Высокоаффинные однодоменные антитела для анализа апо- и голотрансферрина человека

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Holo-Tf и apo-Tf – железосодержащий и железонесодержащий белок трансферрин; нанотело – рекомбинантный белок, соответствующий вариабельному домену особых верблюжьих антител, состоящих из гомодимера укороченных тяжелых цепей, при отсутствии легких цепей иммуноглобулинов.

ВВЕДЕНИЕ

Железо – жизненно важный элемент, необходимый для осуществления ряда ключевых биологических процессов. Основными белками, регулирующими метаболизм железа в организме человека, являются трансферрин (Tf) и его рецепторы (TfR1 и TfR2) [1]. Высокая скорость пролиферации большинства опухолевых клеток, зависящая, в том числе, от поступления достаточного количества железа, часто ассоциирована с повышенной экспрессией TfR1 [2]. Tf – это гликопротеин размером 80 кДа, состоящий из двух субъединиц (N- и C- по 40 кДа). Каждая субъединица способна связывать один ион свободного трехвалентного железа (Fe³⁺), т.е. к Tf можно присоединить до двух ионов железа. Насыщенную железом форму Tf обозначают как holo-Tf. Не содержащая железо форма Tf, называемая apo-Tf, с высокой эффективностью связывает Fe³⁺ в крови и транспортирует его на поверхность клетки для интернализации посредством взаимодействия с TfR [3]. Клеточный рецептор TfR1 связывает holo-Tf с высокой аффинностью (K_d1 <0.1 нМ, K_d2 = 3.8 нМ, pH 7.4), тогда как аффинность apo-Tf примерно в 100 раз меньше (K_d1 = 49 нМ, K_d2 = 344 нМ, pH 7.4) [4]. Комплекс железосвязанного Tf c рецептором, образующийся на поверхности клетки, интернализуется посредством клатринзависимого эндоцитоза. Работа протонного насоса в эндосомальной мембране приводит к снижению pH до 5.5 (закисление эндосомы), что запускает конформационные изменения как в Tf, так и в TfR1, что приводит к последующему высвобождению железа из Tf. Трехвалентное железо (Fe³⁺) превращается в двухвалентное железо (Fe²⁺), комплекс рецептор/apo-Tf затем возвращается на поверхность клетки, где apo-Tf высвобождается из связи с рецептором при нейтральных значениях pH [5].

Коэффициент насыщения трансферрина железом представляет собой широко используемый клинический параметр, который рассчитывается как отношение содержания железа в крови пациента к показателю общей железосвязывающей способности сыворотки крови [6]. Это довольно общая характеристика, которая не позволяет выявить тонкие изменения в относительной представленности разных форм трансферрина в крови при патологических процессах. Более адекватным инструментом для исследования таких вероятных тонких изменений могут быть специфические антитела. В данной работе мы описываем однодоменные антитела (нанотела) к разным формам трансферрина, полученные с помощью технологии, развиваемой и используемой в нашей лаборатории на протяжении многих лет [7–10].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Плазма периферической крови трех больных с диагнозом рак яичников IV стадии по классификации FIGO и образец мочи одного больного с инвазивным раком мочевого пузыря любезно предоставлены Национальным медицинским исследовательским центром радиологии Министерства здравоохранения Российской Федерации. Плазму крови здоровых доноров получали по стандартному протоколу из проб крови, взятой у сотрудников с их согласия в медицинской лаборатории.

