Новый модулятор активности STIM2-зависимых депо-управляемых кальциевых каналов

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Депо-зависимый вход кальция – один из основных путей поступления кальция в электроневозбудимые клетки, вызывающий запуск множества внутриклеточных сигнальных каскадов. Белки семейства STIM (STIM1 и STIM2), ключевые в данном процессе, являются сенсорами кальция во внутриклеточных кальциевых депо, активирующими депо-управляемые каналы плазматической мембраны при снижении концентрации кальция. В физиологических условиях белки STIM1 и STIM2 управляют различными депо-зависимыми ионными каналами плазматической мембраны. Селективные модуляторы активности белков STIM на данный момент отсутствуют, а инструментарий по разграничению их активности в условиях эксперимента недостаточен. В результате скрининга библиотеки низкомолекулярных соединений нами обнаружено вещество 4-MPTC, селективно подавляющее STIM2-зависимый депо-управляемый вход кальция (IC50 = 1 мкМ), но практически не влияющее на STIM1-зависимый механизм активации депо-управляемых каналов.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме – один из общих ответов клетки на внеклеточную стимуляцию мембранных рецепторов физиологически активными веществами, запускающими широкий спектр внутриклеточных каскадов. В физиологических условиях кальциевый ответ клетки на агонист включает в себя не только вход внеклеточного кальция в клетку, но и опустошение внутриклеточных депо, расположенных в эндоплазматическом ретикулуме [1]. Вход кальция в клетку через каналы плазматической мембраны в ответ на опустошение внутриклеточных депо или депо-управляемый вход кальция [2] обеспечивает существенную часть притока ионов кальция. Запускают этот вход белки STIM (STIM1 и STIM2) – сенсоры кальция в просвете эндоплазматического ретикулума. Первым был охарактеризован белок STIM1, основной активатор депо-управляемого входа [3, 4]. Белки STIM1 и STIM2 различаются сродством к ионам кальция и способностью к взаимодействию с каналами плазматической мембраны [5]. STIM2 более чувствителен к малым изменениям концентрации кальция в депо и является более слабым активатором депо-управляемого входа, чем STIM1. Вероятнее всего, STIM1 отвечает за кальциевый ответ клетки при поступлении внеклеточного сигнала, а STIM2 регулирует базальный уровень концентрации кальция в депо и цитозоле [6]. Кроме того, STIM2 способствует переходу STIM1 в активное состояние [7]. В физиологических условиях STIM1 и STIM2 активируют в клетке различные депо-управляемые каналы [8], которые сформированы белками семейств Orai [9, 10] и TRP [11–13]. Белки STIM вовлечены в широкий спектр патологических процессов. Например, при болезни Хантингтона [14, 15], болезни Альцгеймера [16, 17], церебральной ишемии [18] и черепно-мозговых травмах [19, 20] на фоне увеличенной активности белков STIM наблюдается долговременное повышение концентрации кальция в нейронах, приводящее к клеточной гибели. Изменение уровней экспрессии STIM характерно для нескольких типов рака молочной железы [21], карциномы толстой кишки [22]. Таким образом, изменение активности белков STIM, в частности, уменьшение активности STIM2, может вызывать потенциальный терапевтический эффект. В фундаментальных исследованиях модулятор активности белков STIM2 востребован как инструмент, дающий возможность разделить STIM1- и STIM2-зависимые сигнальные пути, поскольку подобные фармакологические инструменты на данный момент отсутствуют.

Исследователи активно применяют широкий спектр блокаторов депо-управляемого входа, большинство из них модулируют активность депо-зависимых каналов, но эти соединения зачастую недостаточно охарактеризованы и имеют несколько мишеней. Одно из наиболее часто применимых соединений 2-аминоэтоксидифенилборат (2-APB) впервые было охарактеризовано как блокатор IP3-индуцированного выброса кальция [23]. В настоящее время оно широко применяется как блокатор депо-управляемого входа при концентрациях более 50 мкМ. Кроме того, показано, что 2-APB в концентрации 5 мкМ может потенцировать депо-управляемый вход [24]. Механизм действия 2-APB не до конца изучен, известно, что это соединение действует на несколько мишеней и, в том числе, оказывает модулирующий эффект на активность различных каналов, например, образованных белками семейства TRPV [25, 26] и Orai3 [27]. 2-APB увеличивает также неспецифическую утечку кальция из просвета эндоплазматического ретикулума [28].

При заполненном кальцием депо эндоплазматического ретикулума белки STIM находятся в неактивной конформации, которая стабилизируется взаимодействием доменов СС1 (Coiled-Coil 1) и SOAR (STIM-Orai Activating Region). При опустошении депо белки STIM мультимеризуются, меняют свою конформацию и открывают домен SOAR для взаимодействия с каналами плазматической мембраны [29]. Известно, что соединение 2-APB в концентрациях порядка 10 мкМ вызывает депо-независимый вход кальция, переводя структуру белка STIM2 в активную конформацию [30]. Соединение 2-APB в большей концентрации (50 мкМ), напротив, стабилизирует белок STIM1 в неактивной конформации за счет усиления взаимодействия между доменами СС1 и SOAR и, тем самым, затрудняет взаимодействие домена SOAR с каналами Orai1 и их активацию. Любопытно, что повышение экспрессии Orai1 этот эффект частично нивелирует [31].

Таким образом, соединение 2-APB непосредственно взаимодействует с белками STIM, а значит, является хорошей основой для поиска более селективного модулятора депо-управляемого входа кальция. В данной работе с целью выявления селективного модулятора белка STIM2 протестирована библиотека из 250 химических соединений, полученных от компании InterBioScreen Ltd. и обладающих схожей с 2-APB химической структурой. Обнаружено, что вещество 4-MPTC подавляет STIM2-зависимый вход кальция (IC50 = 1 мкМ), но практически не влияет на STIM1-зависимый механизм активации депо-управляемых каналов. Остальные 249 соединений из данной библиотеки оказывали разнонаправленный и неселективный эффект.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клеточные линии

В работе использовали модельные клеточные линии, любезно предоставленные Jonathan Soboloff и Mohamed Trebak, созданные на базе клеток линии НЕК293: STIM1Orai3 (линия, экспрессирующая экзогенные белки STIM1-YFP и Orai3-CFP), STIM2Orai3 (линия, экспрессирующая экзогенные белки STIM2-YFP и Orai3-CFP) [32], STIM1 KО (линия с подавлением экспрессии белка STIM1 методом CRISPR/Cas9), STIM2 KO (линия с подавлением экспрессии белка STIM2 методом CRISPR/Cas9) и Orai3 КО (линия с подавлением экспрессии белка Orai3 методом CRISPR/Cas9) [30]. Клеточные линии культивировали в среде DMEM («Биолот», Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков пенициллина (100 ед./мл) и стрептомицина (0.1 мг/мл) при 37°С и 5% СО2.

Флуоресцентные измерения

Изменения концентрации внутриклеточного кальция регистрировали с использованием флуоресцентного зонда Fluo-4 AM (Thermo Fisher Scientific, США). Клеточные линии рассевали на 96-луночные планшеты для культивирования клеток за 48 ч до начала измерений. Клетки сначала инкубировали в течение 1 ч в растворе HBSS (мМ: 2 CaCl2, 130 NaCl, 25 KCl, 1.2 MgCl2, 10 HEPES и 10 глюкоза), содержащем 5 мкМ Fluo-4 AM, затем в течение 30 мин в растворе HBSS, содержащем соединение 4-MPTC (InterBioScreen Ltd., Россия) либо 1% DMSO (Sigma-Aldrich, США). Измерения проводили в присутствии 2 мМ кальция во внеклеточном растворе на планшетном ридере Fluostar Omega (BMG labtech, Германия). Данные представлены как значения интенсивности флуоресценции Fluo-4, нормированные на базальное значение флуоресценции.

Рис. 1. Уровень экспрессии белков STIM в клеточных линиях STIM1Orai3, STIM2Orai3, Orai3 КО, STIM1 КО и STIM2 КО. А – иммуноблотинг с использованием антител против STIM1. Б – иммуноблотинг с использованием антител против STIM2. Для оценки равномерности нанесения проб представлены данные по окрашиванию проб антителами к α-тубулину. В – структурная формула химического соединения 4-MPTC

Электрофорез и иммуноблотинг

Клетки выращивали на чашках Петри диаметром 60 мм, затем лизировали с добавлением коктейля ингибиторов протеаз. Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях в 8% полиакриламидном геле. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли полусухим методом на установке для переноса (Hoefer Pharmacia Biotech., Германия). Первичные антитела к STIM1 (Cell Signaling #4917, США), STIM2 (Cell Signaling #5668) и α-тубулину (Sigma-Aldrich #T6074, США) разводили в соотношении 1:1000. Вторичные антитела Anti-Mouse IgG (Sigma-Aldrich #A0168) для α-тубулина и Anti-Rabbit IgG (Sigma-Aldrich #A0545) для STIM1 и STIM2. Блоты проявляли на устройстве BioRad Cell Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Inc., США).

Низкомолекулярные химические соединения для скрининга, в том числе и 4-MPTC, любезно предоставленные компанией InterBioScreen Ltd. (ibscreen.com) в сухом виде, растворяли в DMSO до концентрации 10 мМ.

Статистическая обработка

Статистическую обработку проводили с использованием программного обеспечения Origin 8. Результаты флуоресцентных измерений проверяли на нормальность с помощью критерия Фишера. Группы данных сравнивали с помощью теста Бонферрони, статистически значимые различия отмечены на рисунках: «*» – при доверительном интервале p <0.05, «***» – при p <0.001 и «n.s.» – различия статистически не значимы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для поиска низкомолекулярных соединений, модулирующих активность белков STIM2, использовали созданную на основе клеток линии НЕК293 модельную клеточную линию, стабильно экспрессирующую экзогенные белки STIM2 и Orai3 (клеточная линия STIM2Orai3) (рис. 1А). Эффект влияния тестовых соединений на амплитуду кальциевого сигнала клеток в ответ на опустошение внутриклеточных кальциевых депо регистрировали с помощью флуоресцентного зонда Fluo-4 AM. Опустошение внутриклеточных кальциевых депо достигалось путем добавления во внеклеточный раствор 1 мкМ тапсигаргина (Tg), селективного блокатора кальциевых помп эндоплазматического ретикулума. На первом этапе тестировали действие библиотеки аналогов соединения 2-APB на Tg-индуцированный кальциевый ответ. С этой целью клетки инкубировали в растворе HBSS, содержащем каждое из 250 исследуемых соединений (в концентрации 100 мкМ) в течение 30 мин перед началом экспериментов, в которых оценивали амплитуду кальциевого ответа на приложение 1 мкМ Tg. В результате скрининга библиотеки отобрали химическое соединение 4-MPTC (рис. 1В), наиболее сильно влияющее на Tg-индуцированный кальциевый ответ в клетках STIM2Orai3. Кальциевый ответ клеток был подавлен на 39 ± 3% по сравнению с клетками, инкубированными в растворе, содержащем 1% DMSO (рис. 2А). Поскольку соединение 4-MPTC существенно подавляет Tg-индуцированный кальциевый ответ в клетках с повышенной экспрессией белков STIM2 и Orai3, то можно полагать, что 4-MPTC модулирует активность именно этих белков. В пользу непосредственного действия 4-MPTC на Orai3 может говорить и тот факт, что соединение 2-APB способно активировать канал Orai3 [27]. Для проверки влияния соединения 4-MPTC на каналы Orai3 использовали клеточную линию НЕК293 с нокаутом белка Orai3 (клеточная линия Orai3 KO). Инкубация клеток Orai3 KO с 4-MPTC изменяла форму Tg-индуцированного кальциевого ответа и снижала его амплитуду на 12 ± 3% (рис. 2Б). Более того, в клеточной линии НЕК293 с экспрессией экзогенных белков STIM1 и Orai3 (клеточная линия STIM1Orai3) инкубация клеток с соединением 4-MPTC не подавляет амплитуду Tg-индуцированного кальциевого ответа (рис. 2Б), а значит, и не уменьшает активность каналов Orai3. Следовательно, белок Orai3 не является селективной мишенью соединения 4-MPTC.

Рис. 2. Влияние соединения 4-MPTC на Tg-индуцированный кальциевый ответ в клеточных линиях с экспрессией экзогенных белков STIM2 и Orai3 (А), STIM1 и Orai3 (Б) и с подавлением экспрессии белка Orai3 (В). Показана зависимость флуоресценции Fluo-4 от времени, нормированная на базальный уровень флуоресценции. До начала эксперимента клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе HBSS с добавлением 100 мкМ 4-MPTC. Контрольные клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе HBSS с добавлением 1% DMSO. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 12)

Известно, что активность депо-управляемых каналов в клетке может модулироваться как белками STIM1, так и белками STIM2 [8]. Изменяя уровень экспрессии данных белков, можно управлять преобладающим путем активации депо-управляемого входа либо через белок STIM1, либо через STIM2. Для проверки действия соединения 4-MPTC на белок STIM1 использовали клеточную линию НЕК293 с экспрессией экзогенных белков STIM1 и Orai3. Как было сказано выше, инкубация клеток STIM1Orai3 с соединением 4-MPTC меняет форму, но не подавляет амплитуду Tg-индуцированного кальциевого ответа (рис. 2Б). Поскольку в клеточной линии STIM2Orai3 соединение 4-MPTC существенно уменьшало амплитуду кальциевого ответа, но не изменяло форму кривой (рис. 2А), можно предположить, что на путь активации депо-управляемого входа это соединение действует через белок STIM2, но не через STIM1. Изменение формы кривой в клеточных линиях Orai3 KO и STIM1Orai3 достаточно характерно и отражает уменьшение скорости развития кальциевого ответа. Поскольку в клетках Orai3 KO и STIM1Orai3 присутствует эндогенный белок STIM2 (рис. 1Б), соединение 4-MPTC может уменьшить активность этого белка и тем самым изменить динамику как выброса кальция из депо в цитоплазму, так и входа внеклеточного кальция. Аналогичное влияние на кальциевый ответ оказывает нокаут белка STIM2 с применением коротких интерферирующих РНК, который уменьшает и выброс кальция из депо [33], и последующий вход [4, 34]. Клеточные линии со сверхэкспрессией белков STIM (STIM1Orai3, STIM2Orai3) содержат эндогенные белки STIM1 и STIM2 (рис. 1А,Б), что затрудняет интерпретацию результатов. Поэтому в дальнейших исследованиях использовали клеточные линии с нокаутом белков STIM1 (клеточная линия STIM1 КО) и STIM2 (клеточная линия STIM2 КО), которые лишены этого недостатка (рис. 1А,Б).

При полном подавлении экспрессии STIM1 белок STIM2 становится ключевым и единственным активатором депо-управляемого входа кальция [4]. Предварительное инкубирование клеток STIM1 КО с 4-MPTC уменьшало на 57 ± 8% Tg-индуцированный кальциевый ответ по сравнению с контролем (инкубация с 1% DMSO) (рис. 3А). Необходимо отметить, что в этих условиях 4-MPTC более эффективно подавляет депо-управляемый вход кальция. Так, в клеточной линии STIM1 КО Tg-индуцированный ответ был подавлен на 57%, тогда как в клетках STIM2Orai3 подавление составило 39%. В клетках с нокаутом белка STIM2, в которых единственным активатором депо-управляемого входа кальция является белок STIM1, наблюдается существенное изменение формы кривой Tg-индуцированного ответа после инкубации с соединением 4-MPTC, концентрация кальция увеличивается медленнее, чем в контрольных клетках, но максимальная амплитуда кальциевого ответа выше на 61 ± 5% (рис. 3Б). Экспериментально показано, что соединение 4-MPTC в клеточных линиях STIM1 КО и STIM2 КО действует разнонаправленно, ингибируя кальциевый ответ через STIM2-зависимые пути и увеличивая его через STIM1-зависимые пути. Таким образом, отобранное нами соединение 4-MPTC обеспечивает возможность разделения путей активации депо-управляемого входа через различные белки STIM, но механизм действия этого соединения требует уточнения.

Рис. 3. Влияние соединения 4-MPTC на Tg-индуцированный кальциевый ответ в клеточных линиях с подавлением экспрессии белка STIM1 (А) и STIM2 (Б). Показана зависимость флуоресценции Fluo-4 от времени, нормированная на базальный уровень флуоресценции. До начала эксперимента клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе HBSS с добавлением 100 мкМ 4-MPTC. Контрольные клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе HBSS с добавлением 1% DMSO. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 12)

Соединение 4-MPTC имеет характерную кривую зависимости эффекта действия от концентрации (рис. 4). Изучено действие 4-MPTC в концентрации 0.001, 0.1, 1, 10 и 100 мкМ на Tg-индуцированный кальциевый ответ в клетках STIM2Orai3. Величина концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) составляет 1 мкМ и рассчитана по аппроксимирующей кривой.

Таким образом, из представленных выше результатов можно заключить, что в клеточных линиях с преобладающим количеством белка STIM2 (STIM1 КО, STIM2Orai3) применение 4-MPTC существенно подавляет амплитуду кальциевого ответа на Tg. А в клеточных линиях с преобладающим количеством белка STIM1 (STIM2 КО, STIM1Orai3) соединение 4-MPTC изменяет форму кривой кальциевого ответа без уменьшения его амплитуды. Т.е. соединение 4-MPTC селективно подавляет вход кальция при депо-управляемом входе через STIM2-зависимый, но не через STIM1-зависимый путь.

Рис. 4. Зависимость амплитуды Tg-индуцированного кальциевого ответа от концентрации соединения 4-MPTC в клеточной линии, экспрессирующей экзогенные белки STIM2 и Orai3. Показано значение флуоресценции Fluo-4 на 9-й мин эксперимента, нормированное на базальный уровень флуоресценции. До начала эксперимента клетки инкубировали в течение 30 мин с различными концентрациями 4-MPTC (0.001, 0.1, 1, 10 и 100 мкМ). Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 6). Пунктиром обозначены уровень подавления на 50% от максимального и концентрация полумаксимального ингибирования (IC50 = 1 мкМ)

Несмотря на то что соединение 2-APB широко применяется как блокатор депо-управляемого входа кальция, оно недостаточно селективно подавляет депо-зависимый вход, а кроме того, имеет разнонаправленный эффект в зависимости от концентрации. В поисках блокатора, лишенного перечисленных недостатков, исследуют производные 2-APB [35–41]. Большинство найденных соединений подавляют депо-управляемый вход в меньших концентрациях, чем 2-APB, а также лишены способности активировать вход кальция при определенных концентрациях, иными словами, обладают лучшими блокирующими свойствами, чем исходное соединение. При поиске новых блокаторов депо-управляемого входа большее внимание уделяется STIM1-зависимому пути активации депо-управляемого входа, а STIM2-зависимый путь часто остается неисследованным. Например, в качестве модельных используют клетки линии MDA-MB-231, где ключевую роль в депо-зависимом входе играют белки STIM1 и Orai1, либо клетки НЕК293, экспрессирующие STIM1 и белки семейства Orai [42, 43]. Исследование соединений DPB163-AE и DPB162-AE показало, что они по-разному взаимодействуют со STIM1 и STIM2, но в результате подавляют депо-зависимый вход через оба эти белка [37]. Обнаруженное нами соединение 4-MPTC обладает ингибирующим эффектом на STIM2-зависимый путь, но не подавляет вход кальция через STIM1-зависимый путь.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Скрининг библиотеки аналогов соединения 2-APB клеток позволил отобрать соединение 4-MPTC, которое оказывает ингибирующий эффект на Tg-индуцированный кальциевый ответ клеток через STIM2-зависимый путь поступления кальция, но не подавляет вход кальция через STIM1-зависимый путь. Механизм действия этого соединения на белок STIM2 требует дальнейшего уточнения.

Работа поддержана грантами РФФИ № 17-54-80006 (АС, АГ, ЛГ, ЕК) и РНФ № 19-14-00114 (АС, АШ, ЕК).

×

Об авторах

Антон Юрьевич Скопин

Институт цитологии РАН

Email: anton_skopin@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Андрей Дмитриевич Григорьев

Институт цитологии РАН

Email: andreygrig425@gmail.com
Россия, Санкт-Петербург

Любовь Николаевна Глушанкова

Институт цитологии РАН

Email: glushankova@hotmail.com
Россия, Санкт-Петербург

Алексей Вадимович Шалыгин

Институт цитологии РАН

Email: shalygin.alexey@gmail.com
Россия, Санкт-Петербург

Г. Ванг

Университет Сучжоу Колледж фармакологических наук

Email: wanggh@suda.edu.cn
Китайская республика, Сучжоу

Виктор Георгиевич Карцев

ИнтерБиоСкрин (InterBioScreen Ltd.)

Email: vkartsev@ibscreen.chg.ru
Россия, Черноголовка

Елена Валентиновна Казначеева

Институт цитологии РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: evkazn@incras.ru
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Putney J.W. // Cell Calcium 1986. V. 7. № 1. P. 1–12.
  2. Yao Y., Tsien R.Y. // J. Gen. Physiol. 1997. V. 109. № 6. P. 703–715.
  3. Zhang S.L., Yu Y., Roos J., Kozak J.A., Deerinck T.J., Ellisman M.H., Stauderman K.A., Cahalan M.D. // Nature. 2005. V. 437. № 7060. P. 902–905.
  4. Liou J., Kim M.L., Heo W.D., Jones J.T., Myers J.W., Ferrell J.E., Meyer T. // Curr. Biol. 2005. V. 15. № 13. P. 1235–1241.
  5. Stathopulos P.B., Zheng L., Li G., Plevin M.J., Ikura M. // Cell. 2008. V. 135. № 1. P. 110–122.
  6. Brandman O., Liou J., Park W.S., Meyer T. // Cell. 2007. V. 131. № 7. P. 1327–1339.
  7. Ong H.L., De Souza L.B., Zheng C., Cheng K.T., Liu X., Goldsmith C.M., Feske S., Ambudkar I.S. // Sci. Signaling. 2015. V. 8. № 359. P. 3.
  8. Shalygin A., Skopin A., Kalinina V., Zimina O., Glushankova L., Mozhayeva G.N., Kaznacheyeva E. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. № 8. P. 4717–4727.
  9. Prakriya M. // Curr. Topics Membranes. 2013. V. 71. P. 1–32.
  10. Prakriya M., Feske S., Gwack Y., Srikanth S., Rao A., Hogan P.G. // Nature. 2006. V. 443. № 7108. P. 230–233.
  11. Skopin A., Shalygin A., Vigont V., Zimina O., Glushankova L., Mozhayeva G.N., Kaznacheyeva E. // Biochimie. 2013. V. 95. № 2. P. 347–353.
  12. Kaznacheyeva E., Glushankova L., Bugaj V., Zimina O., Skopin A., Alexeenko V., Tsiokas L., Bezprozvanny I., Mozhayeva G.N. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 32. P. 23655–23662.
  13. Cheng K.T., Ong H.L., Liu X., Ambudkar I.S. // Adv. Exp. Med. Biol. 2011. V. 704. P. 435–449.
  14. Vigont V., Kolobkova Y., Skopin A., Zimina O., Zenin V., Glushankova L., Kaznacheyeva E. // Front. Physiol. 2015. V. 6. P. 337.
  15. Nekrasov E.D., Vigont V.A., Klyushnikov S.A., Lebedeva O.S., Vassina E.M., Bogomazova A.N., Chestkov I.V., Semashko T.A., Kiseleva E., Suldina L.A., et al. // Mol. Neurodegen. 2016. V. 11. P. 27.
  16. Ryazantseva M., Skobeleva K., Glushankova L., Kaznacheyeva E. // J. Neurochem. 2016. V. 136. № 5. P. 1085–1095.
  17. Ryazantseva M., Skobeleva K., Kaznacheyeva E. // Biochimie. 2013. V. 95. № 7. P. 1506–1509.
  18. Berna-Erro A., Braun A., Kraft R., Kleinschnitz C., Schuhmann M.K., Stegner D., Wultsch T., Eilers J., Meuth S.G., Stoll G., Nieswandt B. // Sci. Signaling. 2009. V. 2. № 93. P. ra67.
  19. Rao W., Zhang L., Peng C., Hui H., Wang K., Su N., Wang L., Dai S.H., Yang Y.F., Chen T., Luo P., Fei Z. // Biochim. Biophys. Acta – Mol. Basis Dis. 2015. V. 1852. № 11. P. 2402–2413.
  20. Hou P.F., Liu Z.H., Li N., Cheng W.J., Guo S.W. // Cell. Mol. Neurobiol. 2015. V. 35. № 2. P. 283–292.
  21. Miao Y., Shen Q., Zhang S., Huang H., Meng X., Zheng X., Yao Z., He Z., Lu S., Cai C., Zou F. // Breast Cancer Res. 2019. V. 21. № 1. P. 99.
  22. Sobradillo D., Hernández-Morales M., Ubierna D., Moyer M.P., Núñez L., Villalobos C. // J. Biol. Chem. 2014. V. 289. № 42. P. 28765–28782.
  23. Maruyama T., Kanaji T., Nakade S., Kanno T., Mikoshiba K. // J. Biochem. 1997. V. 122. № 3. P. 498–505.
  24. Prakriya M., Lewis R.S. // J. Physiol. 2001. V. 536. № 1. P. 3–19.
  25. Hu H.Z., Gu Q., Wang C., Colton C.K., Tang J., Kinoshita-Kawada M., Lee L.Y., Wood J.D., Zhu M.X. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 34. P. 35741–35748.
  26. Singh A.K., Saotome K., McGoldrick L.L., Sobolevsky A.I. // Nat. Commun. 2018. V. 9. № 1. P. 2465.
  27. Schindl R., Bergsmann J., Frischauf I., Derler I., Fahrner M., Muik M., Fritsch R., Groschner K., Romanin C. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. № 29. P. 20261–20267.
  28. Missiaen L., Callewaert G., De Smedt, H. Parys J.B. // Cell Calcium. 2001. V. 29. № 2. P. 111–116.
  29. Soboloff J., Rothberg B.S., Madesh M., Gill D.L. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012. V. 13. № 9. P. 549–565.
  30. Emrich S.M., Yoast R.E., Xin P., Zhang X., Pathak T., Nwokonko R., Gueguinou M.F., Subedi K.P., Zhou Y., Ambudkar I.S., et al. // J. Biol. Chem. 2019. V. 294. № 16. P. 6318–6332.
  31. Wei M., Zhou Y., Sun A., Ma G., He L., Zhou L., Zhang S., Liu J., Zhang S.L., Gill D.L. Wang Y. // Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 2016. V. 468. № 11–12. P. 2061–2074.
  32. Parvez S., Beck A., Peinelt C., Soboloff J., Lis A., Monteilh-Zoller M., Gill D.L., Fleig A., Penner R. // FASEB J. 2008. V. 22. № 3. P. 752–761.
  33. Thiel M., Lis A., Penner R. // J. Physiol. 2013. V. 591. № 6. P. 1433–1445.
  34. Bird S., Hwang S.Y., Smyth J.T., Fukushima M., Boyles R.R., Putney J.W. // Curr. Biol. 2009. V. 19. № 20. P. 1724–1729.
  35. Djillani A., Doignon I., Luyten T., Lamkhioued B., Gangloff S.C., Parys J.B., Nüße O., Chomienne C., Dellis O. // Cell Calcium. 2015. V. 58. № 2. P. 171–185.
  36. Djillani A., Nüße O., Dellis O. // Biochim. Biophys. Acta – Mol. Cell Res. 2014. V. 1843. № 10. P. 2341–2347.
  37. Goto J.I., Suzuki A.Z., Ozaki S., Matsumoto N., Nakamura T., Ebisui E., Fleig A., Penner R., Mikoshiba K. // Cell Calcium. 2010. V. 47. № 1. P. 1–10.
  38. Hendron E., Wang X., Zhou Y., Cai X., Goto J.I., Mikoshiba K., Baba Y., Kurosaki T., Wang Y., Gill D.L. // Cell Calcium. 2014. V. 56. № 6. P. 482–492.
  39. Zhou H., Iwasaki H., Nakamura T., Nakamura K., Maruyama T., Hamano S., Ozaki S., Mizutani A., Mikoshiba K. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 352. № 2. P. 277–282.
  40. Hofer A., Kovacs G., Zappatini A., Leuenberger M., Hediger M.A., Lochner M. // Bioorg. Med. Chem. 2013. V. 21. № 11. P. 3202–3213.
  41. Dellis O., Mercier P., Chomienne C. // BMC Pharmacol. 2011. V. 11. P. 1.
  42. Schild A., Bhardwaj R., Wenger N., Tscherrig D., Kandasamy P., Dernič J., Baur R., Peinelt C., Hediger M.A., Lochner M. // Internat. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 16. P. 1–28.
  43. Wang X., Wang Y., Zhou Y., Hendron E., Mancarella S., Andrake M.D., Rothberg B.S., Soboloff J., Gill D.L. // Nat. Commun. 2014. V. 5. P. 3183.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Уровень экспрессии белков STIM в клеточных линиях STIM1Orai3, STIM2Orai3, Orai3 КО, STIM1 КО и STIM2 КО. А – иммуноблотинг с использованием антител против STIM1. Б – иммуноблотинг с использованием антител против STIM2. Для оценки равномерности нанесения проб представлены данные по окрашиванию проб антителами к α-тубулину. В – структурная формула химического соединения 4-MPTC

Скачать (224KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Влияние соединения 4-MPTC на Tg-индуцированный кальциевый ответ в клеточных линиях с экспрессией экзогенных белков STIM2 и Orai3 (А), STIM1 и Orai3 (Б) и с подавлением экспрессии белка Orai3 (В). Показана зависимость флуоресценции Fluo-4 от времени, нормированная на базальный уровень флуоресценции. До начала эксперимента клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе HBSS с добавлением 100 мкМ 4-MPTC. Контрольные клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе HBSS с добавлением 1% DMSO. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 12)

Скачать (204KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Влияние соединения 4-MPTC на Tg-индуцированный кальциевый ответ в клеточных линиях с подавлением экспрессии белка STIM1 (А) и STIM2 (Б). Показана зависимость флуоресценции Fluo-4 от времени, нормированная на базальный уровень флуоресценции. До начала эксперимента клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе HBSS с добавлением 100 мкМ 4-MPTC. Контрольные клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе HBSS с добавлением 1% DMSO. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 12)

Скачать (169KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Зависимость амплитуды Tg-индуцированного кальциевого ответа от концентрации соединения 4-MPTC в клеточной линии, экспрессирующей экзогенные белки STIM2 и Orai3. Показано значение флуоресценции Fluo-4 на 9-й мин эксперимента, нормированное на базальный уровень флуоресценции. До начала эксперимента клетки инкубировали в течение 30 мин с различными концентрациями 4-MPTC (0.001, 0.1, 1, 10 и 100 мкМ). Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 6). Пунктиром обозначены уровень подавления на 50% от максимального и концентрация полумаксимального ингибирования (IC50 = 1 мкМ)

Скачать (223KB)
Метаданные

© Скопин А.Ю., Григорьев А.Д., Глушанкова Л.Н., Шалыгин А.В., Ванг Г., Карцев В.Г., Казначеева Е.В., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах