Citrobacter freundii метионин–γ-лиаза: роль серина 339 в катализе реакций γ- и β-элиминирования

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МГЛ – метионин–γ-лиаза; ПЛФ – пиридоксаль-5’-фосфат; ЛДГ – лактатдегидрогеназа; HOHxoDH – D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназа.

ВВЕДЕНИЕ

Пиридоксаль-5’-фосфат (ПЛФ)-зависимые ферменты определяют жизнедеятельность большинства про- и эукариот. Особенностью этих биокатализаторов является возможность осуществления широкого спектра химических превращений аминокислот и аминов с участием кофактора. Субстратная и реакционная специфичности каждого конкретного фермента обеспечиваются взаимодействием кофактора и субстрата с апоферментом. Исследования ПЛФ-зависимых ферментов и данные рентгеноструктурного анализа позволили существенно продвинуть знания о взаимоотношении структура–функция в ферментативном катализе и еще в 1995 году использовать рациональный дизайн для изменения субстратной специфичности в ПЛФ-зависимом катализе [1]. Определение кристаллических структур ПЛФ-зависимых ферментов, принадлежащих к различным классам, способствовало расширению знания о критических остатках для химически различных ферментативных реакций и формулировке ряда принципиальных идей в области биокатализа. Замена коферментсвязывающей белковой матрицы на матрицу суперсемейства иммуноглобулинов показала правильность основных выводов о механизмах превращений аминокислот этими ферментами и возможности предсказания изменения ферментативной активности [2–5].

Метионин–γ-лиаза (МГЛ, [КФ 4.4.1.11]) – ПЛФ-зависимый фермент, катализирующий реакции γ-элиминирования L-метионина, β-элиминирования L-цистеина и их S-замещенных производных, а также реакции γ- и β-замещения L-метионина, L-цистеина и их аналогов [6, 7]. Фермент найден у патогенных простейших [8, 9], в ряде бактерий, в том числе патогенных [10–14], грибах [15] и растениях [16].

Недавно нами было показано, что МГЛ катализирует реакцию β-элиминирования сульфоксидов S-замещенных аналогов цистеина с образованием тиосульфинатов [17, 18]. Антибактериальная активность тиосульфинатов, получаемых «фармакологической парой» МГЛ/сульфоксид S-замещенного L-цистеина, показана in vitro против ряда бактерий [18–20] и in vivo против Pseudomonas aueroginosa [21]. Перспективность применения фермента в качестве противоопухолевого агента показана in vitro и in vivo [22–25].

Механизмы физиологической реакции и реакций β-элиминирования и замещения, катализируемых МГЛ, мало исследованы. Исследование этих механизмов вносит вклад не только в фундаментальную энзимологию, оно необходимо для создания новых антибактериальных и противоопухолевых препаратов.

МГЛ принадлежит к структурному подклассу цистатионин–β-лиазы с типом укладки I полипептидной цепи ПЛФ-зависимых ферментов [26]. В тетрамерной молекуле МГЛ, образованной четырьмя идентичными полипептидными цепями, две субъединицы формируют два так называемых «каталитических димера», в каждом из которых аминокислотные остатки из двух субъединиц образуют два активных центра [27, 28].

Определение трехмерных структур комплексов МГЛ с конкурентными ингибиторами, глицином [29], циклосерином [30] и норлейцином [31, 32] показало, что остаток активного центра фермента, Ser339, консервативный в подклассе цистатионин–β-лиазы, участвует, по всей вероятности, в оптимальной для катализа ориентации боковой группы Lys210, связывающей кофермент.

Для изучения роли остатка Ser339 в катализе реакций γ- и β-элиминирования методом сайт-направленного мутагенеза получена мутантная форма фермента с заменой Ser339Ala, определены пространственная структура холофермента, стационарные кинетические параметры реакций γ- и β-элиминирования ряда субстратов, скорости обмена С-α- и С-β-протонов аминокислот в комплексах Ser339Ala МГЛ с ингибиторами и спектральные характеристики мутантной формы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы и материалы

В работе использованы: L-метионин, L-норвалин, L-норлейцин, L-α-аминомасляная кислота, глицин, L-аланин, L-гомосерин, L-гомоцистеин, L-фенилаланин, DL-пеницилламин, фенилметилсульфонилфторид, лактатдегидрогеназа из мышцы кролика (ЛДГ), дитиотреитол (ДТТ), NADH и D₂O (Sigma, США); пиридоксаль-5’-фосфат (Merck, Германия); S-этил-L-цистеин, S-метил-L-цистеин, S-бензил-L-цистеин, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDТА), протаминсульфат, додецилсульфат натрия (SDS) (Serva, США); лактоза (Panreac, Испания); глюкоза, глицерин, сульфат магния, сульфат аммония, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, уксусная кислота, уксусный ангидрид, триэтаноламин, HClO₄ («Реахим», Россия); дрожжевой экстракт, триптон (Difco, США); DEAE-целлюлоза (Whatmann, Англия); супердекс 200 (Amersham Biosciences, Швеция); плазмиды Bluescript II SK(+/-) и pET28 (Novagen, США); набор для выделения ДНК, эндонуклеазы рестрикции Bsp119I и BveI (Fermentas, Литва). О-Ацетил-L-гомосерин получен ацетилированием L-гомосерина [33]; D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназа (HOHxoDH) получена согласно [34].