Полученные нами ранее библиотеки последовательностей, кодирующих нанотела [9], использовали при проведении новых процедур селекции с помощью модифицированного метода фагового дисплея как описано ранее [7–9]. В качестве антигенов-мишеней использовали коммерческие препараты holo-Transferrin human (holo-Tf) и apo-Transferrin human (apo-Tf) фирмы Sigma-Aldrich (США). Исходно отобранные последовательности однодоменных антител были переклонированы и отформатированы, после чего нанотела нарабатывали в периплазме бактерий, выделяли и очищали. Выделенные нанотела охарактеризованы с помощью электрофоретического и иммуноферментного анализа (ИФА) [7–9]. В ИФА для финальной детекции связавшегося конъюгата вторичных антител к HA-тагу c пероксидазой использовали реагент 1-Step Ultra TMB-ELISA (Thermo Scientific, США), добавляли 2 М серной кислоты и измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм. Получаемые в результате адаптационного переклонирования нанотела содержат на С-конце длинную линкерную последовательность (28 аминокислотных остатков длинного варианта шарнирного участка неканонического верблюжьего антитела), после которой идут два пептидных фрагмента: фрагмент из 9 аминокислот YPYDVPDYA (HA-tag) и последовательность из шести остатков гистидина (His-tag). Линкерный линейный участок содержит четыре удобно расположенных и хорошо доступных остатка лизина. По этим остаткам очень удобно проводить химические реакции пришивать другие молекулы, в том числе иммобилизовать нанотело на BrCN-сефарозе. Нанотела пришивали к CNBr-активированной сефарозе 4В (GE Healthcare Life Sciences, США) согласно рекомендациям производителя и как описано ранее [8, 9]. Таким образом получали новые иммуносорбенты (иммуноаффинные колонки), специфичность которых определялась свойствами иммобилизованного нанотела. Иммуносорбенты с иммобилизованными нанотелами использовали для выделения связываемых белков как описано ранее [8, 9].

Константы связывания нанотел с каждой из форм трансферрина (holo-Tf и apo-Tf) в стандартном фосфатно-солевом буфере (PBS) pH 7.4 определяли на микрокалориметре MicroCal PEAQ-ITC (Malvern, Швейцария), используя прилагаемую к прибору программу (MicroCal PEAQ-ITC Analysis Software) в Центре коллективного пользования ИБГ РАН. Модель подгонки – два сайта последовательного связывания – однозначно следовала из получаемых данных.

Для электрофоретического анализа белков отбирали аликвоты элюатов и анализировали в 5–19% градиентном SDS-полиакриламидном геле по Лэммли. Использовали прибор MiniProtean 3 (Bio-Rad, США), источник питания – Эльф-4 («ДНК-Технология», Россия). В качестве белкового маркера использовали Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific, США).

«Нативный» полиакриламидный гель-электрофорез, разработанный Новаковским и соавт. [11], удалось адаптировать для эффективного разделения holo-Tf и apo-Tf (в модификации, представленной на интернет-странице BraunLab – https://braunlab.de/?page_id=176). Использовали 10% разделяющий и 4% концентрирующий гели. Образцы для анализа готовили, добавляя к ним ×4 буфер для нанесения, содержащий 400 мM Tрис-HCl, 600 мM Tрис-base, 0.075% Coomasie G-250, 0.025% бромфенол, 40% глицерина. Только маркер прогревали перед нанесением (в стандартном SDS-буфере по Лэммли). Электрофорез проводили при 150 В и охлаждении (+4°С). По окончании электрофореза гель отмывали в дистиллированной воде (3 раза по 5 мин), затем окрашивали белки в Imperial™ Protein Stain (Thermo Fisher Scientific).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Используя коммерчески доступные препараты трансферрина, нам удалось методом фагового дисплея отобрать из созданной нами ранее библиотеки кДНК-последовательностей нанотел [9] два заметно различающихся мажорных варианта высокоаффинных нанотел, которые обладали относительно разным сродством к holo-Tf и apo-Tf и, по-видимому, узнавали разные эпитопы трансферрина (рис. 1, табл. 1).

Рис. 1. Характеристика двух новых нанотел против трансферрина человека. А – иммунофлуоресцентный анализ связывания нанотелами aTf1 и aTf2 в разных разведениях иммобилизованного в лунке иммунологического планшета апотрансферрина (темный столбик) или голотрансферрина (светлый столбик). Значения оптической плотности OD450 (ось Y) соответствуют количеству связанных нанотел, приведены средние значения дубликатов с вариациями менее 5% (вычтено среднее фоновое значение ~0.06 контрольных лунок). Б – аминокислотные последовательности, выведенные из определенных секвенированием кДНК-последовательностей, двух нанотел к трансферрину человека. Подчеркнуты гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3. В CDR1 и CDR3 нанотела aTf2 выявляются остатки цистеина (выделены серым цветом)

Таблица 1. Определение констант связывания нанотел aTf-1 и aTf-2 c двумя формами трансферрина (holo-Tf и apo-Tf) в растворе при рН 7.4 с помощью микрокалориметра MicroCal PEAQ-ITC (Malvern)

*Модель подгонки: сайты последовательного связывания, количество сайтов – 2.

