Получение нейтрализующих наноантител к стеблевому домену гемагглютинина вируса гриппа типа А

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Вирус гриппа ежегодно уносит порядка 650 000 жизней. В условиях прогрессирующей резистентности к противовирусным препаратам и сниженной эффективности вакцинации среди определенных групп населения возникает необходимость в новых подходах к терапии гриппозной инфекции. Представленная работа посвящена получению однодоменных антител (наноантител) к высококонсервативному стержневому домену гемагглютинина вируса гриппа типа А при помощи технологии фагового дисплея. В результате были отобраны два высокоаффинных клона наноантител, показавшие 100% нейтрализующую активность in vivo при заражении мышей летальными дозами вируса гриппа штаммов H1N1 и H5N2. Полученные данные указывают на возможность создания высокоэффективных препаратов на основе однодоменных антител для терапии гриппозной инфекции.

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НА – гемагглютинин; СД – стеблевой (стержневой) домен НА; HcAb – тяжелоцепочечные антитела представителей семейства Camelidae; VHH – вариабельный домен HcAb; ПЦР – полимеразная цепная реакция; ИФА – иммуноферментный анализ; EC50 – полумаксимальная эффективная концентрация; SPR – поверхностный плазмонный резонанс; LD50 – полулетальная доза; мАт – моноклональные антитела.

ВВЕДЕНИЕ

Грипп остается серьезной проблемой мирового здравоохранения, несмотря на доступность ежегодно обновляющихся вакцин и разработанные этиопатогенетические подходы к терапии этого инфекционного заболевания. Основным способом контроля гриппозной инфекции на сегодняшний день остается вакцинация. Специфическую профилактику дополняют противовирусные препараты, действующие как на сезонные, так и на пандемические штаммы вируса гриппа. Однако, принимая во внимание возрастающую лекарственную резистентность, сниженную эффективность вакцинации у определенных групп населения и короткое терапевтическое окно имеющихся противовирусных лекарственных средств, остро встает необходимость в препаратах нового типа для лечения инфекции, вызванной вирусом гриппа.

Эффективной стратегией в терапии гриппозной инфекции может быть получение антител, специфичных к высококонсервативным участкам вирусных белков. Гемагглютинин (НА) – один из главных белков оболочки вируса гриппа, находится на поверхности вириона в виде тримера, мономеры которого состоят из двух субъединиц: НА1 и НА2. Пространственно в НА выделяют апикальный глобулярный домен, включающий центральную часть субъединицы НА1, и дистальный стеблевой (стержневой) домен (СД), который сформирован субъединицей НА2, а также N- и C-концевыми участками субъединицы НА1 [1]. Подавляющее большинство антител в организме направлено на высокоиммуногенный участок вокруг рецепторсвязывающего сайта, расположенного в глобулярном домене, обеспечивая тем самым нейтрализацию вируса и оказывая одновременно с этим иммуноселективный прессинг, приводящий к возникновению эскейп-мутантов [2]. Такие антитела почти всегда штаммо- или подтип-специфичны. СД, напротив, менее иммуногенен, однако антитела к нему зачастую распознают несколько подтипов НА за счет высококонсервативной последовательности [2]. Таким образом, разработка антител к СД считается перспективным направлением в создании новых противовирусных препаратов.

Известные на данный момент мАт к СД обладают различным спектром реактивности: от связывания с подтипами НА внутри одной филогенетической группы [3–10] до распознавания НА среди обеих групп [11–21] и даже перекрестной активности между НА типа А и В [22]. Большинство этих антител узнают консервативные конформационные эпитопы в СД. Наряду с каноническими антителами, получены и однодоменные антитела (наноантитела, VHH) к СД [23, 24]. Все описанные наноантитела обладают перекрестной реактивностью и нейтрализуют вирусы внутри одной филогенетической группы НА или в результате создания мультиспецифичных конструкций приобретают способность нейтрализовать вирусы гриппа как типа А, так и типа В.

VHH – это вариабельный домен «тяжелоцепочечных» иммуноглобулинов, HcAb, обнаруженных у представителей семейства Camelidae [25]. Несмотря на свой небольшой размер (12–15 кДа), VHH не уступают в аффинности и специфичности каноническим антителам. Благодаря уникальной стабильности в широком диапазоне температур, в присутствии различных детергентов, а также устойчивости к протеолитическому расщеплению, однодоменные антитела можно доставлять в организм перорально или ингаляционно [26, 27]. Наноантитела нашли применение в терапии онкологических, гематологических, инфекционных и аутоиммунных заболеваний, некоторые препараты проходят клинические испытания или одобрены к применению в европейских странах и США [28, 29].

В данной работе получен стабилизированный тример СД для сохранения конформационных эпитопов нейтрализующих антител, с помощью технологии фагового дисплея отобраны вируснейтрализующие VHH, специфичные к СД. Выбраны два высокоаффинных клона, показавших 100% нейтрализующую активность in vivo в модели летальной инфекции на вирусах гриппа H1N1 и H5N2. Таким образом, установлена возможность получения высокоэффективных препаратов на основе VHH для терапии гриппозной инфекции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Биоматериалы

В работе использованы высокоочищенные препараты рекомбинантных белков: полноразмерные НА вируса гриппа типа А H3N2 (A/Switzerland/9715293/2013) (Sino Biological, Китай), H1N1 (A/California/04/2009) (Sino Biological). Эндонуклеазы рестрикции, Т4-ДНК-лигаза и щелочная фосфатаза (FastAP) получены от фирм NEB (США) и Thermo Fisher Scientific (США). Для иммунизации альпака использовали гриппозную трехвалентную инактивированную полимер-субъединичную вакцину Гриппол® плюс («НПО ПЕТРОВАКС ФАРМ», Россия).

Получение СД НА

Нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности СД вируса гриппа штамма H1N1 (A/Brisbane/59/2007) (HA stem) #4900, приведенной в работе Impagliazzo A. и соавт. [30], синтезировали в ЗАО «Евроген» (Россия), клонировали в плазмиду pShuttle-CMV (Stratagene, США) и получали плазмиду pShuttle-CMV-HAstem. Далее культуру клеток CHO-S (Thermo Fisher Scientific) транзиентно трансфицировали плазмидой pShuttle-CMV-HAstem с использованием системы CHO Gro (Mirus Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера (125 об/мин, 5% СО2, 80% влажности, 37°C), спустя 24 ч температуру снижали до 32°C и продолжали культивировать в течение 10 дней. Начиная с 3-го дня добавляли подпитки Cell boosts 7a (2%), 7b (0.2%) (HyClone, США) и 0.5% CHO Bioreactor Feed (Sigma, США) 1 раз в день. По истечении 10 дней культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000 g. СД HA очищали аффинной хроматографией на системе AKTA start (Cytiva Швеция), используя колонки HisTrap 1 мл (Cytiva) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера на 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ натрия хлорид проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva).

Иммунизация животного

Альпака (Vicugna pacos) иммунизировали 5 раз с интервалом 14 дней между первой и второй инъекцией и 10 дней между последующими. При проведении первичной иммунизации животному подкожно вводили препарат, состоящий из вакцины Гриппол® плюс (100 мкг) и полного адъюванта Фрейнда (Sigma), смешиваемых в соотношении 1 : 1 до получения гомогенной суспензии. В последующие четыре инъекции вводили Гриппол® плюс в сочетании с неполным адъювантом Фрейнда (Sigma). До иммунизации и через 7 дней после пятой инъекции у животного отбирали небольшое количество крови (5–10 мл) в качестве контроля для определения концентрации специфичных антител. Спустя неделю после последней инъекции 50 мл венозной крови отбирали в стерильный контейнер с антикоагулянтом литий-гепарин. Фракцию мононуклеарных клеток периферической крови получали по стандартному протоколу путем центрифугирования с раствором фиколла плотностью 1.077 («ПанЭко», Россия).

Получение фаговой библиотеки, селекция индивидуальных клонов

Выделение мРНК, ПЦР-амплификацию целевых фрагментов ДНК и конструирование библиотеки проводили по стандартным протоколам [31, 32]. Вариабельные домены тяжелоцепочечных иммуноглобулинов из В-лимфоцитов периферической крови иммунизированного альпака клонировали в фагмидный вектор pHEN1. Используемые в двухстадийной ПЦР специфические праймеры содержали сайты рестрикции SfiI и NotI на 5′- и 3′-конце соответственно. Амплифицированные последовательности VHH клонировали по указанным сайтам рестрикции с помощью эндонуклеаз SfiI, NotI и ДНК-лигазы фага T4. Полученными рекомбинантными плазмидными ДНК методом электропорации трансформировали электрокомпетентные клетки Escherichia coli штамм TG1. В результате получили базовую библиотеку наноантител, сложность которой составила 3 × 106 индивидуальных клонов.

Фаги, несущие специфичные к СД наноантитела, отобраны с помощью трех раундов селекции (паннинга). В качестве антигена использовали СД НА H1N1 (A/Brisbane/59/2007) в количестве 5 мкг в первом раунде и 1 мкг в двух последующих. Из индивидуальных клонов, отобранных в процессе селекции, выделяли плазмидную ДНК и секвенировали последовательности фрагментов VHH.

Экспрессия и очистка наноантител

Для экспрессии кандидатных наноантител рекомбинантную фагмидную ДНК, выделенную из отобранных индивидуальных клонов клеток TG1, трансформировали в E. coli штамм BL21. Бактериальные клетки наращивали в течение ночи в жидкой среде при 30°С, осаждали центрифугированием и лизировали BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen, США) согласно протоколу производителя. Наноантитела очищали на кобальтовой смоле TALON Superflow (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Швеция) с последующим переводом элюированной фракции в фосфатно-солевой буфер. Наличие экспрессии и ее уровень оценивали с использованием электрофореза в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Электрофорез белков

Электрофорез белков проводили в 12% полиакриламидном геле (Bio-Rad, США) в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли. При электрофорезе в неденатурирующих невосстанавливающих условиях образцы смешивали с буфером для нанесения проб без 2-меркаптоэтанола и, не нагревая, вносили в лунки геля. В качестве стандарта молекулярных масс использовали Precision Plus Protein™ (Bio-Rad).

Иммуноферментный анализ

Для измерения антител в сыворотке крови альпака образцы сыворотки добавляли в лунки планшета с иммобилизованными в стандартном 0.05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9.6) рекомбинантными НА или СД (1 мкг/мл), затем обрабатывали поликлональными антителами козы к IgG ламы, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (Bethyl Laboratories, США). Обогащение библиотек оценивали с использованием меченных пероксидазой хрена антител к фагу M13 (Sino Biological). При проведении непрямого анализа с наноантителами использовали вторичные поликлональные HRP-антитела к эпитопу c-myc (Abcam, Великобритания). В качестве субстрата для пероксидазы хрена использовали раствор тетраметилбензидина (TMB) (Bio-Rad). Оптическую плотность измеряли на длине волны 450 нм с помощью мультимодального ридера Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific).

Поверхностный плазмонный резонанс (SPR)

Аффинность и кинетику взаимодействия наноантител и антигена (СД НА) определяли на четырехканальном оптическом биосенсоре Biacore 3000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Рекомбинантный белок СД (20 мкг/мл в 10 мМ ацетатном буфере рН 4.5) ковалентно иммобилизовали на поверхности оптического чипа CM5 с помощью набора Amine Coupling Kit (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Уровень иммобилизации лиганда в рабочем канале оптического биосенсора составил 1800 RU.

Кинетические параметры анализировали путем инжекции пятикратных разведений образцов наноантител в диапазоне концентраций от 267 до 0 нМ через контрольный (без иммобилизованного лиганда) и рабочий каналы в течение 3 мин с постоянной скоростью потока 15 мкл/мин. В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 мM EDTA, 0.005% Surfactant P20). Время диссоциации после нанесения образцов составляло 10 мин. После каждого измерения проводили регенерацию поверхности чипа с помощью инжекции буфера, содержащего 100 мМ Tрис-HCl pH 1.3, в течение 30 с при скорости потока 30 мкл/мин. Все измерения проводили при температуре 25°С не менее 2 раз.

Значения равновесных констант диссоциации и ассоциации (Kd и Ka), констант скорости образования (kon) и распада (koff) молекулярных комплексов рассчитывали с помощью программного обеспечения BIAEvaluation (GE Healthcare Bio-Sciences AB).

Оценка нейтрализующей способности VHH in vivo

Исследования выполняли на 6-недельных самках мышей линии BALB/c массой 18–20 г. Для заражения животных использовали вирусы гриппа A/Duck/mallard/Moscow/4970/2018 (H1N1) и A/Mallard duck/Pennsylvania/10218/84 (H5N2), адаптированные к мышам, любезно предоставленные Лабораторией молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ.

Животных разделяли на группы (опытные и контрольные) по пять особей в каждой и заражали интраназально смесью антител (200 мкг) и вируса (15 LD50), предварительно инкубированной в течение 1 ч при 37°С, в объеме 50 мкл/мышь (в случае опытных групп) или вирусом в дозе 15 LD50 в ФСБ (контрольные группы). За мышами наблюдали в течение 14 дней после инфицирования, ежедневно осматривали и взвешивали. Агонизирующих или потерявших более 25% от изначальной массы животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации. Нейтрализующее действие наноантител оценивали по выживаемости мышей и динамике изменения массы тела.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных выполняли с помощью программ Microsoft Excel и GraphPad Prism 7.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Стабилизированный тример СД НА

Мы использовали аминокислотную последовательность стабилизированного тримеризующегося СД НА штамма H1N1 (A/Brisbane/59/2007), опубликованную Impagliazzo A. и соавт. [30]. Для повышения уровня экспрессии СД НА последовательность сигнального пептида НА заменили последовательностью сигнального пептида щелочной фосфатазы SEAP. СД НА нарабатывали в клеточной линии CHO-S, способной обеспечивать высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка [33]. Препарат СД оптимальной чистоты получали, используя две стадии очистки: аффинную хроматографию и гель-фильтрацию. Тримеризацию СД подтверждали методом электрофореза в восстанавливающих денатурирующих (для визуализации мономерной структуры, молекулярная масса 37 кДа) и невосстанавливающих неденатурирующих условиях (для визуализации тримеризованной конструкции, молекулярная масса около 110 кДа) (рис. 1).

 

Рис. 1. Электрофоретический анализ СД в 12% полиакриламидном геле. 1 – неденатурирующие невосстанавливающие условия; 2 – денатурирующие восстанавливающие условия

 

Получение наноантител, специфичных к СД НА

Панель наноантител к СД НА получали путем иммунизации альпака V. pacos по схеме, представленной на рис. 2А. На 7-й день после последней инъекции у животного отбирали 50 мл крови, отделяли мононуклеарную фракцию, из которой выделяли суммарную РНК для приготовления иммунной библиотеки, а также отбирали сыворотку для оценки индукции гуморального иммунного ответа. Уровень сывороточных антител альпака был определен как для СД НА, так и для рекомбинантных НА (рис. 2Б). Титр антител к СД НА составил 1 : 12500. Выявлен высокий титр антител к НА Н1 (A/California/04/2009) и Н3 (A/Switzerland/9715293/2013): 1 : 204800 и 1 : 409600 соответственно. Эти результаты свидетельствуют о формировании выраженного гуморального ответа после пяти циклов иммунизации альпака гриппозной вакциной как к полноразмерным НА, так и непосредственно к СД.

 

Рис. 2. Схема иммунизации альпака вакциной Гриппол® плюс в сочетании с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) или неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) (А) и уровень антител к СД и полноразмерным НА в сыворотке альпака после 5-й иммунизации (Б)

 

Конструирование библиотеки наноантител и последующую селекцию методом фагового дисплея проводили как описано ранее [34]. Размер библиотеки составил 3 × 106 индивидуальных клонов. Все 30 колоний, случайным образом выбранных и проанализированных в ПЦР на наличие гена фрагмента VHH, содержали вставку. Фаговую библиотеку подвергли трем раундам селекции, результаты каждого раунда контролировали методом поликлонального фагового ИФА (рис. 3А). По окончании паннинга 66 индивидуальных клонов, имеющих OD450 нм в ИФА выше 0.25, были секвенированы по Сэнгеру (рис. 3Б). По результатам анализа участков CDR3 эти клоны объединены в восемь групп, из которых на основании специфической активности в моноклональном фаговом ИФА и уровня экспрессии белка для дальнейшей работы отобрали четыре клона (B6.2, 2F2, H1.2 и G2.3).

 

Рис. 3. Результаты поликлонального фагового ИФА, показывающие связывание фагов после различных раундов селекции с СД и полноразмерными НА (А), и результаты скрининга отобранных случайным образом моноклонов в фаговом ИФА (Б)

 

In vitro характеристика наноантител

Специфическую активность наноантител подтверждали методом непрямого ИФА, кинетику взаимодействия с СД и аффинность исследовали с помощью SPR-анализа. В качестве антигена в ИФА использовали полноразмерные НА вирусов гриппа H1N1 (A/California/04/2009), Н3N2 (A/Switzerland/9715293/2013), а также СД НА (рис. 4); для детекции VHH использовали конъюгированные с HRP поликлональные антитела к метке c-myc. Для клонов 2F2, H1.2 и G2.3 на основании зависимости ОD от концентрации антитела построены калибровочные кривые и определены значения EC50. Значения EC50 для СД и клонов H1.2, G2.3 и 2F2 составили 0.7, 7.4 и 13.8 нМ соответственно, а для НА H1 – 0.6, 5.9 и 3.0 нМ. На НА Н3 отобранные антитела не давали выраженного сигнала.

 

Рис. 4. Результаты титрования отобранных клонов VHH в ИФА на СД НА (А) и на полноразмерном НА вируса гриппа H1N1 (A/California/04/2009) (Б)

 

Аффинность клонов 2F2, H1.2 и G2.3 и СД исследовали на приборе Biacore 3000 методом SPR. С этой целью рекомбинантный белок ковалентно иммобилизовали на поверхности оптического чипа типа CM5. Константы ассоциации и диссоциации определяли на основании анализа сенсограмм в программном обеспечении BIAEvaluation. Полученные результаты приведены в таблице.

 

Параметры кинетики взаимодействия VHH и СД, определенные методом SPR

Клон

kon (1/Ms)

koff (1/s)

Rmax (RU)

Ka (1/M)

Kd (M)

Chi2

2F2

3.95 × 105

6.17 × 10-3

51.7

6.38 × 107

1.57 × 10-8

1.53

H1.2

9.87 × 105

3.6 × 10-4

139

2.74 × 109

3.65 × 10-10

1.59

G2.3

3.68 × 105

2.04 × 10-4

154

1.8 × 109

5.54 × 10-10

1.39

 

Нейтрализация в экспериментах in vivo

Нейтрализующие свойства наноантител исследовали на адаптированном к мышам вирусе гриппа H1N1 (A/Duck/mallard/Moscow/4970/2018). С этой целью мышей интраназально заражали высокими летальными дозами (15 LD50) указанного вирулентного штамма вируса гриппа H1N1, предварительно инкубированного с VHH H1.2 или G2.3. Выживаемость животных в опытных группах составила 100% при 100% гибели мышей контрольной группы (рис. 5А), что говорит об эффективной нейтрализации вируса H1N1 обоими наноантителами. Нейтрализующие свойства антител in vivo дополнительно подтверждаются незначительным снижением массы тела мышей и быстрым ее восстановлением в опытных группах по сравнению с контрольной (рис. 5Б).

 

Рис. 5. Динамика выживаемости (А) и массы тела (Б) мышей после интраназального заражения H1N1 (A/Duck/mallard/Moscow/4970/2018) в дозе 15 LD50, смешанного с VHH. Различия между выживаемостью в опытных и контрольной группах статистически значимы (p < 0.0005)

 

Исследование in vivo нейтрализации вируса гриппа штамма H5N2 (A/Mallard duck/Pennsylvania/10218/84) проводили аналогично нейтрализации с вирусом H1N1. Полученные данные свидетельствуют о 100% нейтрализующей активности наноантител в отношении вируса H5N2 (рис. 6).

 

Рис. 6. Динамика выживаемости (А) и массы тела (Б) мышей после интраназального заражения H5N2 (A/Mallard duck/Pennsylvania/10218/84) в дозе 15 LD50, смешанного с VHH. Различия между выживаемостью в опытных и контрольной группах статистически значимы (p < 0.0002)

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Преимущества наноантител перед каноническими мАт делают их привлекательной платформой для разработки терапевтических средств, в том числе противовирусных. Благодаря уникальной структуре вариабельного домена, VHH могут взаимодействовать с труднодоступными эпитопами, характерными для поверхности вирусов [35, 36]. Меньший размер футпринта (отпечатка) VHH по сравнению с каноническими мАт, которые связываются с более крупными и плоскими эпитопами, может задать более высокий генетический барьер для возникновения эскейп-мутаций. Кроме того, высокая стабильность и растворимость наноантител крайне важны при создании эффективной лекарственной формы для доставки непосредственно в очаг инфекции – легкие.

Большинство мАт, способных нейтрализовать вирусы гриппа разных подтипов, узнают консервативные конформационные эпитопы в СД НА, однако при природной инфекции или иммунизации полноразмерным НА они труднодоступны, вследствие экспонирования преимущественно вариабельных эпитопов глобулярного домена НА. Таким образом, необходимо получить СД в оптимальной стабилизированной конформации с сохранением эпитопов нейтрализующих мАт. В работе Impagliazzo A. и соавт. [30] сделано несколько вариантов стабилизированного тримера СД НА, из которых #4900 способен индуцировать выработку антител и обеспечивать защиту мышей против различных подтипов вируса гриппа А. На основании последовательности СД #4900 нами получен препарат, тримеризованная структура которого подтверждена с помощью электрофореза, использованный для селекции высокоаффинных антител, способных защищать мышей от инфекции, вызываемой различными подтипами вируса гриппа А.

Нами получены наноантитела, специфичные к СД НА, потенциально узнающие консервативные конформационные эпитопы и обладающие нейтрализующей активностью в отношении разных подтипов вируса гриппа А. В ходе селекции отобраны четыре индивидуальных клона (B6.2, 2F2, H1.2 и G2.3), охарактеризованные по уровню специфической активности в отношении СД и полноразмерного НА подтипов H1 и Н3 в непрямом ИФА, аффинности в SPR-анализе и нейтрализации in vivo.

Результаты ИФА показали, что с наибольшей интенсивностью с СД и полноразмерным НА H1 реагируют клоны H1.2 и G2.3. Сравнимый сигнал наблюдался при взаимодействии клона 2F2 и НА H1, однако на СД он был ниже, чем у H1.2 и G2.3. Клон B6.2 даже в высоких концентрациях слабо реагировал с указанными антигенами (рис. 4). На этом этапе клон B6.2, показавший самый низкий титр в ИФА и, предположительно, обладающий наименьшей аффинностью, исключили из дальнейшей работы. По данным ИФА, отобранные нами клоны не связываются с НА Н3, тем не менее, многие существующие мАт широкого спектра нейтрализуют НА только внутри одной филогенетической группы. Помимо эволюционного родства, эти группы объединяют общие консервативные эпитопы кросс-нейтрализующих антител в гидрофобном кармане СД [4]. Связывающие этот антигенный сайт мАт преимущественно нейтрализуют НА одной группы и либо не нейтрализуют подтипы другой, либо делают это с меньшей эффективностью.

Значения Kd коррелируют со значениями, полученными в непрямом ИФА: самые низкие константы диссоциации (наномолярный диапазон) характерны для антител H1.2 и G2.3. Несмотря на сопоставимую с этими клонами EC50 в ИФА на H1N1, клон 2F2 показал существенно более низкую специфическую активность и аффинность на СД. На основании проведенных in vitro экспериментов для характеристики антител in vivo были отобраны клоны H1.2 и G2.3, обладающие наибольшей аффинностью (Kd 3.65 × 10-10 и 5.54 × 10-10 М соответственно).

Проверка нейтрализующих свойств наноантител H1.2 и G2.3 против летальной дозы адаптированного к мышам вируса гриппа H1N1 (A/Duck/mallard/Moscow/4970/2018) показала 100% защиту мышей.

Основываясь на филогенетической близости вирусов с НА подтипов Н1 и Н5 и консервативности аминокислотной последовательности СД, предположили, что отобранные антитела могут связываться и нейтрализовать in vivo штаммы вируса гриппа с НА подтипа Н5 [37]. Для эксперимента на животных выбран адаптированный вирус гриппа H5N2 (A/Mallard duck/Pennsylvania/10218/84). Предварительно последовательности СД НА вирусов гриппа, использованных в экспериментах на животных, анализировали в программном обеспечении Geneious Prime. Степень гомологии этих последовательностей составила 83%. Показано, что оба наноантитела, H1.2 и G2.3, обладают 100% нейтрализующей активностью и в отношении вируса гриппа с НА подтипа Н5. Такие результаты могут быть обусловлены высокой степенью гомологии между СД НА выбранных штаммов и, как следствие, сохранением сайтов связывания VHH G2.3 и H1.2.

Полученные нами новые однодоменные антитела с крайне высокой аффинностью связываются и эффективно нейтрализуют вирусы с НА подтипов Н1 и Н5, однако возможно дальнейшее увеличение связывающей и нейтрализующей способности VHH путем создания бивалентных или биспецифических конструкций с Fc-фрагментом. Таким образом, аффинность повышается за счет увеличения авидности и добавляются эффекторные функции, такие, как антителозависимая клеточная цитотоксичность, антителозависимый фагоцитоз и опосредованная антителом комплементзависимая цитотоксичность, критически важные для терминации гриппозной инфекции.

Антитела, способные нейтрализовать НА, относящиеся к первой филогенетической группе, имеют высокую значимость, так как в эту группу входят также вирусы с пандемическим потенциалом. Полученные нами VHH показали нейтрализующую активность в отношении вирусов, несущих НА подтипов Н1 и Н5. Наличие или отсутствие нейтрализующей активности в отношении других штаммов вируса гриппа станет предметом дальнейшего изучения.

ВЫВОДЫ

Нами получен стабилизированный тример СД HA H1 (A/Brisbane/59/2007), содержащий конформационные эпитопы мАт, обладающих широким спектром нейтрализующей активности.

Идентифицированные нами новые наноантитела H1.2 и G2.3 специфически связываются с СД с константами диссоциации, превосходящими многие известные мономерные VHH, а также эффективно нейтрализуют вирусы гриппа H1N1 и H5N2, относящиеся к первой филогенетической группе НА. Получены конструкции указанных антител с Fc-фрагментом, которые будут использованы для изучения протективности в отношении различных штаммов вирусов гриппа типа А in vivo.

Исследование выполнено в рамках Государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации № 121031800132-4.

×

Об авторах

Дарья Владимировна Воронина

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: daryavoronin2009@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6629-744X

младший научный сотрудник лаборатории иммунобиотехнологии

Россия, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18

Дмитрий Викторович Щебляков

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: sdmitryv@yahoo.com
Россия, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18

Ильяс Булатович Есмагамбетов

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: esmagambetovib@gmail.com
Россия, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18

Артем Алексеевич Деркаев

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: derkaev.a@yandex.ru
Россия, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18

Ольга Попова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: olga.popova31@yandex.ru
Россия, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18

Дмитрий Николаевич Щербинин

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: dim284@inbox.ru
Россия, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18

Список литературы

  1. Gamblin S.J., Skehel J.J. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 37. P. 28403–28409.
  2. Krammer F., Palese P. // Nat. Rev. Drug Discov. 2015. V. 14. № 3. P. 167–182.
  3. Ekiert D.C., Friesen R.H.E., Bhabha G., Kwaks T., Jongeneelen M., Yu W., Ophorst C., Cox F., Korse H.J., Brandenburg B., et al. // Science. 2011. V. 333. № 6044. P. 843–850.
  4. Throsby M., van den Brink E., Jongeneelen M., Poon L.L.M., Alard P., Cornelissen L., Bakker A., Cox F., van Deventer E., Guan Y., Cinatl J., et al. // PLoS One. 2008. V. 3. № 12. P. e3942.
  5. Sui J., Hwang W.C., Perez S., Wei G., Aird D., Chen L.M., Santelli E., Stec B., Cadwell G., Ali M., et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. V. 16. № 3. P. 265–273.
  6. Wyrzucki A., Dreyfus C., Kohler I., Steck M., Wilson I.A., Hangartner L. // J. Virol. 2014. V. 88. № 12. P. 7083–7092.
  7. Corti D., Suguitan A.L., Pinna D., Silacci C., Fernandez-Rodriguez B.M., Vanzetta F., Santos C., Luke C.J., Torres-Velez F.J., Temperton N.J., et al. // J. Clin. Invest. 2010. V. 120. № 5. P. 1663–1673.
  8. de Marco D., Clementi N., Mancini N., Solforosi L., Moreno G.J., Sun X., Tumpey T.M., Gubareva L.V., Mishin V., Clementi M., et al. // PLoS One. 2012. V. 7. № 4. P. 1–9.
  9. Kashyap A.K., Steel J., Rubrum A., Estelles A., Briante R., Ilyushina N.A., Xu L., Swale R.E., Faynboym A.M., Foreman P.K., et al. // PLoS Pathog. 2010. V. 6. № 7. P. 1–7.
  10. Friesen R.H.E., Lee P.S., Stoop E.J.M., Hoffman R.M.B., Ekiert D.C., Bhabha G., Yu W., Juraszek J., Koudstaal W., Jongeneelen M., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111. № 1. P. 445–450.
  11. Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., et al. // Science. 2011. V. 333. № 6044. P. 850–856.
  12. Nakamura G., Chai N., Park S., Chiang N., Lin Z., Chiu H., Fong R., Yan D., Kim J., Zhang J., et al. // Cell Host Microbe. 2013. V. 14. № 1. P. 93–103.
  13. Wu Y., Cho M., Shore D., Song M., Choi J., Jiang T., Deng Y.Q., Bourgeois M., Almli L., Yang H., et al. // Nat. Commun. 2015. V. 6. P. 7708.
  14. Tharakaraman K., Subramanian V., Viswanathan K., Sloan S., Yen H.L., Barnard D.L., Leung Y.H., Szretter K.J., Koch T.J., Delaney J.C., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. V. 112. № 35. P. 10890–10895.
  15. Wyrzucki A., Bianchi M., Kohler I., Steck M., Hangartner L. // J. Virol. 2015. V. 89. № 6. P. 3136–3144.
  16. Hu W., Chen A., Miao Y., Xia S., Ling Z., Xu K., Wang T., Xu Y., Cui J., Wu H., et al. // Virology. 2013. V. 435. № 2. P. 320–328.
  17. Li G.M., Chiu C., Wrammert J., McCausland M., Andrews S.F., Zheng N.Y., Lee J.H., Huang M., Qu X., Edupuganti S., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. № 23. P. 9047–9052.
  18. Henry Dunand C.J., Leon P.E., Kaur K., Tan G.S., Zheng N.Y., Andrews S., Huang M., Qu X., Huang Y., Salgado-Ferrer M., et al. // J. Clin. Invest. 2015. V. 125. № 3. P. 1255–1268.
  19. Clementi N., de Marco D., Mancini N., Solforosi L., Moreno G.J., Gubareva L.V., et al. // PLoS One. 2011. V. 6. № 12. P. e28001.
  20. Kallewaard N.L., Corti D., Collins P.J., Neu U., McAuliffe J.M., Benjamin E., Wachter-Rosati L., Palmer-Hill F.J., Yuan A.Q., Walker P.A., et al. // Cell. 2016. V. 166. № 3. P. 596–608.
  21. Joyce M.G., Wheatley A.K., Thomas P.V., Chuang G.Y., Soto C., Bailer R.T., Druz A., Georgiev I.S., Gillespie R.A., Kanekiyo M., et al. // Cell. 2016. V. 166. № 3. P. 609–623.
  22. Dreyfus C., Laursen N.S., Kwaks T., Zuijdgeest D., Khayat R., Ekiert D.C., Lee J.H., Metlagel Z., Bujny M.V., Jongeneelen M., et al. // Science. 2012. V. 337. № 6100. P. 1343–1348.
  23. Laursen N.S., Friesen R.H.E., Zhu X., Jongeneelen M., Blokland S., Vermond J., van Eijgen A., Tang C., van Diepen H., Obmolova G., et al. // Science. 2018. V. 362. № 6414. P. 598–602.
  24. Gaiotto T., Hufton S.E. // PLoS One. 2016. V. 11. № 10. P. 1–27.
  25. Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. // Nature. 1993. V. 363. № 6428. P. 446–448.
  26. Harmsen M.M., van Solt C.B., van Zijderveld-Van Bemmel A.M., Niewold T.A., van Zijderveld F.G. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72. № 3. P. 544–551.
  27. van Heeke G., Allosery K., De Brabandere V., De Smedt T., Detalle L., de Fougerolles A. // Pharmacol. Ther. 2017. V. 169. P. 47–56.
  28. Arbabi-Ghahroudi M. // Front. Immunol. 2017. V. 8. P. 1589.
  29. Jovčevska I., Muyldermans S. // BioDrugs. 2020. V. 34. № 1. P. 11–26.
  30. Impagliazzo A., Milder F., Kuipers H., Wagner M.V., Zhu X., Hoffman R.M., van Meersbergen R., Huizingh J., Wanningen P., Verspuij J., et al. // Science. 2015. V. 349. № 6254. P. 1301–1306.
  31. Arbabi Ghahroudi M., Desmyter A., Wyns L., Hamers R., Muyldermans S. // FEBS Lett. 1997. V. 414. № 3. P. 521–526.
  32. Ledsgaard L., Kilstrup M., Karatt-Vellatt A., McCafferty J., Laustsen AH. // Toxins (Basel). 2018. V. 10. № 6. P. 236.
  33. Fischer S., Handrick R., Otte K. // Biotechnol. Adv. 2015. V. 33. № 8. P. 1878–1896.
  34. Godakova S.A., Noskov A.N., Vinogradova I.D., Ugriumova G.A., Solovyev A.I., Esmagambetov I.B., Tukhvatulin A.I., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Shcheblyakov D.V., et al. // Toxins (Basel). 2019. V. 11. № 8. P. 464.
  35. De Genst E., Silence K., Decanniere K., Conrath K., Loris R., Kinne J., Muyldermans S., Wyns L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 12. P. 4586–4591.
  36. Stijlemans B., Conrath K., Cortez-Retamozo V., van Xong H., Wyns L., Senter P., Revets H., De Baetselier P., Muyldermans S., Magez S. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 2. P. 1256–1261.
  37. Nobusawa E., Aoyama T., Kato H., Suzuki Y., Tateno Y., Nakajima K. // Virology. 1991. V. 182. № 2. P. 475–485.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Электрофоретический анализ СД в 12% полиакриламидном геле. 1 – неденатурирующие невосстанавливающие условия; 2 – денатурирующие восстанавливающие условия

Скачать (49KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Схема иммунизации альпака вакциной Гриппол® плюс в сочетании с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) или неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) (А) и уровень антител к СД и полноразмерным НА в сыворотке альпака после 5-й иммунизации (Б)

Скачать (128KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Результаты поликлонального фагового ИФА, показывающие связывание фагов после различных раундов селекции с СД и полноразмерными НА (А), и результаты скрининга отобранных случайным образом моноклонов в фаговом ИФА (Б)

Скачать (104KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Результаты титрования отобранных клонов VHH в ИФА на СД НА (А) и на полноразмерном НА вируса гриппа H1N1 (A/California/04/2009) (Б)

Скачать (150KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Динамика выживаемости (А) и массы тела (Б) мышей после интраназального заражения H1N1 (A/Duck/mallard/Moscow/4970/2018) в дозе 15 LD50, смешанного с VHH. Различия между выживаемостью в опытных и контрольной группах статистически значимы (p < 0.0005)

Скачать (107KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Динамика выживаемости (А) и массы тела (Б) мышей после интраназального заражения H5N2 (A/Mallard duck/Pennsylvania/10218/84) в дозе 15 LD50, смешанного с VHH. Различия между выживаемостью в опытных и контрольной группах статистически значимы (p < 0.0002)

Скачать (111KB)
Метаданные

© Воронина Д.В., Щебляков Д.В., Есмагамбетов И.Б., Деркаев А.А., Попова О., Щербинин Д.Н., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах