернутых стадий БП).

Ряд других микроРНК, уровень которых был таким же, как в контрольной группе, тем не менее оказался связанным с немоторными проявлениями БП (miR-106a-5p) и с длительностью заболевания (miR-126-3p, miR-129-1-5p). Таким образом, эти микроРНК, не являясь биомаркерами непосредственно заболевания, могут быть полезными для более точного определения немоторных фенотипов БП и более объективного мониторинга течения болезни.

Роль miR-185 при БП анализировали в нескольких работах. На обработанной MPTP культуре дофаминергических клеток нейробластомы SH-SY5Y показано снижение уровня miR-185, а повышение экспрессии miR-185 уменьшало MPTP-индуцированный апоптоз и аутофагию [24]. В работе Rahimmi и соавт. на культурах клеток SH-SY5Y и крысах линии Wistar, у которых паркинсонизм вызывали с помощью инъекций ротенона, показано, что ингибирование экспрессии miR-185 специально подобранной малой интерферирующей РНК приводит к значительному повышению экспрессии гена LRRK2. Этот ген играет важную роль в патогенезе БП: мутации в нем приводят к развитию наследственных форм БП [25]. На животных моделях показано снижение miR-185 и увеличение экспрессии LRRK2 в черной субстанции и стриатуме. В работе Briggs и соавт. также наблюдали изменение экспрессии miR-185 в черной субстанции, но в противоположном направлении [26]. Возможность использования miR-185 в качестве биомаркера изучали в нескольких работах и в двух из них выявили снижение экспрессии уровня этой микроРНК при БП по сравнению с контрольной группой [15, 27], тогда как в нашей работе обнаружено повышение экспрессии данного потенциального маркера. Таким образом, результаты определения уровня экспрессии miR-185 при БП остаются противоречивыми.

Семейство miR-29 состоит из трех микроРНК: miR-29a, miR-29b и miR-29с. При изучении использования этих микроРНК в качестве биомаркеров неоднократно наблюдали снижение экспрессии miR-29a и miR-29c в крови пациентов с БП, причем снижение уровня miR-29a и miR-29c нарастало по мере прогрессирования заболевания по шкале Hoehn–Yahr [28]. В проспективном исследовании пациентов группы риска синуклеинопатий – пациентов с нарушениями поведения в REM-фазу сна, которым впоследствии установлен диагноз синуклеинопатии, выявлено снижение уровней miR-29a и miR-29c [29]. Отдельно miR-29a изучали в нескольких работах и показали снижение ее уровня, что соответствует нашим результатам [14, 30, 31]. Serafin и соавт. описали повышение экспрессии miR-29a только у пациентов, получающих терапию леводопой, но не выявили изменений у пациентов, не получавших лечения [19]. В нашей работе также показано снижение уровня miR-29a при назначении препаратов леводопы.

Увеличение экспрессии miR-29c, обнаруженное у пациентов с БП в турецкой популяции [32], соответствует нашим результатам, но противоречит большинству имеющихся данных [12, 14, 31]. В число мишеней этого весьма перспективного с патогенетической точки зрения семейства микроРНК входят выявленные с помощью предсказательных алгоритмов мРНК гена PARK-7 (DJ-1), мутации в котором могут приводить к развитию БП, мРНК GPR37, субстратом которой является белок паркин, ассоциированный с развитием ранней БП, а также различные регуляторы процессов апоптоза (Puma, Bim, Bak, Bcl2, IGF1, AKT1). Мишени отдельных микроРНК семейства miR-29 могут значительно перекрываться, но их роль в патогенезе различных форм БП не вызывает сомнений.

Согласно имеющимся данным, miR-7 снижает экспрессию альфа-синуклеина [33, 34], нарушение процессинга которого считается одним из ключевых звеньев патогенеза БП. В одной из работ показано снижение экспрессии miR-7 в головном мозге пациентов с БП, за счет чего, вероятно, увеличивается экспрессия альфа-синуклеина [6]. Показано также, что снижение экспрессии miR-7 увеличивает вероятность апоптоза и ухудшает рост дофаминергических нейронов в культуре [35]. В нашей работе, наоборот, уровень экспрессии miR-7 в группе БП был значимо выше, чем в контроле. В работе Alieva и соавт. также показано многократное увеличение экспрессии miR-7 в подгруппе пациентов с БП, получающих противопаркинсонические препараты [18]. В нашей работе не отмечено влияния леводопа-терапии на уровень miR-7, тогда как назначение агонистов дофаминовых рецепторов и амантадинов ассоциировано со снижением экспрессии miR-7. Противоречивые результаты в отношении уровня miR-7 при БП и влияния на него противопаркинсонической терапии требуют дальнейших уточнений.

Снижение уровня miR-30c-1 при БП, описанное в работах Vallelunga и соавт. и Martins и соавт., соответствует полученным нами результатам [31, 36]. Не установлено прямого влияния miR-30c-1 на экспрессию генов, ответственных за развитие БП, однако с помощью различных баз данных показано, что предполагаемые мишени данной микроРНК (Notch1, HDAC4, BECN1, UBE2I, HSPA4 и DNMT1) играют роль в регуляции аутофагии и апоптоза дофаминергических клеток [37].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, нами показано, что комбинация двух микроРНК (miR-29c-3p и miR-185-5p) может рассматриваться как потенциальный биомаркер БП, хотя и с умеренной диагностической значимостью. Показано, что уровень экспрессии ряда микроРНК отражает клинические характеристики БП, изменяется с длительностью и стадией заболевания, а также под воздействием проводимой терапии, может быть маркером формы заболевания и связан с выраженностью немоторных проявлений и качеством жизни пациентов с БП. Согласно опубликованным данным, некоторые из диагностических микроРНК связаны с определенными звеньями патогенеза БП. Полученные нами результаты являются предварительными и требуют дальнейших исследований.

Об авторах

Наталья Сергеевна Ардаширова

ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: ardashirova.n@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4813-9912

аспирант

Россия, Москва, 125367

Наталья Юрьевна Абрамычева

ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Email: nataabr@rambler.ru

руководитель ДНК-лаборатории 5-ого неврологического отделения, к.б.н.

Россия, Москва, 125367

Екатерина Юрьевна Федотова

ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Email: ekfedotova@gmail.com

руководитель 5-ого неврологического отделения, д.м.н.

Россия, Москва, 125367

Сергей Николаевич Иллариошкин

ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Email: snillario@gmail.com

заместитель директора по научной работе, директор Института мозга, д.м.н., проф., чл.-корр. РАН

Россия, Москва, 125367

Список литературы

Дополнительные файлы