Если в ИФА разница в связывании разных форм трансферрина полученными нанотелами была лишь слабо заметна (рис. 1А), то в растворе (табл. 1) и в составе иммуносорбента (рис. 2А) эти нанотела работали неожиданно селективно. Нанотело aTf1 в растворе (РВS) при рН 7.4 с очень высокой аффинностью связывает holo-Tf и при этом в 100 раз слабее связывает apo-Tf. Интересно, что сходным образом с трансферрином взаимодействует рецептор TfR1 [4]. Другое нанотело, aTf2, в растворе связывает обе формы трансферрина, но, по-видимому, особенно хорошо – apo-Tf. Последовательности этих двух нанотел сильно отличаются (рис. 1Б). В случае aTf2 значительно увеличен CDR3 и имеется, по-видимому, дополнительная Cys-Cys-связь между СDR1 и CDR3. Оба варианта нанотел были адаптированы, наработаны в периплазме бактерий и очищены как описано ранее [7–9]. Адаптированные нанотела были иммобилизованы на CNBr-сефарозе [8, 9], в результате чего получили два новых иммуносорбента. Проверена специфичность связывания этих иммуносорбентов с коммерческими препаратами трансферринов (apo- и holo-).

Мы адаптировали и успешно использовали специальный вариант электрофореза в полиакриламидном геле без SDS для разделения железосвязанного и железонесвязанного трансферринов (рис. 2А). К нашему удивлению, в колоночном формате нанотело aTf2 практически не связывает holo-Tf и очень эффективно связывает apo-Tf. Нанотело aTf1, напротив, очень хорошо связывает holo-Tf и заметно слабее, чем aTf2, связывает очищенный препарат apo-Tf. Далее иммуносорбенты в колоночном формате параллельно использовали для тестирования потенциально возможных различий в относительной представленности связываемых форм трансферрина в норме и патологии. На рис. 2 представлены первые результаты такого тестирования. Можно видеть, что если в случае образцов плазмы крови здоровых доноров (образцы 1, 2 и 3) элюаты с обеих колонок содержат примерно равное количество трансферрина, то в случае образцов, полученных от онкологических больных (на продвинутых стадиях рака яичника, образцы 4–6), хорошо видно, что больше белка связывается, а затем элюируется в случае нанотел aTf2. Весьма похожая ситуация наблюдается при анализе трансферрина в моче больного с инвазивной формой рака мочевого пузыря (образец 7). У здоровых доноров содержание трансферрина в моче в десятки раз ниже, и, согласно нашим предварительным наблюдениям, мы не видим заметных различий в количествах трансферрина, связываемого иммуносорбентами. Таким образом, этот тест позволяет детектировать изменения в относительных количествах и доступности для связывания определенных эпитопов разных форм трансферрина с помощью нанотел, что потенциально может иметь диагностический потенциал, в том числе и для мониторинга онкологических заболеваний, но надежность и воспроизводимость предлагаемого теста нужно оценить на большем числе образцов.

Рис. 2. Специфичность связывания разных форм трансферрина нанотелами, пришитыми к сефарозе. А – использование гель-электрофореза в условиях, сохраняющих целостность комплекса трансферрина с ионами железа, для демонстрации селективного связывания разных форм трансферрина (apo-Tf и holo-Tf) иммобилизованными нанотелами (aTf1 или aTf2). На двух дорожках слева нанесены исходные трансферрины. Б – электрофоретическое фракционирование в 5–19% градиентном SDS-полиакриламидном геле белков крови (или мочи), связавшихся с иммуносорбентами в физиологических условиях и затем элюированных. Выявление количественных различий в представленности, по-видимому, разных по насыщению железом форм трансферрина (все формы трансферрина локализуются при данном электрофоретическом фракционировании в одной мажорной полосе) во фракциях трансферрина, выделенных параллельно с помощью двух иммуносорбентов, содержащих иммобилизованные нанотела aTf1 или aTf2, у здоровых доноров (образцы крови 1, 2 и 3) и у онкологических больных (стадия IV рака яичника – 4, 5, 6, или в моче больного мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря – 7). Обозначены размеры маркерных полос. Tf – трансферрин (коммерческий препарат – маркер)

Пока мы можем лишь предположить, что могут означать наблюдаемые эффекты. Иммуносорбент с нанотелом aTf2 позволяет селективно выделять apo-Tf. В норме это примерно 2/3 всего трансферрина, содержащегося в крови. Иммуносорбент с нанотелом aTf1 преимущественно связывает holo-Tf и часть (примерно половину) apo-Tf. Как результат, оба иммуносорбента связывают примерно 2/3 всего трансферрина плазмы крови (разного по составу). Известно, что раковые клетки особенно эффективно потребляют железо, что может приводить к дефициту железа в окружающих опухоль биологических жидкостях и относительному увеличению доли apo-Tf. С другой стороны, holo-Tf, в отличие от apo-Tf, очень эффективно связывается с рецептором TfR1 на поверхности клетки. Однако TfR1 выявляется и в свободном, внеклеточном виде (как растворимый sTfR1 [12]). Нельзя исключить, что при патологических процессах подобные взаимодействия holo-Tf–TfR1 могут экранировать часть holo-Tf от связывания с нанотелом aTf1. В совокупности, мы наблюдаем эффект заметного увеличения формы трансферрина, которую связывает нанотело aTf2, но не связывает или плохо связывает нанотело aTf1. Интерес представляет гипотеза, согласно которой связанное с экзосомами увеличение apo-Tf в биологической жидкости может быть следствием интенсивного потребления железа опухолевыми клетками.

В заключение отметим, что в данной работе нами получены новые однодоменные антитела и иммуносорбенты на их основе, которые по-разному связывают различающиеся по насыщенности железом формы трансферрина. Такая способность дифференциального связывания полученных иммуносорбентов позволяет наблюдать относительные изменения в представленности разных форм трансферрина, прямо или косвенно ассоциированные с онкологическими заболеваниями.

Работа поддержана грантами РФФИ (№ 19-015-00487) и РНФ (№ 20-14-00305). 

Об авторах

Сергей Владимирович Тиллиб

Автор, ответственный за переписку.
Email: tillib@genebiology.ru
Россия, 119334, Москва

Оксана Сергеевна Горяйнова

Email: tillib@genebiology.ru
Россия, 119334, Москва

Анастасия Мартиновна Сачко

Email: tillib@genebiology.ru
Россия, 119334, Москва

Татьяна Ильинична Иванова

Email: tillib@genebiology.ru
Россия, 119334, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Характеристика двух новых нанотел против трансферрина человека. А – иммунофлуоресцентный анализ связывания нанотелами aTf1 и aTf2 в разных разведениях иммобилизованного в лунке иммунологического планшета апотрансферрина (темный столбик) или голотрансферрина (светлый столбик). Значения оптической плотности OD450 (ось Y) соответствуют количеству связанных нанотел, приведены средние значения дубликатов с вариациями менее 5% (вычтено среднее фоновое значение ~0.06 контрольных лунок). Б – аминокислотные последовательности, выведенные из определенных секвенированием кДНК-последовательностей, двух нанотел к трансферрину человека. Подчеркнуты гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3. В CDR1 и CDR3 нанотела aTf2 выявляются остатки цистеина (выделены серым цветом)

Скачать (284KB)

Метаданные

3. Рис. 2. Специфичность связывания разных форм трансферрина нанотелами, пришитыми к сефарозе. А – использование гель-электрофореза в условиях, сохраняющих целостность комплекса трансферрина с ионами железа, для демонстрации селективного связывания разных форм трансферрина (apo-Tf и holo-Tf) иммобилизованными нанотелами (aTf1 или aTf2). На двух дорожках слева нанесены исходные трансферрины. Б – электрофоретическое фракционирование в 5–19% градиентном SDS-полиакриламидном геле белков крови (или мочи), связавшихся с иммуносорбентами в физиологических условиях и затем элюированных. Выявление количественных различий в представленности, по-видимому, разных по насыщению железом форм трансферрина (все формы трансферрина локализуются при данном электрофоретическом фракционировании в одной мажорной полосе) во фракциях трансферрина, выделенных параллельно с помощью двух иммуносорбентов, содержащих иммобилизованные нанотела aTf1 или aTf2, у здоровых доноров (образцы крови 1, 2 и 3) и у онкологических больных (стадия IV рака яичника – 4, 5, 6, или в моче больного мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря – 7). Обозначены размеры маркерных полос. Tf – трансферрин (коммерческий препарат – маркер)

Скачать (404KB)

Метаданные