Сайт-направленный мутагенез

Сайт-направленный мутагенез проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы использовали плазмиду mglBlue, полученную клонированием гена МГЛ в вектор Bluescript II SK(+/-). Для замены Ser339 на Ala использовали следующие синтетические олигонуклеотиды (F – прямой праймер, R – обратный праймер):

(F) TATCAGCTTCGAATCGCTGGC,

(RS339/A) GTATCACCGAGAGCGACCGCGA,

(FS339/A) TCGCGGTCGCTCTCGGTGATAC,

(R) ATACCTGCTTTAAGCCGCTCTTCTGGCGCA.

После проведения ПЦР из реакционной смеси выделяли ампликон (использовали набор для выделения ДНК). Очищенный препарат ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Bsp119I и BveI и лигировали с вектором mglBlue, обработанным этими же ферментами. Полученную смесь трансформировали электропорацией в клетки Escherichia coli DH10B и выращивали на твердой среде (1.8% агар на среде Лурия–Бертани (LB) с ампициллином). Выращенные колонии переносили в жидкую среду LB с добавлением ампициллина и растили в течение 15–18 ч. Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора для выделения плазмид и идентифицировали путем аналитической рестрикции. Фрагмент, содержащий замену Ser339Ala, был переклонирован из плазмиды mglBlue в pET28. Точность клонирования контролировали путем секвенирования вставки ДНК (ЦКП «Геном», Москва). Клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой, содержащей необходимую вставку.

Выращивание бактериальной массы и очистка фермента

Клетки E. coli BL21(DE3), содержащие плазмиду с геном мутантной формы, выращивали и очищали фермент как описано ранее [35]. Концентрацию очищенных препаратов фермента определяли по поглощению при 278 нм, используя коэффициент поглощения A_1см^0.1% = 0.8 [36].

Гомогенность препаратов проверяли ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях [37]. Активность в процессе очистки определяли в реакции β-элиминирования, активность конечного препарата определяли в реакциях β- и γ-элиминирования. Реакционная смесь содержала 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 8.0, 0.1 мМ ПЛФ, 1 мМ ДТТ, 0.2 мМ NADH, 10 ед. ЛДГ и 30 мМ S-этил-L-цистеин (реакция β-элиминирования) или 70 мкг HOHxoDH и 30 мМ L-метионин (реакция γ-элиминирования). За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1.0 мкМ/мин кетокислоты. Удельная активность препаратов фермента 95%-ной чистоты была равна 0.31 ед/мг в реакции γ-элиминирования L-метионина и 1.03 ед/мг в реакции β-элиминирования S-этил-L-цистеина.

Кинетические исследования

Кинетические параметры реакций γ- и β-элиминирования определяли при 30°C в сопряженной реакции с HOHxoDH или ЛДГ по уменьшению поглощения NADH при 340 нм (ε = 6220 M^–1cм^–1). Реакционные смеси содержали 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 8.0, 0.1 мМ ПЛФ, 1 мМ ДТТ, 0.2 мМ NADH, 70 мкг HOHxoDH или 10 ед. ЛДГ и варьируемые количества субстратов в общем объеме 1 мл. Реакцию инициировали добавлением 10 мкг фермента.

Ингибирование реакции γ-элиминирования L-метионина различными аминокислотами исследовали в условиях, описанных выше, варьируя количества ингибитора в пробах.

Кинетические параметры обрабатывали согласно уравнению Михаэлиса–Ментен, используя программу EnzFitter [38]. В расчетах использовали величину молекулярной массы субъединицы фермента, равную 43 кДа. Значения констант ингибирования также определяли с помощью программы EnzFitter [38].

Изотопный обмен C-α- и C-β-протонов ингибиторов в комплексах с ферментом

Кинетику реакций изотопного обмена C-α- и C-β-протонов ингибиторов на дейтерон, катализируемых мутантной формой, регистрировали с помощью ¹H-ЯМР-спектроскопии. Реакцию проводили в D₂O, содержащей 50 мМ калий-фосфат (pD = 7.6), 0.1 мM ПЛФ и ингибитор в общем объеме 0.5 мл при 30°C и концентрации L-аланина и L-норлейцина 144.23 и 98.04 мМ. Реакцию инициировали, добавляя 0.3–0.7 мг фермента. Спектры ¹Н-ЯМР записывали через определенные интервалы времени на спектрометре Bruker AMXIII-400 c рабочей частотой 400 МГц. Сигналы С-α- и С-β-протонов интегрировали с помощью модифицированной программы автоматизации enzkin, входящей в состав XWIN_NMR-программ. Кинетические кривые накопления дейтерированных продуктов обрабатывали по методу, описанному в [39].

Изотопный обмен протонов глицина проводили в D₂O, pD = 7.6, содержащей 50 мМ калий-фосфат, 0.1 мM ПЛФ, 60 мг глицина и 3.6 мг фермента. После инкубирования в течение 72 ч при 30°C фермент инактивировали нагреванием (90°C, 5 мин) и отделяли центрифугированием. Растворитель удаляли на роторном испарителе. Для определения конфигурации у C-α-атома дейтерированный продукт был превращен в дипептид, L-фенилаланил-[D]-глицин в реакции с Boc-L-Phe-ONp [40, 41]. Дипептид растворяли в 0.5 мл D₂O, и ¹Н-ЯМР-спектр записывали на спектрометре Вruker AMXIII-400 с рабочей частотой 400 МГц.

Спектральные исследования

Спектры поглощения холофермента и его комплекса с метионином регистрировали при 25°С на спектрофотометре Cary-50 (Varian, США) в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ, 1 мМ EDТА, 20 мМ L-метионина при концентрации фермента 1 мг/мл.

Получение холофермента и апофермента

Апофермент и холофермент получали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ, 1 мМ EDТА. Холофермент получали добавлением 50-кратного молярного избытка ПЛФ. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 25°C. Избыток ПЛФ удаляли диализом. Для получения апофермента к препарату добавляли 100-кратный молярный избыток DL-пеницилламина [42]. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 25°C. DL-пеницилламин удаляли диализом. Процедуру повторяли до тех пор, пока активность фермента не снизилась до 1% от начальной. Содержание ПЛФ в препарате определяли в 100 мМ NaOH, используя значение молярного коэффициента поглощения ПЛФ при 390 нм, равное 6600 M^–1 cм^–1 [43].

Определение константы диссоциации кофермента

Для определения константы диссоциации ПЛФ использовали метод ультрафильтрации [44]. Варьируемые количества ПЛФ (в диапазоне 5 × 10⁻³–1.2 × 10⁻¹ мM) добавляли к 8 × 10⁻³ мM раствору апофермента в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ и 1 мМ EDТА. После 30 мин инкубации при 30°C свободный ПЛФ отделяли ультрафильтрацией на Centricon-30 microconcentrator (Amicon, США) центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об/мин и 4°C. Содержание ПЛФ в каждой пробе определяли в 100 мМ NaOH. Данные обрабатывали в координатах Скэтчарда [45].

Кристаллизация и сбор данных

Кристаллы МГЛ Ser339Ala получали методом диффузии паров в висящей капле в условиях, приведенных в [28]. Кристаллы, пригодные для сбора дифракционных данных, образовывались в течение 10 дней и имели ромбическую форму. Дифракционные данные были собраны на источнике синхротронного излучения, линия BESSY BEAMLINE 14.1 (Берлин, Германия), с использованием детектора MARMOSAIC 225 mm CCD при 100 К и обработаны в программном комплексе XDS [46] (табл. 1).

 

Таблица 1. Статистические характеристики дифракционных данных и уточненной структуры Ser339Ala МГЛ

Пространственная группа	I222
Параметры элементарной ячейки, Å	a = 56.66, b = 123.09, c = 128.79 α = β = γ = 90°
Длина волны, Å	0.91841
Разрешение, Å	30.0–1.70 (1.79–1.70)
Полнота набора, %	99.4 (97.5)
Избыточность	7.0 (6.3)
Rmerge, %	4.5 (34.9)
Неупорядоченные аминокислотные остатки в структуре белка	1, 46–61, 398
Число неводородных атомов белка	2879
Число молекул воды	393
Число уникальных отражений	49574 (7001)
R/ Rfree	0.173/0.205 (0.243/0.285)
Средний температурный фактор B, Å макромолекулы растворителя	29.28 27.51 41.64
Среднеквадратическое отклонение от идеальных значений
длин связей	0.007 Å
валентных углов	1.095°
хиральных углов	0.047°
планарных углов	0.005°
Область расположения аминокислотных остатков на карте Рамачандрана
наиболее предпочтительная, %	98.64
дополнительно разрешенная, %	1.36
допустимая, %	0.0

Примечание. В скобках приведены значения для слоя высокого разрешения.

 

Определение и уточнение пространственной структуры Ser339Ala МГЛ

Структура МГЛ Ser339Ala решена методом молекулярного замещения с помощью программного комплекса CCP4 [47] и использованием в качестве модели определенной нами ранее структуры C. freundii МГЛ (1.35 Å, код PDB 2RFV), из которой были исключены подвижные участки фермента, молекулы воды и кофермент. Для полученной модели была рассчитана карта электронной плотности. Дальнейший расчет структуры проводили с использованием протоколов уточнения Phenix [48] с минимизацией энергии и оптимизацией геометрии модели с последующей ручной правкой в программе COOT [49]. Процесс уточнения контролировали с использованием фактора достоверности модели R_free, рассчитанный по 5% отражений, исключенных из уточнения. Окончательная модель уточнена до разрешения 1.70 Å с показателями R_work и R_free 17.3 и 20.5%. Модель содержит 2879 неводородных атомов белка и 393 молекулы воды; боковая группа остатка Lys210 ковалентно связана с ПЛФ. Для трех цистеинов (Cy4, Cys193 и Cys245) возле атома серы наблюдалась избыточная электронная плотность, что позволило сделать вывод об их окисленных состояниях и заменить на 3-сульфеноаланины. Структура депонирована в банк данных белковых структур (код PDB 5D5S), статистика уточнения структуры приведена в табл. 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Механизм реакций γ- и β-элиминирования, приведенный на схеме, предложен в работах [50, 51]. Благодаря наличию кофермента, ПЛФ-зависимые ферменты обладают уникальными спектральными свойствами, позволяющими идентифицировать интермедиаты ферментативной реакции. Основные полосы поглощения внутреннего альдимина и интермедиатов реакций γ- и β-элиминирования приведены на схеме согласно [52].

В ПЛФ-зависимых ферментах, катализирующих разнообразные реакции, начинающиеся с отрыва С-α-протона во внешнем альдимине, основанием, акцептирующим этот протон, является остаток лизина, связывающий кофермент. Предполагается, что в реакции β-элиминирования серосодержащих аминокислот, катализируемых ферментами подкласса цистатионин–β-лиазы, коферментсвязывающий остаток лизина является также общим кислотным катализатором на стадии элиминирования уходящей группы [51, 53].

В работе [54] авторы предположили, что коферментсвязывающий остаток лизина цистатионин–γ-лиазы переносит протон от С-α-атома к C4’-атому ПЛФ. Исходя из структурных данных сделан вывод, что боковая цепь этого остатка может «качаться как лиана» между С-α-, C4’- и С-β-атомами субстрата, а его ε-аминогруппа также является основанием, акцептирующим С-β-протон.

Анализ пространственной структуры комплекса C. freundii МГЛ с глицином, моделирующего структуру внешнего альдимина, позволил предположить, что ПЛФ-связывающий остаток Lys210 обеспечивает как 1,3-прототропный сдвиг С-α-протона, так и отрыв С-β-протона [29]. Исследование мутантной формы Pseudomonas putida МГЛ с заменой Tyr114 активного центра на Phe показало, что роль общего кислотного катализатора на стадии элиминирования уходящей группы, по всей вероятности, выполняет Tyr114 [55].

Анализ пространственных структур четырех интермедиатов, образующихся при взаимодействии МГЛ из Entamoeba hystolytica с L-метионином, позволил предложить механизм реакции γ-элиминирования, отличный от приведенной выше схемы, исключающий стадии двух хиноидных интермедиатов (схема, интермедиаты 3 и 9) [56]. Этот механизм постулирует образование α-аминокротоната вслед за β,γ-ненасыщенным кетимином в результате 1,5-сигматропного сдвига протона от С4’-атома к Сγ-атому, не требующего катализа.

 

Схема. Механизм реакций β- и γ-элиминирования, катализируемых ПЛФ-зависимыми ферментами

 

Параметры стационарной кинетики, ингибирование реакции γ-элиминирования и обмен С-α- и С-β-протонов в комплексах Ser339Ala МГЛ с ингибиторами

В табл. 2 приведены параметры стационарной кинетики реакций γ- и β-элиминирования, катализируемых МГЛ дикого типа [35, 36, 57] и мутантной формой. Замена остатка Ser339 на Аla привела к снижению скоростей реакций β-элиминирования в 5–10 раз и γ-элиминирования в 30–40 раз по сравнению с ферментом дикого типа. Величины K_М в большей степени увеличились для субстратов, содержащих уходящую группу в β-положении. Как результат, каталитическая эффективность обеих реакций снизилась одинаково, в среднем на два порядка. В случае субстратов с хорошо уходящей группой, каталитическая эффективность мутантной формы в реакции γ-элиминирования сравнима с эффективностью МГЛ дикого типа, но в реакции β-элиминирования O-Ac-L-Ser параметр k_кат/K_М меньше на два порядка.

 

Таблица 2. Кинетические параметры реакций γ- и β-элиминирования

Субстрат	МГЛ, дикий тип			МГЛ, Ser339Ala
	kкат, c-1	KМ, мМ	kкат/KМ, М-1c-1	kкат, c-1	KМ, мМ	kкат/KМ, М-1c-1
L-Met	6.2 ± 0.42*	0.7 ± 0.11*	8.85 × 103	0.21 ± 0.002	1.84 ± 0.15	1.77 × 102
DL-Hcy	8.51 ± 0.41*	0.97 ± 0.15*	8.77 × 103	0.28 ± 0.009	3.39 ± 0.34	8.25 × 101
S-Et-L-Hcy	6.78 ± 0.02*	0.54 ± 0.01*	1.25 × 104	0.16 ± 0.0016	0.54 ± 0.037	2.92 × 102
O-Ac-L-Hse	2.1 ± 0.053**	2.91 ± 0.18**	7.21 × 102	0.77 ± 0.011	2.07 ± 0.22	3.73 × 102
S-Me-L-Cys	4.6 ± 0.29*	0.71 ± 0.11*	6.48 × 103	0.41 ± 0.018	21.8 ± 2.25	1.88 × 101
S-Et-L-Cys	5.03 ± 0.16*	0.17 ± 0.02*	2.96 × 104	0.67 ± 0.024	6.47 ± 0.54	1.04 × 102
S-Bzl-L-Cys	8.16 ± 0.23*	0.18 ± 0.02*	4.53 × 104	1.81 ± 0.094	5.76 ± 0.59	3.14 × 102
O-Ac-L-Ser	2.13 ± 0.037***	4.28 ± 0.33***	4.98 × 102	0.047 ± 0.001	16.36 ± 1.09	2.87

*Данные [35].

**Данные [36].

***Данные [57].

 

Как и для дикого типа, для мутантной формы фермента глицин, L-аланин, L-α-аминомасляная кислота, L-норвалин, L-норлейцин являются конкурентными ингибиторами физиологической реакции. Величины констант ингибирования оказались сравнимыми с константами для МГЛ дикого типа (табл. 3).

 

Таблица 3. Ингибирование реакции γ-элиминирования L-метионина и кинетические параметры изотопного обмена С-α- и С-β-протонов ингибиторов

Aминокислота	МГЛ, дикий тип			МГЛ, Ser339Ala			Количество обмениваемых С-α- и С-β-протонов
	KИ, мМ	kоб, с-1 KМ = KП, мМ		KИ, мМ	kоб, с-1 KМ = KП, мМ
		α-H	β-H		α-H	β-H
Gly	48.49 ± 4.37*	20.2*	-	22.87 ± 2.84	0.078	-	1, pro-(R)-протон**
L-Ala	3.41 ± 0.40*	2.71*	2.63*	1.25 ± 0.32	0.387	0.116	1; 3
L-α-Abu	8.01 ± 0.76*	-	-	4.66 ± 0.51	-	-
L-Nva	4.60 ± 0.43*	-	-	1.7 ± 0.32	-	-
L-Nle	0.6 ± 0.06*	41.78*	4.74*	0.89 ± 0.09	0.46	0.12	1; 2

Примечание. K_И – константа ингибирования, K_М – константа Михаэлиса, K_П – константа ингибирования продуктом, характеризующая связывание фермента с продуктом изотопного обмена.

*Данные [36].

**Данные [40].

 

Данные изотопного обмена протонов субстратов и ингибиторов позволяют оценить вклад отдельных стадий в ферментативную реакцию и выяснить стереохимию обмена протонов. В табл. 3 приведены результаты исследования скоростей обмена С-α- и С-β-протонов ингибиторов, катализируемого МГЛ Ser339Ala в сравнении с МГЛ дикого типа. Замена привела к замедлению скоростей обмена С-α- и С-β-протонов ингибиторов. Скорость обмена С-α-протона в комплексах мутантной формы фермента с глицином и норлейцином по сравнению с комплексами фермента дикого типа уменьшилась на два порядка, скорости обмена С-β-протонов снизились на порядок.

Изучение стереоспецифичности обмена протонов глицина ферментом дикого типа показало, что соотношение скоростей обмена pro-(R)- и pro-(S)-протонов составляет 14000 : 1 [40]. Спектр ¹H-ЯМР дипептида L-фенилаланилглицин (данные не приведены), содержавшего глицин, выделенный после инкубации мутантной формы фермента с глицином в D₂O, содержал сигнал при 3.4 м.д., характерный для метиленового pro-(R)-протона глицина [41].

Нам не удалось обнаружить обмен pro-(S)-протона после инкубации мутантной формы с глицином в течение длительного времени, поскольку это приводило к инактивации МГЛ Ser339Ala. Полученные данные показали, что, как и фермент дикого типа, мутантная форма МГЛ преимущественно обменивает pro-(R)-протон.

Спектральные исследования

На рис. 1 приведены спектры поглощения холофермента Ser339Ala и его комплекса с L-метионином. Спектр поглощения мутантной формы фермента имеет типичный для альдиминов ПЛФ вид с основной полосой в области 420 нм и полосой в области 320 нм.

 

Рис. 1. Спектры поглощения: холофермента МГЛ Ser339Ala (А); комплексов МГЛ с L-метионином: МГЛ дикого типа (сплошная линия) и МГЛ Ser339Ala (пунктирная линия) (Б). Спектры снимали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ, 1 мМ EDТА при концентрации фермента 1 мг/мл

 

Данные логнормального разложения спектра холофермента, которое проводили, как описано для фермента дикого типа [37], приведены в табл. 4. Внутренний альдимин мутантной формы описывается четырьмя структурами: кетоенамин, его таутомер, енолимин (рис. 1А; cтруктуры II, I) и два конформера кетоенамина – конформер, у которого альдиминная группа находится в плоскости, перпендикулярной плоскости пиридинового цикла (табл. 4, структура II^┴), и конформер с альдиминной связью, выведенной из плоскости кольца кофермента, но с сохранением сопряжения с π-электронами кольца кофермента и водородной связи между альдиминным атомом азота и 3’-оксигруппой кофермента (табл. 4, cтруктура II^∠). Параметры полос поглощения, полученные при разложении спектра, приведены в табл. 4.

 

Таблица 4. Параметры полос спектра поглощения внутреннего альдимина Ser339Ala МГЛ

Структура	E, эВ	ν × 10-3, см-1	λ, нм	ε × 10-3, М-1см-1	W × 10-3, см-1	ρ	f	n, %
II1	2.92	23.58	424.1	10.46	3.58	1.55	0.18	52.9
II∠	3.24	26.10	383.1	8.27	3.87	1.37	0.03	10.4
I	3.63	29.26	341.8	9.75	3.65	1.23	0.06	20.0
II┴	3.80	30.67	326.1	8.50	3.47	1.29	0.05	16.7
II2*	4.28	34.52	289.7	12.20	5.06	1.20	0.29
*	4.55	36.56	272.8	23.10	4.56	1.39	0.79

Примечание. Е – энергия электронного перехода; ν – волновое число; λ – длина волны; ε – коэффициент молярного поглощения; W – полуширина; ρ – асимметрия; f – сила осциллятора; n – содержание таутомеров и конформеров.

Надстрочные индексы (1, 2) относятся к первому и второму электронным переходам структуры II. Надстрочные индексы (┴, ^∠) относятся к двум конформерам структуры II (конформер с альдиминной связью, находящейся в плоскости, перпендикулярной плоскости пиридинового цикла, и конформер с альдиминной связью, частично выведенной из плоскости пиридинового кольца, но сохраняющей сопряжение с π-электронами кольца кофактора и водородную связь между альдиминным азотом и 3’-оксигруппой кофермента).

*Экспериментальная информация об этих полосах недостаточна.

 

Найденные структуры и параметры их полос поглощения оказались практически такими же, как у фермента дикого типа [36]. Величина константы диссоциации комплекса ПЛФ для МГЛ дикого типа составляет 6.24 × 10^-4 мМ [57]. Константа диссоциации ПЛФ мутантной формы фермента составила 1.01 × 10^-3 мМ. Таким образом, замена несущественно повлияла на сродство апофермента к коферменту и на конформацию и таутомерию внутреннего альдимина. Она привела к некоторому изменению количественного состава таутомеров и конформеров внутреннего альдимина. Реакционноспособной формой внутреннего альдимина является кетоенамин. В холоферменте дикого типа его содержание составляет 67.6% [36], в холоферменте мутантной формы – 52.9% (табл. 4).

В спектрах поглощения и кругового дихроизма комплекса МГЛ дикого типа с L-метионином имеются полосы с максимумами при 440 и 480 нм [36]. Эти полосы в спектрах ПЛФ-зависимых ферментов относят к интермедиатам реакций β- и γ-элиминирования – α-аминокротонату или α-аминоакрилату [54]. Наличие α-аминокротоната в спектре комплекса МГЛ дикого типа с L-метионином и кинетические данные взаимодействия фермента дикого типа с рядом субстратов и ингибиторов позволили предположить, что скоростьлимитирующая стадия физиологической реакции следует после стадии образования α-аминокротоната [36]. В спектре поглощения комплекса мутантной формы фермента с L-метионином отсутствует поглощение в области 440–480 нм. Следовательно, замена Ser339 на Ala привела к торможению реакции γ-элиминирования на стадии/ях, следующих за стадией внешнего альдимина.

Пространственная структура холофермента мутантной формы

Пространственная структура Ser339Ala МГЛ определена с разрешением 1.7 Å. Замена серина 339 на аланин не повлияла на пространственную структуру фермента. Общий ход полипептидной цепи Ser339Ala МГЛ остается практически таким же, как у холофермента МГЛ дикого типа (рис. 2А). Среднеквадратическое отклонение положений Сα-атомов Ser339Ala МГЛ по сравнению с их положениями в структуре фермента дикого типа (код PDB 2RFV) составляет 0.29 Ų. Как и в определенных нами ранее структурах C. freundii МГЛ [29–31], а также в структурах МГЛ из других микроорганизмов, для структуры Ser339Ala МГЛ характерна подвижность фрагментов N- и С-концевых участков полипептидной цепи (рис. 2А) [28]. Из-за высокой подвижности N-концевого фрагмента в структуре Ser339Ala МГЛ не локализован длинный участок, состоящий из 16 аминокислот (46–61), включающий остатки тирозина 58 и аргинина 60, боковые группы которых образуют водородные связи с O2P-атомом фосфатной «ручки» кофермента (рис. 2Б).

 

Рис. 2. Наложение структур C. freundii МГЛ дикого типа (код PDB 2RFV; зеленый) и Ser339Ala МГЛ (код PDB 5D5S; темно-синий): А – общий ход полипептидной цепи с окраской по В-фактору от темно-синего до красного при увеличении значения; Б – фрагменты активных центров; звездочками отмечены остатки, принадлежащие соседней субъединице каталитического димера. PLP – кофермент

 

Средний температурный В-фактор аминокислотных остатков, принадлежащих подвижному С-концевому фрагменту (54.02 Ų, остатки 353–368), в 2 раза выше среднего температурного фактора стабильных участков фермента. Такая мобильность может быть связана с обеспечением вывода из активного центра фермента продуктов реакций γ- и β-элиминирования [30]. Замена серина 339 на аланин привела к потере водородной связи между ним и остатком треонина 36 соседней субъединицы каталитического димера (рис. 2Б), однако это не вызвало изменений в тетрамерной организации молекулы Ser339Ala МГЛ.

Пространственные структуры ковалентных и нековалентных комплексов МГЛ с ингибиторами, роль Ser339 в катализе реакций γ- и β-элиминирования

В пространственной структуре холофермента C. freundii МГЛ дикого типа (код PDB 2RFV) боковая цепь Ser339 находится в двух равновероятных положениях (рис. 3). В одном из них она располагается в области активного центра фермента рядом с Lys210, во втором – в области межсубъединичного взаимодействия с N-концевым доменом соседней субъединицы каталитического димера. Оба положения боковой цепи Ser339 стабилизированы водородными связями и хорошо различимы на карте электронной плотности.

В пространственных структурах комплексов МГЛ с ингибиторами, моделирующими комплекс Михаэлиса, внешний альдимин и кетиминный интермедиат, боковая цепь Ser339 занимает единственное положение, при котором его Oγ-атом направлен в сторону Lys210 [29–32]. При связывании МГЛ с ингибиторами их карбоксильные группы «выталкивают» карбонильную группу пептидной связи между Ser339 и Val338 из полости активного центра в область межсубъединичных контактов и С=О-группа поворачивается на 180° [29, 32]. При таком повороте расстояние между Oγ-атомом Ser339 и атомом кислорода главной цепи Val338 сокращается до 2.12 Å, это приводит к выталкиванию Oγ-атома Ser339 в область активного центра фермента (рис. 3). Так обеспечивается единственное положение боковой группы Ser339, при котором его Oγ-атом образует с Nζ-атомом Lys210 водородную связь. Ее расстояние составляет 2.85 Å в комплексе Cys115His МГЛ с L-норлейцином, моделирующим внешний альдимин [31], и 2.79 Å в комплексе C. freundii МГЛ с L-циклосерином, моделирующим кетиминный интермедиат [30] (рис. 3).

 

Рис. 3. Стереоизображение наложения фрагментов активного центра МГЛ C. freundii: холофермент дикого типа (код PDB 2RFV, темно-синий) и комплекс с L-циклосерином (код PDB 4OMA, голубой). Звездочками отмечены остатки, принадлежащие соседней субъединице каталитического димера. Альтернативные положения аминокислотных остатков показаны штриховыми линиями

 

Выше отмечалось, что N-концевой фрагмент МГЛ подвижен как в структурах холофермента дикого типа, так и в холоферменте Ser339Ala МГЛ. Связывание ингибиторов МГЛ дикого типа приводит к стабилизации этого фрагмента [30, 32]. Вероятно, такая стабилизация имеет место и при связывании субстратов и ингибиторов Ser339Ala МГЛ.

На рис. 4 представлены фрагменты активного центра комплекса C. freundii МГЛ с L-циклосерином, в которых наблюдаются два положения боковой цепи Lys210.

В одном положении, аналогичном положению боковой цепи Lys210 в структуре комплекса мутантной формы с норлейцином [31], моделирующего внешний альдимин, Nζ-атом Lys210 стабилизирован водородными связями с гидроксильными группами боковых цепей Ser339 и Tyr58* (2.79 Å и 2.82 Å; рис. 4А). Боковая группа Lys210 практически перпендикулярна плоскости кольца кофермента и находится на расстоянии 3.28 Å от C-α-pro-(R)-протона и 3.15 Å от Cβ-атома L-циклосерина (рис. 4Б). Такое положение благоприятно для обеспечения отрыва C-α-pro-(R)-протона или С-β-протона боковой аминогруппой Lys210.

В другом положении Nζ-атом Lys210 находится на расстоянии водородной связи от гидроксильных групп боковых цепей Ser207 и Tyr58* (3.30 Å и 2.96 Å; рис. 4А). В этом положении Nζ-атом Lys210 находится наиболее близко (3.23 Å) к C4’-атому ПЛФ, в то время как расстояние до Сα-атома субстрата увеличивается на 0.43 Å (рис. 4Б). Это положение боковой группы Lys210 благоприятно для переноса С-α-протона к C4’-атому кофермента.

 

Рис. 4. А – окружение Lys210 в активном центре комплекса C. freundii МГЛ с L-циклосерином (код PDB 4OMA). Звездочками обозначены аминокислотные остатки, принадлежащие второй субъединице каталитического димера. Б – положение Nζ-атома азота боковой цепи Lys210 относительно C4’-атома ПЛФ, С-α- и С-β-атомов ингибитора

 

Таким образом, если Tyr58* участвует в стабилизации обоих положений Nζ-атома Lys210, то боковые группы Ser339 и Ser207, располагающиеся с противоположных сторон от Lys210, обеспечивают оптимальное положение его ε-аминогруппы на стадиях отрыва С-α-протона во внешнем альдимине, протонировании C4’-атома ПЛФ и отрыва С-β-протона в кетиминном интермедиате.

В комплексах мутантной формы с субстратами и ингибиторами группа Lys210 может образовывать только одну водородную связь с гидроксильной группой Tyr58*. Это будет приводить к нарушению оптимальной для отрыва C-α-протона конформации боковой группы Lys210 и понижению ее рКа. Очевидно, этим объясняется уменьшение наблюдаемой скорости обмена С-α-протона ингибиторов. Ранее предположили, что обмен С-β-протонов осуществляется по механизму с обращением конфигурации, когда первый протон отрывается боковой группой Lys210, а второй протон приходит с противоположной стороны от боковой группы Tyr113. В результате оба С-β-протона обмениваются с одинаковой скоростью [29]. В случае мутантной формы Ser339Ala реакция изотопного обмена С-β-протонов замедляется и оба β-протона обмениваются с одинаковой скоростью.

Вероятно, водородная связь между Nζ-атомом Lys210 и Oγ-атомом Ser339 обеспечивает как оптимальное для отрыва С-α- и С-β-протонов положение аминогруппы Lys210, так и стабилизацию ее аммонийной формы для 1,3-прототропного сдвига С-α-протона к С4’-атому кофермента и эффективный обмен С-α- и С-β-протонов в комплексах с субстратами и ингибиторами. Присутствие в спектре поглощения комплекса Ser339Ala с L-метионином полосы поглощения внешнего альдимина также позволяет считать, что замена серина 339 на аланин приводит к торможению физиологической реакции на стадии отрыва C-α-протона во внешнем альдимине.

Если образование α-аминокротоната происходит по механизму, предложенному в работе [50], ε-аминогруппа Lys210 может принимать участие как основание или кислота на стадиях физиологической реакции, следующих за элиминированием метилмеркаптана, и замена Ser339 может приводить к замедлению этих стадий физиологической реакции.

Замена серина 339 на аланин приводит к торможению реакции β-элиминирования на стадии отрыва C-α-протона внешнего альдимина. Поскольку в ПЛФ-зависимых реакциях β-элиминирования серосодержащих аминокислот Lys210 постулируется как общий кислотный катализатор [54], возможно, гидроксильная группа Ser339 обеспечивает оптимальные для катализа положение и основность Lys210.

Ранее подобную роль остатка серина, соответствующего Ser339 МГЛ, предложили для двух ферментов структурного подкласса, к которому принадлежит МГЛ, цистатионин–γ-синтазы [58] и цистатионин–β-лиазы [59].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами показано участие остатка Ser339 в механизме реакций γ- и β-элиминирования, катализируемых МГЛ из C. freundii. Используя рентгеноструктурные, кинетические и спектральные данные, установлено, что Ser339 необходим для обеспечения оптимального положения боковой группы Lys210 на стадии отрыва С-α-протона субстрата в реакции β-элиминирования и стадиях отрыва С-α- и С-β-протонов субстрата в реакции γ-элиминирования. Предположено, что в реакции γ-элиминирования остаток Ser339 обеспечивает необходимую основность боковой аминогруппы Lys210 на стадии 1,3-прототропного сдвига С-α-протона субстрата к С4’-атому кофермента. Понимание механизмов реакций γ- и β-элиминирования, катализируемых МГЛ, не только вносит вклад в фундаментальную энзимологию, оно необходимо для создания новых антибактериальных и противоопухолевых препаратов, основанных на изменении/улучшении субстратной и реакционной специфичности фермента.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных исследований государственных академий наук (№ 01201363820) и при поддержке РФФИ (проекты № 14-04-00349 и 14-04-31398).

Об авторах

Наталья Валерьевна Ануфриева

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvdemidkina@yandex.ru

 

Россия, 119991, Москва

Елена Андреевна Морозова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: elmorozova@yahoo.com

 

Россия, 119991, Москва

Светлана Владимировна Ревтович

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvdemidkina@yandex.ru

 

Россия, 119991, Москва

Наталия Павловна Бажулина

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvdemidkina@yandex.ru
Россия, 119991, Москва

Владимир Петрович Тимофеев

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvdemidkina@yandex.ru
Россия, 119991, Москва

Ярослав Владимирович Ткачёв

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvdemidkina@yandex.ru
Россия, 119991, Москва

Николай Григорьевич Фалеев

Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Email: tvdemidkina@yandex.ru
Россия, 119991, Москва

Алексей Донатович Никулин

Институт белка РАН

Email: tvdemidkina@yandex.ru
Россия, 142290, Пущино, Московская обл.

Татьяна Викторовна Демидкина

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: tvdemidkina@yandex.ru

 

Россия, 119991, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы