Voltage-Sensing Domain of the Third Repeat of Human Skeletal Muscle NaV1.4 Channel As a New Target for Spider Gating Modifier Toxins

Mikhail Yu. Myshkin; Мышкин Михаил Юрьевич; Alexander S. Paramonov; Парамонов Александр Сергеевич; Dmitrii S. Kulbatskii; Кульбацкий Дмитрий Сергеевич; Yelizaveta A. Surkova; Суркова Елизавета Андреевна; Antonina A. Berkut; Беркут Антонина А.; Alexander A. Vassilevski; Василевский Александр Александрович; E. N. Lyukmanova; Люкманова Екатерина Назымовна; Mikhail P. Kirpichnikov; Кирпичников Михаил Петрович; Zakhar O. Shenkarev; Шенкарев Захар Олегович

doi:10.32607/actanaturae.11279

Потенциалчувствительный домен из третьего повтора канала скелетных мышц человека NaV1.4 – новая мишень действия «вольт-сенсорных» токсинов из ядов пауков

Авторы: Мышкин М.Ю.¹, Парамонов А.С.¹, Кульбацкий Д.С.¹, Суркова Е.А.¹, Беркут А.А.¹, Василевский А.А.¹, Люкманова Е.Н.¹^,2, Кирпичников М.П.¹^,2, Шенкарев З.О.³
Учреждения:
1. Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
2. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
3. Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва
Выпуск: Том 13, № 1 (2021)
Страницы: 134-139
Раздел: Экспериментальные статьи
Дата подачи: 30.11.2020
Дата принятия к публикации: 22.01.2021
Дата публикации: 15.03.2021
URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11279
DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.11279
ID: 11279

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Потенциалзависимые натриевые каналы (NaV) имеют модульное строение и содержат пять мембранных доменов. Центральный поровый домен отвечает за проводимость ионов и их селективную фильтрацию, а четыре периферических потенциалчувствительных домена (ПЧД-I/IV) отвечают за активацию и быструю инактивацию канала. «Вольт-сенсорные» токсины из яда членистоногих взаимодействуют с ПЧД, оказывая влияние на активацию и/или инактивацию канала, и могут выступать прообразами новых препаратов для лечения различных каналопатий и болевых синдромов. Токсинсвязывающие сайты, расположенные в ПЧД-I, II и IV NaV-каналов млекопитающих, описаны ранее. На примере токсина Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei нами показано наличие токсинсвязывающего сайта в ПЧД-III NaV1.4-канала скелетных мышц человека. Разработана система бесклеточного синтеза белка, позволяющая получать препараты изолированного (отделенного от канала) ПЧД-III и его 15N-меченого аналога в миллиграммовых количествах. Методом ЯМР-спектроскопии в мембраноподобном окружении мицелл DPC/LDAO (1 : 1) показано, что Hm-3 имеет сравнительно высокое сродство к ПЧД-III (константа диссоциации комплекса Кd ~6 мкМ), сравнимое со сродством токсина к ПЧД-I и превышающее аффинность токсина к ПЧД-II. При образовании комплекса положительно заряженные остатки Lys25 и Lys28 токсина, по-видимому, взаимодействуют с внеклеточной петлей S1–S2 ПЧД-III. При этом молекула Hm-3 также контактирует с фрагментом липидной мембраны, окружающей канал.

Ключевые слова

бесклеточный синтез белка, взаимодействие лиганд–рецептор, ЯМР-спектроскопия, натриевые каналы, «вольт-сенсорные» токсины

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Потенциалзависимые Na⁺-каналы (Na_V) – трансмембранные (ТМ) белки, отвечающие за восходящую фазу потенциала действия в возбудимых клетках. Эти каналы состоят из порообразующей α-субъединицы, с которой ассоциированы регуляторные β-субъединицы (рис. 1А). α-Субъединица включает в себя четыре гомологичных повтора (I–IV), каждый из которых содержит потенциалчувствительный домен (ПЧД, ТМ-сегменты S1–S4) и сегменты S5–S6, формирующие пору канала [1]. β-Субъединицы имеют один ТМ-сегмент и внеклеточный иммуноглобулиновый домен [2]. В геноме человека представлено 10 генов, кодирующих α-субъединицы Na_V, и четыре гена β-субъединиц. Канал Na_V1.4 экспрессируется в скелетных мышцах, и мутации в гене его α-субъединицы (SCN4A) приводят к ряду врожденных заболеваний опорно-двигательного аппарата, таких, как миотония, парамиотония, гиперкалиемический и гипокалиемический периодический паралич, миастения и миопатия [3].

Na_V являются мишенями для множества нейротоксинов из разных организмов. В ПЧД и поре канала идентифицировано как минимум восемь рецепторных сайтов связывания токсинов [4]. Во внеклеточных петлях ПЧД повторов II и IV идентифицированы два канонических сайта связывания токсинов пауков и скорпионов (рис. 1А) [5]. Токсины, действующие на ПЧД-IV (сайт 3), ингибируют инактивацию канала, а токсины, действующие на ПЧД-II (сайт 4), например, «вольт-сенсорные» токсины пауков, влияют на активацию канала [5]. Несмотря на то что внеклеточные интерфейсы ПЧД-I и III могут быть частично закрыты иммуноглобулиновыми доменами β-субъединиц [6, 7], эти домены, задействованные в активации канала, также могут содержать токсинсвязывающие сайты, доступные при некоторых патофизиологических состояниях. Например, показано [8], что некоторые токсины ингибируют активацию химерного канала K_V2.1, содержащего петли S3–S4 из ПЧД-I или III канала Na_V1.2, и при этом не ингибируют исходный канал K_V2.1. Поиск места связывания нейротоксинов в каналах эукариот методом сайт-направленного мутагенеза затруднен, так как α-субъединица Na_V содержит четыре ПЧД, каждый из которых может принимать участие в формировании отклика на действие токсина.

Ранее мы показали, что основным сайтом связывания токсина Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei в канале Na_V1.4 человека является внеклеточная петля S3–S4 ПЧД-I [9]. Кроме того, Hm-3 взаимодействует с внеклеточной петлей S1–S2 ПЧД-II, но со значительно меньшей аффинностью [10]. Токсин Hm-3 состоит из 35 аминокислотных остатков и при нейтральных pH имеет заряд +4. Вторичная структура Hm-3 включает в себя несколько β-поворотов и β-шпильку, сформированную остатками Cys23–Cys34. Пространственная структура Hm-3 стабилизирована тремя дисульфидными связями, формирующими так называемый «цистиновый узел» [11]. Несколько ароматических остатков образуют на поверхности Hm-3 гидрофобный кластер, поэтому, как и другие «вольт-сенсорные» токсины пауков, Hm-3 имеет сродство к мембранам [11] и, по-видимому, атакует ПЧД из мембраносвязанного состояния. Токсины этого семейства интересны не только как инструменты для структурно-функциональных исследований Na_V, но также могут служить прообразами новых лекарств. Например, Hm-3 способен блокировать аберрантные токи утечки (ω-токи), возникающие в канале Na_V1.4 при мутациях ПЧД-I и II, приводящих к развитию периодического паралича [9, 10].

Рис. 1. Схематическое изображение пространственной организации NaV эукариот в мембране (А). Аминокислотная последовательность варианта ПЧД-III, использованного в работе (Б). Подчеркнуты остатки, искусственно введенные в последовательность. Вторичная структура показана согласно известной пространственной структуре [6] (PDB ID: 6AGF). Отрицательно и положительно заряженные остатки обозначены красным и голубым фоном соответственно. Знаком «+» обозначены положительно заряженные остатки в спирали S4, служащей сенсором потенциала. Очистка образца ПЧД-III на Ni2+-аффинной смоле (В). Дорожки: 1 – маркер молекулярных масс; 2 – солюбилизированный осадок TC; 3 – промывка колонки; 4 – элюция 500-мМ имидазолом. Молекулярная масса ПЧД-III: 16.3 кДа

В представленной работе на примере токсина Hm-3 нами впервые показано наличие токсинсвязывающего сайта в ПЧД-III канала Na_V1.4 человека. С этой целью мы использовали альтернативный подход, основанный на рекомбинантной продукции изолированного (отделенного от канала) ПЧД и анализе сайтов связывания методом ЯМР-спектроскопии. Возможность структурных ЯМР-исследований изолированных ПЧД [12] и их комплексов с токсинами [9, 10] показана ранее.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Изолированный ПЧД-III (остатки 1019–1157, рис. 1Б) получали с помощью сопряженной бесклеточной системы синтеза диализного типа на основе экстракта S30 из Escherichia coli, используя протоколы, разработанные для других ПЧД [9, 10]. Генетическую конструкцию для синтеза ПЧД-III с С-концевым His6-тагом клонировали в плазмидный вектор pIVEX2.3d, обеспечивающий высокую эффективность бесклеточного синтеза. Последовательность ПЧД-III содержит два остатка Cys, не участвующих в образовании дисульфидных связей. Для уменьшения тенденции к агрегации рекомбинантного домена эти остатки были заменены на Ser (рис. 1Б, подчеркнуты). Бесклеточный синтез проводили без добавления мембраномоделирующих компонентов в трансляционную смесь (ТС). При этом синтезированный ПЧД-III накапливался в виде осадка с чистотой более 90% (рис. 1В). ¹⁵N-меченый аналог ПЧД-III синтезировали с использованием обогащенной изотопом ¹⁵N смеси 16 аминокислот (Cortecnet, Лез-Юлис, Франция), полученной из водорослей, и отдельных ¹⁵N-меченых аминокислот Asn, Gln и Trp. Цистеин в реакцию синтеза не добавляли, так как использованный в работе вариант ПЧД-III не содержит этой аминокислоты. Выходы препаратов ПЧД-III немеченого и ¹⁵N-меченого белка составили 0.5 и 0.35 мг на 1 мл ТС соответственно. Для ЯМР-исследования осадок, содержащий синтезированный ПЧД-III, растворяли в 10% растворе додецилфосфохолина (DPC), очищали с помощью Ni²⁺-аффинной хроматографии в присутствии 0.5% DPC (рис. 1В), переводили в целевой буфер (20 мМ Трис-ацетат, pH 5.5) и добавляли детергент N,N-диметилдодециламин-N-оксид (LDAO) до молярного соотношения DPC/LDAO 1 : 1. Ранее эту мембраномоделирующую среду применяли для исследования комплексов ПЧД-I и II с токсином Hm-3 [9, 10]. Концентрацию детергентов контролировали по спектрам 1D ¹H-ЯМР. ЯМР-спектры получали на спектрометре AVANCE III 800 (Bruker).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общий вид 2D ¹H,¹⁵N корреляционного ЯМР-спектра ПЧД-III (рис. 2А) соответствовал спектрам ПЧД-I и II, полученным ранее [9, 10]. Наблюдаемая небольшая дисперсия сигналов ¹H^N характерна для спиральных ТМ-белков. Однако в спектре наблюдалось не более 90 сигналов HN-групп основной цепи из 130–140 ожидаемых. В соответствующих областях спектра представлены шесть из восьми HN-сигналов остатков Gly и четыре из пяти сигналов HN^ε1 боковых цепей остатков Trp. Отсутствие части сигналов в спектре, а также неоднородная интенсивность и полуширина наблюдаемых сигналов указывают на процессы конформационного обмена в мкс–мс-диапазоне. Эти процессы связаны, вероятно, с пластичностью структуры ПЧД-III и динамикой контактов между ТМ-спиралями. Наблюдаемые уширения сигналов не позволили получить отнесение сигналов ЯМР ПЧД-III, поэтому взаимодействие с Hm-3 исследовали качественно, без картирования сайта связывания в ПЧД.

Рис. 2. ЯМР-исследование взаимодействия 15N-меченого ПЧД-III с немеченым Hm-3. А – 2D 1H,15N-TROSY-спектр 43 мкМ ПЧД-III в мицеллах DPC/LDAO (45/45 мМ, 800 МГц, pH 5.5, 45°С). Б – наложение фрагментов спектров ПЧД-III, полученных без Hm-3 (черные контуры) и после добавления 160 мкМ Hm-3 (красные контуры). Стрелками показано направление изменения положения сигналов. Пунктирными линиями обозначены сигналы, «исчезающие» при добавлении токсина. В – изменение 1H химического сдвига HN-сигнала при 8.03/115.4 м.д. (показан звездочкой на панели Б2) аппроксимировано уравнением, описывающим связывание в присутствии избытка мицелл детергента

Образцы немеченого и ¹⁵N-меченого Hm-3 получали, используя рекомбинантную продукцию в клетках E. coli [9, 11]. Для исследования взаимодействия ПЧД-III/Hm-3 в образец ¹⁵N-меченого ПЧД в мицеллах DPC/LDAO поэтапно добавляли немеченый Hm-3 до молярного соотношения ПЧД/токсин 1 : 4. Концентрацию детергентов поддерживали постоянной, чтобы предотвратить изменение в распределении токсина между водной фазой и мицеллами. Согласно полученным ранее данным о взаимодействии Hm-3 с мицеллами DPC/LDAO [9], ~97% молекул токсина в условиях эксперимента были связаны с мицеллами. При добавлении токсина в спектре ПЧД-III наблюдались изменения химических сдвигов и амплитуд некоторых сигналов (рис. 2Б). Эти изменения указали на специфическое взаимодействие ПЧД/токсин. Обратимый процесс образования–диссоциации комплекса ПЧД/Hm-3 идет с характерным временем в мкс–мс-диапазоне, и для разных сигналов ПЧД этот обменный процесс является либо быстрым, либо промежуточным (по шкале времен ЯМР). Константу диссоциации комплекса определили путем аппроксимации зависимости химического сдвига сигналов ПЧД-III от концентрации Hm-3 (рис. 2В), учитывая вклад взаимодействия Hm-3/мицелла [9]. Полученное значение (5.8 ± 3.8 мкМ) соответствовало константе диссоциации комплекса ПЧД-I/Hm-3 (6.2 ± 0.6 мкМ) [9] и было меньше значения для комплекса с ПЧД-II (~11 мкМ) [10], что указывает на более сильное взаимодействие токсина с ПЧД-I и ПЧД-III.

Обратное титрование, когда к образцу ¹⁵N-меченого Hm-3 добавляли немеченый ПЧД-III, показало, что положительно заряженные остатки Lys25 и Lys28, находящиеся в β-шпильке токсина, а также остаток Phe12, заглубленный в гидрофобную область мицеллы, принимают участие в образовании комплекса с ПЧД (рис. 3). Этот сайт связывания совпадает с сайтами, ответственными за взаимодействие Hm-3 с ПЧД-I и II [9, 10]. В ходе этих более ранних исследований показано, что пара заряженных остатков Hm-3 – Lys25 и Lys28 – способна специфически взаимодействовать со спиральными мотивами, содержащими два отрицательно заряженных остатка (Asp или Glu), разделенных двумя или тремя незаряженными остатками. В последовательности ПЧД-III такие мотивы встречаются только во внеклеточной петле S1–S2 и в ТМ-части спирали S2 (рис. 1Б). Однако, согласно известной пространственной структуре канала Na_V1.4 человека [6], остатки Glu1066 и Asp1069 расположены глубоко в трансмембранной части спирали S2, а их боковые цепи обращены внутрь молекулы ПЧД-III. Учитывая амфипатические свойства Hm-3 [11], мы предполагаем, что токсин не может погружаться глубоко в мембрану и взаимодействовать с этими остатками. В то же время боковые цепи остатков Glu1051, Asp1052 и Glu1056, расположенных в петлевом участке S1–S2, доступны растворителю и могут взаимодействовать с молекулой Hm-3, связанной с поверхностью мембраны.

Рис. 3. ЯМР-исследование взаимодействия 15N-меченого Hm-3 с немеченым ПЧД-III. А – 2D 1H,15N-HSQC-спектр 30 мкМ Hm-3 в мицеллах DPC/LDAO (45/45 мМ, 800 МГц, pH 5.5, 45°С). Б – наложение фрагментов спектров Hm-3, полученных без ПЧД-III (черные контуры/линии) и после добавления 40 мкМ ПЧД-III (красные контуры/линии, конечное соотношение ПЧД-III/Hm-3 3 : 2). Стрелками показано направление изменения положения сигналов. На панели Б3 показано селективное уменьшение амплитуды сигнала Lys28 при добавлении ПЧД-III. В, Г – первичная, вторичная и пространственная структуры токсина Hm-3 [11] (PDB ID: 2MQU), а также изменение химических сдвигов и амплитуд сигналов Hm-3 при добавлении ПЧД-III. Показаны положительно и отрицательно заряженные остатки и дисульфидные мостики. Остатки, для которых наблюдаются значительные изменения, выделены фоном (В) и обозначены шариками (Г). Пунктирной линией изображена поверхность мицеллы детергента [9]

Напротив, другая внеклеточная петля ПЧД-III – S3–S4 – содержит только один отрицательно заряженный остаток Glu1121 и, вероятно, не может выступать в качестве сайта связывания токсина Hm-3. Это согласуется с результатами предыдущего исследования химерного канала K_V2.1, содержащего петлю S3–S4, пересаженную из ПЧД-III канала Na_V1.4, в ходе которого не выявлено значимого взаимодействия с токсином Hm-3 [9]. Таким образом, полученные данные указывают на то, что внеклеточная петля S1–S2 ПЧД-III канала Na_V1.4 человека содержит сайт, способный взаимодействовать с «вольт-сенсорными» токсинами пауков. Следует отметить, что исследование токсинсвязывающих сайтов, которые располагаются на участке S1–S2 ПЧД каналов Na_V, с помощью химерных каналов, по-видимому, невозможно. Попытки пересаживать петли S1–S2 из различных каналов в K_V2.1 приводили к нефункциональным химерам [13].

Разработанная в настоящей работе сиcтема бесклеточного синтеза ПЧД-III позволит в дальнейшем исследовать взаимодействие домена и с другими токсинами, а также может быть использована для скрининга прототипов лекарственных препаратов, селективно взаимодействующих с ПЧД-III. Предложенный метод исследования фармакологических свойств изолированных ПЧД каналов Na_V с использованием спектроскопии ЯМР имеет преимущество перед методами, основанными на исследовании химерных каналов, так как позволяет, во-первых, картировать остатки токсинов, важные для взаимодействия с доменами, а во-вторых, изучать токсинсвязывающие сайты, которые располагаются не только в петле S3–S4, но и на участке S1–S2.