Анализ уровней TREС и KREC в образцах сухой крови новорожденных разного гестационного возраста и веса

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВОИ – врожденные ошибки иммунитета; ПИД – первичный иммунодефицит; ТКИН – тяжелая комбинированная иммунная недостаточность.

ВВЕДЕНИЕ

Врожденные ошибки иммунитета (ВОИ), известные как первичные иммунодефициты, представляют собой группу генетически детерминированных заболеваний, которые проявляются в разнообразных дефектах развития или функции иммунной системы. В 2019 году Международным союзом иммунологических обществ (IUIS) классифицировано и перечислено более 450 отдельных нозологических ВОИ [1]. Благодаря успехам в понимании патогенетических основ и совершенствованию методов лабораторной диагностики удалось поставить клинический диагноз большому числу пациентов, подтвержденный результатами молекулярно-генетических исследований. Распространенность ВОИ в настоящее время составляет 1.27 на 10 000 случаев [2, 3].

V(D)J-рекомбинация – одно из наиважнейших событий адекватно реагирующей иммунной системы, в процессе которой происходит образование разнообразных и функциональных репертуаров Т- и B-клеточных рецепторов (TCR и BCR соответственно), а также антител. Эти процессы – важные этапы становления адаптивного иммунитета [4], в которых важную роль играют рекомбиназы RAG1 и RAG2, катализирующие процесс реаранжировки фрагментов ДНК генов Т-клеточного рецептора при созревании Т-клеток и в ходе развития В-клеточного ответа на этапе подбора вариабельных цепей иммуноглобулинов [5].

Эксцизионные рекомбинантные кольца Т-клеточного рецептора (T-cell Receptor Excision Circle, TREC) представляют собой кольцевые фрагменты ДНК, образующиеся при перестройке гена TCR в тимоцитах. TREC транспортируются в виде эписомальной ДНК из ядра в цитоплазму уже самостоятельных, хотя еще наивных Т-клеток, где они и остаются, не включаясь в процессы репликации во время митоза. В результате концентрация молекул TREC отражает содержание именно наивных Т-лимфоцитов, что, безусловно, является важным диагностическим критерием [6–8]. Во время реаранжировки гена BCR в наивных В-клетках образуются сходные с TREC двунитевые кольцевые ДНК – фрагменты рекомбинации генов каппа-цепей иммуноглобулинов (Kappa-deleting Recombination Excision Circle – KREC) [9]. KREC, образующийся в процессе реаранжировки интрона RSS-K в локусе IGK, используется для оценки неогенеза В-клеток из костного мозга [10, 11]. И TREC, и KREC нерепликативны и стабильны, их количество не изменяется во время пролиферации клеток, например, в процессе клональной экспансии [12, 13]. Как результат, определение количества молекул TREC и KREC широко используется для оценки состояния тимуса и костного мозга в различных физиологических и патологических состояниях. Значения уровней TREC и KREC в крови может служить критерием высокой диагностической значимости при различных иммунодефицитных состояниях. Разработан метод мультиплексной количественной ПЦР в реальном времени, позволяющий обнаруживать дефекты генерации Т- и В-клеток путем одновременного измерения количества копий TREC и KREC [14, 15]. Проведение массового скрининга на содержание TREC/KREC поможет отнести ребенка к группе риска по иммунологическому профилю уже в период новорожденности, что обеспечит повышение выживаемости детей с иммунозависимой патологией и снижение материальных затрат [16–18]. Этот анализ имеет и другие преимущества, включая высокую чувствительность, высокую пропускную способность, относительно низкую цену и возможность использования ДНК, выделенной из минимального объема образцов крови, собранных на Гатри-картах [6, 16, 19]. Это позволяет использовать молекулы TREC и KREC в качестве маркеров функциональности тимуса и костного мозга в различных клинических условиях, в частности, при врожденных ошибках иммунитета. Однако, чтобы говорить о характеристике пациентов с ВОИ, необходимо знать состояние данных маркеров иммунитета у здоровых индивидов, учитывая, в частности, половозрастные особенности каждого [20]. В настоящее время актуальным остается определение количественного содержания TREC и KREC в крови новорожденных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Образцы сухой крови

В исследование было включено 80 образцов сухой крови, полученных от условно здоровых (отсутствие отклонений по результатам массового неонатального скрининга и факта переливания крови) детей (40 мальчиков и 40 девочек), собранных на фильтры Perkin Elmer 226 Guthrie cards (Perkin Elmer Health Sciences, США). Гатри-карты до использования хранились при комнатной температуре в лаборатории неонатального скрининга ГАУЗ СО Клинико-диагностический центр «Охрана здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург).

Выделение ДНК

ДНК выделяли методом магнитной сорбции с помощью набора Magna Pure LC DNA Isolation Kit I из семи дисков сухой крови диаметром 3.2 мм (~20 мкл) на автоматической станции выделения нуклеиновых кислот Magna Pure LC 2.0 Instrument по стандартному протоколу DNA I Blood_Cells_High_Performance. Этап предварительной обработки образцов сухой крови включал лизис образцов вне прибора с использованием буфера, входящего в состав набора Magna Pure LC DNA Isolation Kit II (Tissue): к образцам сухой крови добавляли 260 мкл лизирующего буфера и 40 мкл протеиназы К, тщательно вортексировали и инкубировали при 65°С в течение 20 мин, периодически перемешивая содержимое пробирок, после чего инкубировали при 95°С в течение 10 мин (встряхивали на вортексе каждые 5 мин), охлаждали образцы до комнатной температуры, экстракт переносили в «картридж для внесения образцов» и загружали на борт станции.

ПЦР-анализ TREC и KREC

Количественное определение молекул TREC и KREC основано на использовании метода ПЦР в режиме регистрации флуоресцентного сигнала в реальном времени. Исследование проводили с помощью набора реагентов «Иммуно-БиТ» (АБВ-тест, Россия) на приборе CFX96 (Bio-Rad, США) согласно инструкции производителя. Рассчитывали количество молекул TREC и KREC в 10⁵ ядросодержащих клеток (лейкоцитов) относительно количества копий гена ALB по формуле:

$TREC \left(KREC\right)копий/({10}^5 лейкоцитов)=\frac{TREC\left(KREC\right){\displaystyle \frac{копий}{мл}}}{ALB{\displaystyle \frac{копий}{мл}}}\times 200 000$

Если количество копий гена ALB было меньше 10⁵ копий/мл, то результат считали невалидным, исследование повторяли, начиная с этапа выделения ДНК.

Статистические методы

Математическую обработку данных проводили с использованием пакетов статистических программ Microsoft Excel (Microsoft Office 365, США) и IBM SPSS Statistics, version 21 (IBM Corp., США). Нормальность распределения данных оценивали с использованием теста Шапиро–Уилка, для описательных характеристик использовали среднее арифметическое и стандартную ошибку среднего (m ± SE). В ходе анализа статистической значимости различий средних значений и наличия корреляционных взаимосвязей использовали Т-критерий Стьюдента для независимых выборок и коэффициент корреляции Пирсона (p) соответственно. Различия считали значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследование вошли 80 условно здоровых детей (40 мальчиков и 40 девочек), рожденных в Свердловской области в 2020 году на разных сроках гестации (рис. 1).

 

Рис. 1. Распределение группы условно здоровых детей по гестационному возрасту и весу при рождении

 

Гендерные различия в содержании TREC и KREC

Анализ содержания молекул ТRЕC и КRЕC в образцах сухой крови условно здоровых мальчиков и девочек не выявил статистически значимых различий (рис. 2), что соответствует результатам, полученным другими исследователями [21].

 

Рис. 2. Количество TREC (А) и KREC (Б) в группе условно здоровых девочек (Ж) и мальчиков (М). Примечание: здесь и далее – на диаграмме отображены: медиана, межквартильный (25-й и 75-й процентили) и максимальный размах (минимум, максимум) переменной

 

Количество TREC и KREC у недоношенных в разные гестационные сроки

На основе данных корреляционного анализа проведен статистический анализ с целью определения возможных вариаций количества молекул TREC и KREC, ассоциированных с разным гестационным возрастом новорожденных. Установлена статистически значимая положительная связь (ρ = 0.446 (p < 0.001)) между гестационным возрастом и количеством молекул TREC. Не обнаружено связей между возрастом ребенка и количеством молекул KREC – маркера наивных В-клеток (рис. 3).

 

Рис. 3. Количество молекул TREC (А) и KREC (Б) в образцах сухой крови условно здоровых детей в зависимости от гестационного возраста в раннем неонатальном периоде

 

Количество TREC и KREC у недоношенных с разной массой при рождении

Проанализирована также зависимость между количественным содержанием маркеров наивных Т- и В-лимфоцитов и весом новорожденных. Естественно, что с увеличением срока беременности развивается и плод. В соответствии с гестационным периодом развиваются все внутренние органы и, в частности, тимус. Тимогенные ткани по мере их роста и дифференцировки обогащаются предшественниками лимфоцитов, причем теми, которые уже смогли пройти рубеж двойной рекогнизации – позитивной и негативной селекции. Это выражается в положительной корреляционной зависимости (ρ = 0.413 (p < 0.001)) между массой ребенка при рождении и количеством молекул TREC, содержащихся в сухих образцах крови новорожденных. При этом подобной корреляционной зависимости между массой ребенка при рождении и количеством молекул KREC не выявлено (рис. 4).

 

Рис. 4. Количество молекул TREC (A) и KREC (Б) в образцах сухой крови условно здоровых детей в зависимости от веса при рождении

 

Анализ количества TREC и KREC у детей с разной степенью доношенности

Обнаружив положительную корреляцию между гестационным возрастом новорожденного и содержанием молекул TREC, мы решили оценить возможность значимых различий в количестве молекул TREC у детей с разной степенью доношенности. С этой целью было решено разделить новорожденных на четыре группы по степени доношенности: дети с экстремальной степенью недоношенности (<28 недель), дети с тяжелой недоношенностью (28–32 недели), дети со средней и легкой степенью недоношенности (33–38 недель) и доношенные новорожденные (39–41 неделя) (рис. 5, табл. 1).

 

Рис. 5. Количество молекул TREC в сухих образцах крови условно здоровых детей разной степени доношенности в раннем неонатальном периоде

 

Таблица 1. Количество молекул TREC и KREC (копий / 10⁵ лейкоцитов) в сухих образцах крови условно здоровых детей разной степени доношенности в раннем неонатальном периоде

Степень доношенности	Среднее	95% интервал	Стандартная ошибка среднего	MIN	MAX
TREC
Экстремальная недоношенность (<28 недель)	402.7	116.6–784.0	52.8	115.9	978.0
Глубокая недоношенность (28–32 недели)	611.1	271.0–917.9	52.5	261.4	1115.6
Недоношенность среднейи легкой степени (33–38 недель)	776.1	378.2–1405.5	76.5	263.6	1505.6
Доношенные (39–41 неделя)	723.9	406.1–1133.2	52.2	398.1	1174.0
КREC
	599.9	210.9–1103.5	34.9	162.8	1584.0

 

На рис. 5 видна тенденция к увеличению содержания маркера TREC во время роста и развития плода, однако статистически значимых отличий между степенью доношенности и содержанием TREC не выявлено. Поскольку не обнаружено статистически значимых зависимостей между количественным содержанием молекул KREC в сухих образцах крови с массой тела и гестационным возрастом детей с разной степенью доношенности, предложено не разделять детей на отдельные группы. В среднем в образце обнаруживалось 599.9 копий KREC на 10⁵ лейкоцитов (SE = 34.9), однако для практического использования более важно иметь представление о нижних границах полученных референсных интервалов. Наименьшее значение KREC в группе условно здоровых детей составило 162.8 копий/10⁵ лейкоцитов, нижняя граница 95% интервала составила 210.9 копии/10⁵ лейкоцитов (результаты описательной статистики представлены в табл. 1).

ОБСУЖДЕНИЕ

К настоящему времени проведено множество исследований TREC/KREC в различных возрастных группах, начиная с младенцев и детей более старшего возраста и заканчивая анализом взрослого населения. Основная цель большинства работ состояла в оценке изменений функциональной активности «наивного» иммунитета по мере взросления и старения организма [21–23]. Согласно результатам Douek и соавт., количество молекул TREC и KREC в образцах крови детей старшего возраста и взрослых было соответственно в 10 и 100 раз ниже, чем у здоровых доношенных новорожденных. Эти данные указывают на снижение тимической эффективности, опосредованной возрастным уменьшением функционально активной ткани тимуса [24]. Изучение пациентов с комбинированным вариабельным иммунодефицитом (ОВИН) и здоровых доноров контрольной группы выявило стабильность уровня KREC, тогда как уровни TREC снижались с увеличением возраста как у пациентов с иммунозависимой патологией, так и у лиц контрольной группы, что доказывает независимость снижения уровня маркеров наивных Т-клеток от заболевания и зависимость от возраста [23, 25–27]. Количество TREC и KREC может также снижаться в результате разбавления. В ходе активного иммунного ответа на этапе клеточной экспансии функционально активных клонов лимфоцитов происходит репликация только внутриядерной ДНК. Так как TREC и KREC являются эписомными молекулами, они остаются лишь в клетке-основателе, что и приводит к относительному снижению показателей [28]. Несмотря на многочисленные данные о возрастных изменениях Т- и В-клеточного иммунитета, не менее важно исследовать динамику содержания молекул TREC и KREC не только в раннем неонатальном периоде, но и на разных этапах развития плода. Это позволит оценить состояние иммунитета на разных «срезах» эмбрионального развития человека.

Основная цель нашей работы состояла в определении содержания молекул TREC и KREC в крови детей, родившихся в разные гестационные сроки. Однако для большей информативности было решено проанализировать гендерные различия в содержании маркеров наивных иммунокомпетентных клеток. Нами не выявлено значимых различий в содержании молекул TREC и KREC в образцах сухой крови мальчиков и девочек, что соответствует результатам, полученным другими исследователями [29, 30]. С другой стороны, в некоторых работах представлены результаты, указывающие на более высокое содержание TREC в крови лиц женского пола [31–33].

К настоящему времени опубликованы данные о взаимозависимости между весом ребенка и количеством TREC [34–36]. Недавно проведенное исследование образцов сухой крови недоношенных новорожденных выявило положительную связь между количеством копий TREC и KREC и массой тела при рождении [5]. В другой работе изучали зависимость не только между весом, но и сроками гестации на момент рождения. По результатам проведенного анализа новорожденных разделили на три группы – с очень низкой, низкой и нормальной массой тела при рождении [32]. Опубликованы также данные о существовании связи между состоянием иммунитета и ростом взрослых индивидов [36, 37].

Развитие всех внутренних органов, в частности тимуса, происходит в соответствии с гестационным периодом. Тимогенные ткани по мере роста и дифференцировки обогащаются предшественниками лимфоцитов, причем теми, которые уже смогли пройти рубеж двойного отбора – позитивной и негативной селекции. Это выражается в положительной корреляционной зависимости (ρ = 0.413 (p < 0.001)) между массой ребенка при рождении и количеством молекул TREC, содержащихся в образцах сухой крови новорожденных [21, 26, 27].

Мы также проанализировали зависимость между количественным содержанием маркеров В-лимфоцитов, гестационным возрастом и массой новорожденного, однако связь этих показателей не была статистически значимой. Эти результаты показывают, что количество KREC в сухом пятне крови ребенка с гестационным возрастом не менее 28 недель, соответствующее нормативным значениям, служит показателем правильного прохождения процесса созревания В-клеток в костном мозге. Известно, что пре-В-лимфоциты обнаруживаются в печени плода на 8 неделе беременности, где они уже начинают экспрессировать на своей поверхности молекулы иммуноглобулина класса М. Это свидетельствует о том, что уже на столь ранних этапах развития человека система гуморальных параметров иммунитета функционирует с высокой эффективностью, что, вероятно, проявляется в относительно высоком уровне молекул KREC, обнаруживаемых в сухих пятнах крови у детей, рожденных в разные сроки гестации [23, 27].

Врожденные ошибки иммунитета обычно не диагностируются до тех пор, пока не появятся клинические признаки, в основном такие, как хронические и рецидивирующие инфекции. Для постановки диагноза первичный иммунодефицит используют общий анализ крови, фенотипирование лимфоцитов, определение различных классов иммуноглобулинов, функциональные тесты иммунокомпетентных клеток и генетический анализ как возможность подтверждающей диагностики. Наиболее перспективными и важными в настоящее время являются функциональные тесты иммунокомпетентных клеток и генетический анализ. Анализ TREC и KREC – это быстрый и чувствительный инструмент для скрининга ТКИН и диагностики других ВОИ, особенно потому, что для выделения ДНК требуется лишь небольшой объем образца, что снижает риск причинения вреда младенцам. Зачастую непреодолимым барьером в лабораторной диагностике является невозможность взятия необходимого количества биологического материала. Свой вклад в разброс пороговых значений при осуществлении программ скрининга новорожденных в разных странах вносит использование разных протоколов анализа TREC и KREC в разных лабораториях. Свою роль могут играть также популяционные генетические различия. Поэтому полученные нами результаты определения интервалов TREC и KREC, учитывающих половозрастные характеристики пациентов, имеют немаловажное значение для диагностики ВОИ у детей.

Первичные иммунодефициты все еще продолжают рассматриваться как редкие болезни, хотя они и не относятся к орфанным. В 2019 году в России было зарегистрировано 2798 пациентов с врожденными ошибками иммунитета, из которых 60% – дети [38]. Внедрение программ массового скрининга новорожденных на основе определения TREC и KREC позволит значительно увеличить группу риска по ТКИН и другим тяжелым первичным иммунодефицитам, приводящим к летальным исходам в раннем возрасте. Ранняя диагностика обеспечит возможность своевременного применения патогенетически обоснованной терапии, включая радикальные трансплантационные технологии, в период окна возможностей до появления тяжелых клинических проявлений, что приведет не только к улучшению качества жизни пациентов с такой патологией и сохранению их жизни, но и позволит сократить финансово-экономические затраты на лечение и жизнеобеспечение пациентов [39–45].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты наших исследований позволяют утверждать, что срок беременности следует рассматривать как немаловажный фактор, влияющий на количественное содержание молекул TREC и KREC. Для интерпретации результатов скрининга новорожденных мы рассчитали референсные диапазоны этих параметров для разных гестационных групп. Кроме того, это позволит осуществлять мониторинг иммунных изменений Т- и В-клеток при проведении иммунотропной терапии, включая посттрансплантацинное наблюдение после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Ранняя диагностика и лечение важны при всех формах ВОИ. Использование метода количественной оценки маркеров Т- и В-клеточного иммунитета (TREC и KREC) сделало возможным разработку скрининговых программ по выявлению ТКИН и агаммаглобулинемии во многих странах мира. Однако остаются неохваченными другие группы ПИД, такие, как иммунодефициты с нормальным количеством периферических Т- и В-клеток, дефекты количества и функции фагоцитов, дефицит комплемента и заболевания, связанные с иммунной дисрегуляцией. Необходим дальнейший поиск эффективных маркеров патологии, разработка стратегий клеточной, генетической и функциональной диагностики, адаптация их к массовым программам диагностики различных первичных иммунодефицитов.

Данное исследование проведено в рамках проекта АААА-А21-121012090091-6 на базе Института иммунологии и физиологии УрО РАН.

Об авторах

Дмитрий Андреевич Черемохин

Институт иммунологии и физиологии УрО РАН; Клинико-диагностический центр «Охрана здоровья матери и ребенка»

Автор, ответственный за переписку.
Email: dimacheremokhin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3334-2221
SPIN-код: 3623-8672
Россия, 620049, Екатеринбург; 620041, Екатеринбург

Хайбер Шинвари

Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: dimacheremokhin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9800-2797
Россия, 620083, Екатеринбург

Светлана Степановна Дерябина

Институт иммунологии и физиологии УрО РАН; Клинико-диагностический центр «Охрана здоровья матери и ребенка»; Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: dimacheremokhin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5614-5944
SPIN-код: 6037-3221
Россия, 620049, Екатеринбург; 620041, Екатеринбург; 620083, Екатеринбург

Михаил Артемович Болков

Институт иммунологии и физиологии УрО РАН; Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: dimacheremokhin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2763-9907
SPIN-код: 4610-0275
Россия, 620049, Екатеринбург; 620083, Екатеринбург

Ирина Александровна Тузанкина

Институт иммунологии и физиологии УрО РАН; Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: dimacheremokhin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7496-0950
SPIN-код: 8480-3628
Россия, 620049, Екатеринбург; 620083, Екатеринбург

Дмитрий Анатольевич Кудлай

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет); ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России

Email: dimacheremokhin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1878-4467
SPIN-код: 4129-7880
Россия, 119991, Москва; 115522, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы