Отправить статью по E-mail Оценка противовирусного потенциала модифицированных гетероциклических оснований и 5’-норкарбоциклических аналогов нуклеозидов в отношении SARS-CoV-2
- Авторы: Матюгина Е.С.1, Новиков М.С.2, Козловская Л.И.3,4, Волок В.П.3, Шустова Е.Ю.3, Ишмухаметов А.А.3,4, Кочетков С.Н.1, Хандажинская А.Л.1
-
Учреждения:
- Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
- Волгоградский государственный медицинский университет
- Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН
- Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)
- Выпуск: Том 13, № 4 (2021)
- Страницы: 78-81
- Раздел: Экспериментальные статьи
- Дата подачи: 07.06.2021
- Дата принятия к публикации: 08.10.2021
- Дата публикации: 15.12.2021
- URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11479
- DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.11479
- ID: 11479
Цитировать
Аннотация
Пандемия, вызванная новым бетакоронавирусом SARS-CoV-2, унесла уже почти 5 млн жизней. Несмотря на разработку и широкое применение вакцин против COVID-19, это заболевание остается главной проблемой мирового здравоохранения. В рамках перепрофилирования существующих лекарственных средств ведутся интенсивные исследования препаратов, созданных для терапии других вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций, аутоиммунных, онкологических и других заболеваний с целью создания эффективного терапевтического средства. В данной работе в результате фенотипического скрининга библиотек модифицированных гетероциклических оснований и 5’-норкарбоциклических аналогов нуклеозидов, синтезированных нами ранее, выявлены два соединения-лидера, способные ингибировать размножение вируса SARS-CoV-2 со значениями EC50 в диапазоне 20–70 мкМ. Структуры этих соединений могут быть использованы для дальнейшей оптимизации с целью создания противовирусного препарата.
Ключевые слова
Полный текст
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
EC50 – 50% эффективная концентрация, т.е. концентрация соединения, подавляющая репродукцию вируса в 50% тест-объектов; NHC – N-гидроксицитидин; ВИЧ – вирус иммунодефицита человека; ДМСО – диметилсульфоксид; ТЦД50 – 50% тканевая цитотоксическая доза, т.е. доза вируса, вызывающая появление признаков цитопатического действия в 50% тест-объектов.
ВВЕДЕНИЕ
Coronaviridae – семейство вирусов, включающее два подсемейства: Orthocoronavirinae и Letovirinae. Опасные для здоровья человека патогены относятся к подсемейству Orthocoronavirinae. В 60-х годах XX века впервые были идентифицированы коронавирусы человека (HCoV) – HCoV-OC43 (OC43) и HCoV-229Е (229Е) [1]. Позднее обнаружили и другие коронавирусы человека: HCoV-NL63 (NL63) в 2004 году и HCoV-HKU1 (HKU1) в 2005 году [1]. Эти четыре вируса обычно вызывают острые заболевания верхних, реже нижних дыхательных путей, но тяжелые случаи коронавирусной инфекции регистрировали редко и связывали, как правило, с сопутствующей патологией и/или иммунологическим старением. Два более опасных коронавируса человека – SARS-CoV (2003 г.) и MERS-CoV (2012 г.) вызывают атипичные поражения верхних и нижних дыхательных путей, которые особенно тяжело протекают у людей старше 65 лет и пациентов с сопутствующими заболеваниями [1].
Седьмым в группе коронавирусов человека стал SARS-CoV-2, идентифицированный в декабре 2019 года в городе Ухань (Китай). Инфекция, вызываемая этим вирусом, получила название COVID-19 и быстро распространилась по всему миру. Всемирная организация здравоохранения объявила 11 марта 2020 года о пандемии COVID-19 [2]. Объединенные усилия ученых всего мира, позволившие быстро выявить этиологический агент, получить информацию о структуре и жизненном цикле вируса, а также опыт разработки вакцин против «атипичной пневмонии», вызванной SARS-CoV, привели к появлению вакцин, некоторые из которых успешно прошли доклинические и клинические испытания и используются для массовой вакцинации [2].
Тем не менее, на 27 октября 2021 диагноз COVID-19 подтвержден более чем у 274 млн пациентов в мире, из которых 4.96 млн умерли [2]. К настоящему моменту не существует общепринятых эффективных методов терапии COVID-19, в связи с чем создание специфических препаратов для лечения этого заболевания остается весьма актуальной задачей. Разрабатывают препараты на основе антител, ингибиторов вирусных ферментов (РНК-зависимой РНК-полимеразы, протеаз и др.), ингибиторов проникновения вируса в клетку и др. [3]. В рамках перепрофилирования существующих лекарственных средств во всем мире ведутся интенсивные исследования препаратов, созданных для терапии других вирусных (грипп, ВИЧ-инфекция, гепатит С, лихорадка Эбола и др.), бактериальных и паразитарных инфекций, аутоиммунных, онкологических и других заболеваний [3].
В контексте данной стратегии мы провели скрининг библиотеки аналогов гетероциклических оснований и нуклеозидов, полученных нами ранее и показавших противовирусную [4–8], антибактериальную [7, 9–11], противопаразитарную [12, 13] или антипролиферативную активность [14, 15].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Стоковые растворы тестируемых соединений в концентрации 5 мкМ готовили в 100% ДМСО. Для оценки противовирусной активности использовали штамм ПИК35 вируса SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_428851) [16]. Вирус прошел пять пассажей в клетках Vero и хранился в виде суспензии инфицированных клеток при температуре -70°С. Линия клеток почки зеленой мартышки Vero получена из Biologicals, ВОЗ, Швейцария (RCB 10-87). Клетки вели на культуральной среде ДМЕМ («ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН», Россия) с фетальной сывороткой крупного рогатого скота (Gibco, США, 5%), стрептомицином (0.1 мг/мл) и пенициллином (100 ед./мл) («ПанЭко», Россия).
Методика фенотипического скрининга апробирована ранее [16]. Готовили восемь двукратных разведений стоковых растворов соединений в среде ДМЕМ. Далее разведения соединений смешивали с равными объемами вирусной суспензии, содержащей 50–200 ТЦД50 на лунку, инкубировали в течение 1 ч при 37°C, далее смеси вирус-соединение добавляли к конфлюентным монослоям клеток Vero в двух повторностях. После 5-дневной инкубации при 37°C цитопатический эффект (ЦПЭ) оценивали микроскопически. Значения ЕС50 рассчитывали по методу Кербера как описано ранее [16]. Эксперимент повторяли не менее 2 раз для каждого соединения. В качестве положительного контроля использовали N-гидроксицитидин (NHC), в качестве отрицательного – ДМСО.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Проведен фенотипический скрининг библиотеки аналогов гетероциклических оснований (рис. 1) и нуклеозидов (рис. 2), синтезированных нами ранее, на активность против SARS-CoV-2. Первая группа аналогов гетероциклических оснований представляет собой 5-ариламинопроизводные урацила и 6-азаурацила (рис. 1), проявившие себя как ненуклеозидные ингибиторы ВИЧ и ингибиторы роста Mycobacterium tuberculosis [7, 11]. Вторая группа представляет собой новые флексимерные аналоги аза/дезазапуриновых оснований (рис. 1) [17]. Известно, что аза/дезазапурины, как и соответствующие нуклеозиды, проявляют широкий спектр противопаразитарных, противоопухолевых и противовирусных свойств [18]. С другой стороны, флексимерные основания обладают высокой подвижностью (гибкостью) структуры, которая создается за счет размыкания пуринового кольца на отдельные гетероциклические фрагменты. Свободное вращение вокруг С–С-связи позволяет подобным соединениям наилучшим образом подстраиваться к пространственной структуре активного центра фермента-мишени, что в ряде случаев позволяет обходить возникающие в последнем точечные мутации, тем самым обеспечивая механизм преодоления лекарственной устойчивости [17].
Рис. 1. Аналоги гетероциклических оснований
Рис. 2. 5’-Норкарбоциклические аналоги нуклеозидов
Другая группа соединений включает 5’-норкарбоциклические аналоги пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов (рис. 2). Структурная особенность этих аналогов нуклеозидов – отсутствие 5’-метиленовой группы и, как следствие, невозможность превращаться в фосфорилированные формы под действием клеточных ферментов и проявлять биологическую активность по традиционным для обычных модифицированных нуклеозидов механизмам. Однако представители соединений данного класса способны выступать в качестве ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ННИОТ) ВИЧ, а кроме того, обладают антибактериальной и противоопухолевой активностью [4–7, 9–11, 15].
Противовирусную активность определяли по способности исследуемых соединений ингибировать гибель клеток Vero, индуцированную заражением штаммом ПИК35 вируса SARS-CoV-2. В качестве положительного контроля использовали N-гидроксицитидин (NHC), известный ингибитор репродукции SARS-CoV-2, активность которого в данной серии экспериментов соответствовала ранее полученным данным [16]. Всего протестировано 53 соединения, большинство из которых не проявили активности в концентрации до 100 мкМ. Только два соединения, (1-(4’-гидрокси-2’-циклопентен-1-ил)-6-(4-третбутилфенил)-3H-пирроло[2, 3-d]-пиримидин-2-он 23 и 1-(4’-гидрокси-2’-циклопентен-1-ил)-6-(4-пентилфенил)-3H-пирроло[2, 3-d]-пиримидин-2-он) 24, показали дозозависимую способность ингибировать размножение SARS-CoV-2 со значениями EC50 = 53 и 21 мкМ соответственно (таблица). При этом наблюдалась довольно выраженная цитотоксичность, что соответствует ранее полученным данным [14].
Константы противовирусной активности и цитотоксичности активных соединений
Соединение | ЕС50, мкМ (M ± SEM) | СС50, мкМ (M ± SEM) | Индекс селективности (SI) |
23 | 53 ± 18 | 75 ± 25 | 1.42 |
24 | 21 ± 6 | 53 ± 18 | 2.52 |
NHC | 5.3 ± 0.9 | >100 | > 19 |
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе методами фенотипического скрининга выявлены два аналога нуклеозидов, 5’-норкарбоциклические производные бициклических фурано[2, 3-d]пиримидинов 23 и 24, способных ингибировать репродукцию вируса SARS-CoV-2 in vitro. Структуры этих соединений могут быть использованы для дальнейшей оптимизации с целью создания противовирусного препарата.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-04-60414. Синтез флексимерных аналогов гетероциклических оснований был осуществлен при поддержке РНФ № 19-74-10048.
Об авторах
Елена Сергеевна Матюгина
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Email: matyugina@gmail.com
Россия, 119991, Москва
Михаил Станиславович Новиков
Волгоградский государственный медицинский университет
Email: m-novikov1@mail.ru
Россия, 400131, Волгоград
Любовь Игоревна Козловская
Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)
Email: lubov_i_k@mail.ru
Россия, 108819, Москва; 119991, Москва
Виктор Петрович Волок
Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН
Email: viktor.p.v@mail.ru
Россия, 108819, Москва
Елена Юрьевна Шустова
Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН
Email: riw.sun@list.ru
Россия, 108819, Москва
Айдар Айратович Ишмухаметов
Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)
Email: ishmukhametov@chumakovs.su
Россия, 108819, Москва; 119991, Москва
Сергей Николаевич Кочетков
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Email: snk1952@gmail.com
Россия, 119991, Москва
Анастасия Львовна Хандажинская
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Автор, ответственный за переписку.
Email: khandazhinskaya@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-1452-0253
Россия, 119991, Москва
Список литературы
- Shi Z., Brugere-Picoux J. // Bull. Acad. Natl. Med. 2021. V. 205. P. 732–736.
- https://covid19.who.int/.
- https://covid-nma.com/living_data/index.php.
- Matyugina E.S., Valuev-Elliston V.T., Babkov D.A., Novikov M.S., Ivanov A.V., Kochetkov S.N., Balzarini J., Seley-Radtke K.L., Khandazhinskaya A.L. // Medchemcomm. 2013. V. 4. P. 741–748.
- Matyugina E.S., Valuev-Elliston V.T., Geisman A.N., Novikov M.S., Chizhov A.O., Kochetkov S.N., Seley-Radtke K.L., Khandazhinskaya A.L. // Medchemcomm. 2013. V. 4. P. 1443–1451.
- Matyugina E., Valyev-Elliston V.T., Novikov M.S., Alexandrova L.A., Chernoysova L.N., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L. // FEBS J. 2013. V. 280. P. 358–359.
- Matyugina E.S., Novikov M.S., Babkov D.A., Valuev-Elliston V.T., Vanpouille C., Zicari S., Corona A., Tramontano E., Margolis L.B., Khandazhinskaya A.L., Kochetkov S.N. // Acta Naturae. 2015. V. 7. P. 113–115.
- Matyugina E.S., Seley-Radtke K.L., Andronova V.L., Galegov G.A., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L. // Russ. J. Bioorg Chem. 2010. V. 36. P. 730–733.
- Matyugina E., Khandazhinskaya A., Chernousova L., Andreevskaya S., Smirnova T., Chizhov A., Karpenko I., Kochetkov S., Alexandrova L. // Bioorgan. Med. Chem. 2012. V. 20. P. 6680–6686.
- Matyugina E.S., Andreevskaya S.N., Smirnova T.G., Khandazhinskaya A.L. // Acta Naturae. 2012. V. 4. P. 73–77.
- Matyugina E., Novikov M., Babkov D., Ozerov A., Chernousova L., Andreevskaya S., Smirnova T., Karpenko I., Chizhov A., Murthu P., et al. / / Chem. Biol. Drug Des. 2015. V. 86. P. 1387–1396.
- Alzahrani K.J., Matyugina E.S., Khandazhinskaya A.L., Kochetkov S.N., Seley-Radtke K.L., de Koning H.P. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2017. V. 27. P. 3081–3086.
- Khandazhinskaya A.L., Matyugina E.S., Solyev P.N., Wilkinson M., Buckheit K.W., Buckheit R.W., Chernousova L.N., Smirnova T.G., Andreevskaya S.N., Alzahrani K.J., Natto M.J., Kochetkov S.N., de Koning H.P., Seley-Radtke K.L. // Molecules. 2019. V. 24. P. 19E3433.
- Klimenko A.A., Matyugina E.S., Logashenko E.B., Solyev P.N., Zenkova M.A., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L. // Molecules. 2018. V. 23. P. 2654.
- Matyugina E.S., Logashenko E.B., Zenkova M.A., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L. // Heterocycl. Commun. 2015. V. 21. P. 259–262.
- Kozlovskaya L.I., Volok V.P., Shtro A.A., Nikolaeva Y.V., Chistov A.A., Matyugina E.S., Belyaev E.S., Jegorov A.V., Snoeck R., Korshun V.A., et al. // Eur. J. Med. Chem. 2021. V. 220. P. 113467.
- Khandazhinskaya А., Eletskaya B., Fateev I., Kharitonova M., Konstantinova I., Barai V., Azhayev A., Hyvonen M., Keinanen T., Kochetkov S., et al. // Organic. Biomol. Chem. 2021. V. 19. P. 7379–7389.
- Matyugina E.S., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L.// Russ. Chem. Rev. 2021. V. 90. P. 1454–1491.
Дополнительные файлы
