Участие остатков E34, K35 и R38 N-домена в формировании функционально активной структуры Lon-протеазы Escherichia coli

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AMPPNP – аденозин-5′-(β,γ-имидо)трифосфат; DTDP – 4,4’-дитиодипиридин; Nu – нуклеотид; РерТВЕ – Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl; Suc – сукцинил; ОП – оптическое поглощение.

ВВЕДЕНИЕ

ATP-зависимые Lon-протеазы (MEROPS: клан SJ, семейство S16) – ключевые участники системы контроля качества клеточных белков, обеспечивающей сохранность протеома во всех царствах природы. Наряду с Lon и другими ATP-зависимыми протеазами система контроля качества (СКК) включает молекулярные шапероны, которые обеспечивают корректный фолдинг белков, отвечают за формирование белковых ансамблей и препятствуют накоплению агрегатов в клетке. В свою очередь АТР-зависимые протеазы и мультисубъединичные бифункциональные комплексы – протеасомы – деградируют поврежденные, мутантные, а также короткоживущие регуляторные белки, потенциально опасные для клетки [1–6].

Lon-протеазы – гомоолигомерные ферменты. Их субъединицы включают АТР-азный (ААА⁺) модуль, образованный нуклеотидсвязывающим (NB) и α-спирализованным (H) доменами, протеазный (P) домен, представляющий собой серин-лизиновую пептидгидролазу, а также N-концевой или инсерционный некаталитический экстрадомен (ED) (рис. 1) [7, 8].

 

Рис. 1. Доменная организация Lon-протеаз из разных подсемейств (A) и границы доменов в субъединице Lon-протеазы E. coli (Б). А – S* и K* – каталитически активные остатки протеолитического центра, Ф – остаток гидрофобной аминокислоты, Х – остаток любой аминокислоты, РА и РВ – протеазные домены А-типа (розовый) и В-типа (фиолетовый), АА, АВ и АВ* – ААА+-модули соответственно А-типа (голубой), В-типа и В*-типа «вырожденный» (синие), NB – нуклеотидсвязывающие домены, Н – α-спирализованные домены, ED – экстрадомены, представленные N-доменом (коричневый) и HI(CC) – вставочным α-спирализованным доменом (зеленый) с coiled-coil-участком (салатовый) у протеаз LonA, трансмембранным доменом (светло-голубой) у LonB и вставочным доменом (заштрихован) у LonC; а.о. – аминокислотный остаток; замены аминокислот в консервативных фрагментах выделены синим цветом. Б – субъединица LonА-протеазы E. coli с С-концевым 6His-тэгом; в N-домене заштрихован регион, включающий остатки E34, K35 и R38

 

Наличие ААА⁺-модуля в структуре Lon-протеаз, как и других протеаз СКК, определяет их принадлежность суперсемейству ААА⁺-белков (ATPases Associated with a variety of cellular Activities), широко распространенных в природе и участвующих в важнейших процессах, таких, как репликация ДНК, транскрипция, деление клеток, внутриклеточный транспорт, фолдинг, протеолиз и др. [9–12]. ААА⁺-протеазы – высокоселективные ферменты, основными особенностями которых являются сопряжение протеолитической активности с гидролизом АТР и процессивный характер гидролиза белковых мишеней, в результате которого образуются исключительно низкомолекулярные продукты (5–15 аминокислотных остатков, а.о.) [13–15].

Из множества клеточных белков АТР-зависимые протеазы отбирают свои субстраты по наличию в них особых структурных элементов: экспонированных гидрофобных частей белковой молекулы либо меток, называемых дегронами. Дегроны представляют собой специфические аминокислотные последовательности, локализованные на конце или внутри полипептидной цепи субстрата [16–18]. Меткой для субстратов протеасом, функционирующих в клетках эукариот, служит белок убиквитин [19, 20]. Процессивный механизм гидролиза субстратов ААА⁺-протеазами реализуется благодаря бочкообразной четвертичной структуре этих ферментов. Их цилиндрические олигомеры используют энергию АТР для связывания, денатурации и транслокации белковых субстратов вдоль центральной поры, образованной уложенными друг на друга кольцами АТР-азных модулей и протеазных доменов, к пептидазным центрам, скрытым внутри олигомера фермента [21–23].

На сегодняшний день в базе данных MEROPS из общего пула АТР-зависимых Lon-протеаз выделены три подсемейства: А, В и С (рис. 1А). Основой для разделения ферментов Lon на подсемейства служат различия в окружении каталитически активных остатков серина и лизина протеолитических центров, а также локализация экстрадоменов, определяющая архитектуру АТР-азного компонента [7, 8, 24]. В семействе Lon-протеаз идентифицировано два типа протеолитических центров – тип Р_А, обнаруженный в Р-доменах ферментов самого крупного подсемейства LonA, объединяющего ферменты бактерий и эукариот [7, 8, 24, 25], и тип Р_В, детектируемый в ферментах подсемейства LonB из архей [8, 26], а также малочисленного бактериального подсемейства LonC (рис. 1А) [27, 28].

Экстрадомен LonA-протеаз представлен пролонгированной N-концевой областью, являющейся отличительной особенностью представителей этого подсемейства. Протеазы LonВ и LonС содержат инсерционные экстрадомены, локализованные в их нуклеотидсвязывающих доменах между мотивами Уолкера А и В. Особенностью экстрадомена ферментов LonВ является наличие включенного в него трансмембранного сегмента. Экстрадомен LonС-протеаз отличает большая протяженность по сравнению с экстрадоменом LonB и вырождение АТР-азной функции вследствие замены существенных остатков АТР-азного центра (рис. 1А). Тем не менее, LonС-протеазы также участвуют в системе контроля качества протеома, поскольку регуляция их протеолитической активности опосредована сохранившейся способностью к связыванию нуклеотидов [27].

Наиболее изучены представители подсемейства LonA. Их N-концевая область имеет двухдоменную организацию [21, 29]. У LonA-протеазы Еscherichia coli (EcLon) она включает 325 а.о. и сформирована «истинным» N-концевым (M1–Y117) и вставочным α-спирализованным (α-helical inserted, HI(CC), (E124–P302)) доменами (рис. 1Б) [29, 30]. Первый имеет структуру скрученного β-листа и топологически сходен с РНК-связывающими PUA-доменами [31, 32]. Второй, сформированный восемью α-спиралями, включает участок последовательности со специфической coiled-coil (СС) конформацией и проявляет выраженное сходство с Н-доменом собственного ААА⁺-модуля, а также с α-спирализованным доменом первого ААА⁺-модуля шаперонов-дезагрегаз ClpB/Hsp104, содержащим инсерционный М-домен с СС-конформацией [30, 31, 33].

К настоящему времени накоплен значительный объем сведений о роли ААА⁺-модуля и протеазного домена в функционировании LonА-протеаз. Однако функции N-концевой области LonA-протеаз охарактеризованы еще не в полной мере. Согласно опубликованным данным, эта область молекулы участвует в распознавании и связывании белков-субстратов [34–37]. Недавно было показано участие N-концевой области в образовании додекамерных структур из гексамеров LonA-протеазы E. coli [38, 39]. Кроме того, выявлено различие функций, выполняемых N- и HI(CC)-доменами в полноразмерной EcLon-протеазе [40–45], что служит подтверждением двухдоменной организации N-концевой области фермента. Совокупность результатов различных исследований указывает на важнейшую роль N-концевой области LonА-протеаз в поддержании их функционально активной конформации. При этом остается неясным, какие именно фрагменты N-домена важны для структурной организации и принимают участие в стабилизации ферментов.

Цель настоящей работы состояла в выявлении остатков N-концевого домена, способных участвовать в формировании стабильной, функционально активной структуры EcLon-протеазы (далее – Lon-протеаза), проведении сайт-направленного мутагенеза этих остатков с получением мутантной формы фермента и последующем исследовании ее структурных и ферментативных характеристик в сравнении c соответствующими характеристиками интактной EcLon.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

В работе использовали коммерческие реактивы фирм Sigma, Bio-Rad, Thermo Scientific (США), Fluka, Bachem (Швейцария), Boehringer Mannheim (Германия), Pharmacia (Швеция), Difco (Англия), Panreac (Испания) и «Реахим» (Россия).

Получение рекомбинантной EcLon-протеазы (Ec-Lon) и ее мутантной формы LonEKR

Рекомбинантную форму EcLon-протеазы, содержащую гексагистидиновый фрагмент в составе октапептида LEHHHHHH на С-конце белка (Ec-Lon), получали по ранее описанной методике [40].

Тройной мутант LonEKR получали с помощью мегапраймерного подхода на основе нуклеотидной последовательности Ec-Lon-протеазы с использованием следующих праймеров: Lon_E34K35R38/AAA, T7 promoter и f9 (5′-CCATCGCCGCTTCCAGACAAGCGATAGATGCTGCCCGCCCGACAAATAAGGGG-3′, 5′-TTAATACGACTCACTATAGGGGA-3′ и 5′-CGTTTACACCCGGCTCATCC-3′ соответственно). Амплификацию фрагмента гена проводили в два этапа, используя в качестве матрицы плазмидную ДНК pET28-Ec-lon. На первом этапе с помощью праймеров Lon_E34K35R38/AAA и Т7 promoter получили ПЦР-фрагмент, который использовали в качестве праймера на втором этапе совместно с праймером f9. Полученный фрагмент ДНК длиной около 250 п.н. клонировали в вектор pET28-Ec-lon по уникальным сайтам рестрикции XbaI и HindIII.

Секвенирование клонированных ДНК и синтез праймеров осуществлены компанией «ЕВРОГЕН» (www.evrogen.ru). Процедуры рестрикции и лигирования проводили согласно протоколам производителей соответствующих ферментов.

Клетки E. coli штамма BL21(DE3), несущие плазмиду pET28-lonEKR, культивировали в среде LB с канамицином при 37°С и интенсивном перемешивании до достижения ОП₆₀₀ 0.5 о.е., после чего температуру клеточной культуры понижали до 25°С и проводили индукцию при 0.1/1 мМ IPTG в течение 3 ч.

Выделение и очистку Ес-Lon и LonEKR проводили с использованием Ni²⁺-хелатной аффинной хроматографии (колонка HisTrap FF, 5 мл, GE Healthcare, США) и анионообменной хроматографии (колонка HiTrap^TM Q FF, 5 мл, GE Healthcare) согласно ранее описанной методике [40], а также последующей двухстадийной гель-фильтрацией на HiPrep^TM 16/60 Sephacryl S-300 HR (120 мл, GE Healthcare), буферы: 50 мМ имидазол, рН 7.5; 0.5 М NaCl (стадия 1) и 50 мМ Tрис-HCl, рН 7.5; 0.5 М NaCl (стадия 2).

Концентрации белков определяли по методу Брэдфорд [46].

Гомогенность белков в препаратах тестировали электрофоретически [47] с использованием коммерческого набора маркеров (кДа): β-галактозидаза (116.0), бычий сывороточный альбумин (66.2), овальбумин (45.0), лактатдегидрогеназа (35.0), рестриктаза Bsp98I (25.0), β-лактальбумин (18.4) и лизоцим (14.4).

Определение энзиматических свойств Ес-Lon и ее тройного мутанта LonEKR

АТР-азную активность тестировали по накоплению во времени неорганического фосфата в реакции гидролиза АТР в 50 мМ Tрис-HCl-буфере, pH 8.1, содержащем 200 мМ NaCl, 2.5 мМ ATP, 2.5 или 20 мМ MgCl₂ и 0.1–1.0 мкМ фермент в отсутствие и при наличии β-казеина (1 мг/мл), при 37^оС [48]. В контрольном опыте фермент заменяли буфером. Начальные скорости реакций определяли по величине ОП смеси из 200 мкл реакционной среды и 600 мкл реагента (100 мM Zn(AcO)₂, 15 мM (NH₄)₆Mo₇O₂₄, 1% SDS, pH 4.5–5.0) при длине волны 350 нм (ε₃₅₀ = 7 360 М^-1 см^-1).

Тиоэстеразная активность. За гидролизом тиобензилового эфира N-защищенного трипептида Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (PepTBE) следили спектрофотометрически при длине волны 324 нм по величине ОП 4-тиопиридона (ε₃₂₄ = 16 500 М^-1 см^-1), образующегося в результате взаимодействия продукта гидролиза (бензилтиолата, BzlS^-) c 4,4´-дитиодипиридином (DTDP) [49]. Гидролиз РерТВЕ проводили при 37^оС в 50 мM Tрис-HCl-буфере, рН 8.1, содержащем 200 мM NaCl, 10% DMSO, 0.2 мМ DTDP, 0.1 мМ PepTBE и 0.1–1.0 мкМ фермент. При изучении влияния эффекторов в смесь добавляли нуклеотид до 2.5 мМ и MgCl₂ до 20 мМ.

Протеолитическую активность ферментов тестировали электрофоретически [47]. Реакцию проводили при температуре 37^оС в 50 мМ Tрис-HCl-буфере, pH 8.1, содержащем 200 мМ NaCl, 20 мкМ β-казеин и 1 мкМ фермент, в отсутствие или при наличии 5 мМ Nu и 20 мМ MgCl₂. В контрольном эксперименте фермент заменяли буфером. Аликвоту реакционной или контрольной смеси смешивали с лизирующим буфером (0.2 M Tрис-HCl, pH 8.9, 4% SDS, 20% глицерин, 0.5 мM EDTA, 0.8% бромфеноловый синий, 3% β-меркаптоэтанол) в соотношении 3:1, кипятили в течение 5 мин, наносили на 12% ПААГ для электрофореза.

Автолитическую активность ферментов тестировали электрофоретически [47] в условиях, аналогичных условиям определения протеолитической активности, но в отсутствие β-казеина.

Ограниченный протеолиз химотрипсином Ec-Lon-протеазы и ее тройного мутанта LonEKR проводили при температуре 30^оС в 50 мМ Tрис-HCl-буфере, pH 8.1, содержащем 300 мМ NaCl, 11 мкМ фермент и 0.2 мкМ химотрипсин, в отсутствие и при наличии эффекторов EcLon-протеазы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация остатков N-домена EcLon-протеазы, предположительно участвующих в формировании функционально активного фермента

Ранее нами было показано, что ключевая роль в корректном связывании белкового субстрата EcLon-протеазой, эффективном функционировании ее АТР-азного и пептидазного центров, реализации межцентровых аллостерических взаимодействий и процессивного механизма протеолиза принадлежит инсерционному HI(CC)-домену [40–45]. При этом для взаимодействия с белковым субстратом и его гидролиза критически важными оказались фланкирующие СС-участок фрагменты (E124–H172) и (M281–N302) [41–43].

Нами установлено [44], что N-концевой домен обеспечивает конформационную стабильность EcLon-протеазы в условиях сопряжения протеолиза с гидролизом АТР, поскольку укороченная форма фермента (G107–K784), полученная в результате удаления фрагмента (M1–N106), подвергается интенсивному автолизу, несмотря на сохранение способности к процессивному протеолизу. Наряду с этим показано [34], что остатки R33, E34 и K35 N-концевого домена принимают участие в специфическом связывании субстратов EcLon, содержащих так называемый sul20-дегрон (фрагмент ингибитора клеточного деления SulA), что, в свою очередь, влияет на активность АТР-азного и протеолитического центров.

В то же время результаты рентгеноструктурного анализа N-концевой области LonA-протеазы E. coli [31] позволяют предположить, что регион, включающий остатки R33, E34, K35, а также R38, может иметь важное значение для реализации междоменных и/или межсубъединичных взаимодействий в ферменте. Этот регион локализован на поверхности N-домена EcLon-протеазы (рис. 2), и, таким образом, указанные остатки могут быть непосредственно вовлечены как во взаимодействия с субстратом, так и во взаимодействия между протомерами внутри олигомеров ЕсLon. Предположение об участии рассматриваемого региона в формировании активной структуры и функционировании ЕсLon можно проверить путем изучения свойств мутантной формы фермента, несущей замены потенциально значимых остатков.

 

Рис. 2. Поверхность N-домена EcLon-протеазы (остатки 7–118). Красным цветом показаны элементы вторичной структуры, голубым – боковые цепи поверхностных остатков, желтым пунктиром обозначено ионное взаимодействие между остатками R33 и Е62

 

Однако, как следует из рис. 2, остаток R33 образует ионную пару с остатком Е62, расположенным на конце длинной поверхностной петли из 18 остатков. Такое взаимодействие ограничивает подвижность этой петли и тем самым поддерживает ее конформацию. Предполагаемая мутация остатка R33 может привести к нарушению топологии исследуемой области. По этой причине в настоящей работе исследована мутантная форма EcLon-протеазы (LonEKR), в которой заменам на аланин были подвергнуты только три остатка, а именно, E34, K35 и R38.

Получение LonEKR – тройного мутанта Lon-протеазы E. coli

Мутантную форму LonEKR, содержащую замены E34A, K35A и R38A, получали на основе рекомбинантной формы ЕсLon, содержащей гексагистидиновый фрагмент на С-конце белка (Ес-Lon) [40]. Интактный фермент и его тройной мутант выделяли согласно схеме, включающей аффинную хроматографию на Ni-сефарозе, ионообменную хроматографию на Q-сефарозе и гель-фильтрацию на сефакриле S-300. Для интактного и мутантного ферментов определяли АТР-азную, пептидазную, протеолитическую и автолитическую активность. При изучении гидролиза АТР оценивали влияние избытка ионов магния и присутствия белкового субстрата. Пептидазную (субстрат – Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl, PepTBE), протеолитическую (модельный белковый субстрат – β-казеин) и автолитическую активность тестировали в отсутствие и в присутствии эффекторов Lon-протеазы – нуклеотидов и ионов магния.

АТР-азная активность мутантной формы LonEKR

Ранее было показано, что интактная Ес-Lon-протеаза демонстрирует максимальный уровень АТР-азной активности в реакционной среде с рН 8.0–8.2 и при эквимолярных концентрациях АТР и ионов магния, равных 2.5 мМ. При повышенной концентрации ионов Mg²⁺, характерной для физиологических условий (20 мМ), наблюдается понижение АТР-азной активности. Присутствие белкового субстрата способно восстанавливать скорость гидролиза АТР до значений, соответствующих оптимальным условиям ее проявления [40, 43].

Тройной мутант Ес-Lon-протеазы по эффективности гидролиза АТР близок к интактному ферменту, при этом сохраняются особенности его функционирования, в том числе ингибирование избытком ионов магния и последующая активация АТР-азных центров β-казеином (далее – казеин). Однако активация центров мутантной формы в ответ на взаимодействие с казеином происходит с меньшей эффективностью, чем у интактной Ес-Lon-протеазы (рис. 3), что может быть обусловлено ослаблением связывания белковой мишени вследствие введения мутаций по остаткам E34, K35 и R38.

 

Рис. 3. АТР-азная активность интактной Ес-Lon-протеазы и ее мутантных форм LonEKR и LonEKR-1. Условия эксперимента: 50 мМ Tрис-HCl-буфер, рН 8.1; 0.2 M NaCl; 37°С. Концентрации: АТР – 2.5 мМ; MgCl2 – 2.5 (1, 3) или 20 мМ (2, 4); β-казеин – 0 (1, 2) или 1 мг/мл (3, 4); фермент – 0.1–1.0 мкМ. Величина среднеквадратичного отклонения R2 в экспериментах составила 0.98–1.00

 

В отдельном эксперименте показано влияние условий культивирования штамма-продуцента, в частности условий индукции, на эффективность функционирования АТР-азных центров выделенной формы фермента LonEKR. При работе с Ес-Lon-протеазой и ее модифицированными формами в качестве оптимальных были приняты условия, понижающие влияние краудинг-эффекта в процессе экспрессии целевого гена: ферментацию проводили в присутствии 0.1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и температуре 25°С. В случае увеличения концентрации индуктора до 1 мМ наблюдалось понижение базовой АТР-азной активности выделенного мутанта (LonEKR-1) на 40% по сравнению с интактным ферментом (рис. 3). Эффективность восстановления АТР-азной активности LonEKR-1 при взаимодействии с белковым субстратом также оказалась заметно ниже, чем у интактной Lon-протеазы и формы LonEKR (рис. 3). Таким образом, можно полагать, что присутствие IPTG в концентрации 1 мМ неблагоприятно влияет на фолдинг мутантной формы Ес-Lon-протеазы, что также подтверждается экспериментами по гель-фильтрации LonEKR-1, в ходе которой наблюдаются изменения в характере белкового пика по сравнению с Lon и LonEKR – расширение пика и появление у него «хвоста».

Активность пептидазного центра мутантной формы LonEKR

Эффективность функционирования пептидазных центров интактной Ес-Lon-протеазы и ее мутантной формы LonEKR оценивали по гидролизу тиобензилового эфира N-защищенного трипептида – Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (РерТВЕ) [40]. При гидролизе пептидного субстрата в отсутствие нуклеотидных эффекторов мутантная форма LonEKR оказалась более эффективной (в 1.7 раза), чем интактная Lon (рис. 4). При этом ионы магния активируют пептидазные центры обеих форм в незначительной мере. Среди свободных нуклеотидов лишь АТР проявляет слабое, но близкое по эффективности активирующее действие, в то время как ADP и AMPPNP в одинаковой мере ингибируют пептидазную активность, что свидетельствует о сходном сродстве нуклеотидов с интактной и мутантной формами фермента. Наибольшее активирующее влияние на пептидазные центры обеих форм Lon оказывают комплексы АТР/Mg и AMPPNP/Mg (рис. 4). Таким образом, можно констатировать, что пептидгидролазные центры тройного мутанта ведут себя, в целом, подобно центрам интактного фермента.

 

Рис. 4. Пептидазная активность интактной Ес-Lon-протеазы и ее мутантных форм LonEKR и LonEKR-1. Условия эксперимента: 50 мМ Трис-HCl-буфер, рН 8.1; 0.2 M NaCl; 10% DMSO; 0.2 мМ DTDP; 37°С. Концентрации: PepTBE – 0.1 мМ; нуклеотиды – 2.5 мМ; MgCl2 – 20 мМ; фермент – 0.1–1.0 мкМ. Величина среднеквадратичного отклонения R2 в экспериментах составила 0.98–1.00

 

Полученные результаты позволяют считать, что введение мутаций по остаткам E34, K35 и R38 N-концевого домена EcLon не приводит к значительным изменениям функционирования пептидазных центров фермента. Однако, поскольку активация интактной Lon комплексами АТР/Mg и AMPPNP/Mg заметно превышает активацию ими формы LonEKR, можно полагать, что у мутанта изменяется передача аллостерических сигналов от АТР-азного центра к пептидазному, возможно, за счет различий в эффективности связывания комплексов Nu/Mg.

Необходимо отметить, что форма фермента LonEKR-1, полученная в результате экспрессии гена мутантной формы Lon-протеазы в присутствии 1 мМ IPTG, проявляет резко пониженную пептидазную активность относительно активности формы LonEKR (рис. 4). В отсутствие эффекторов гидролиз низкомолекулярного субстрата формой LonEKR-1 протекает в 8 раз медленнее, чем формой LonEKR, но при этом сохраняется активирующий эффект ионов магния. В отличие от действия на LonEKR любые свободные нуклеотиды ингибируют пептидазную активность LonEKR-1, а их комплексы с Mg²⁺ ускоряют гидролиз пептида в среднем только в 2 раза, что мало отличается от действия ионов магния. Таким образом, как и в случае с АТР-азной активностью, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что проведение индукции в присутствии 1 мМ IPTG приводит к значительным конформационным нарушениям в структуре фермента, что сказывается на его функциональной активности.

Протеолитическая активность и автолитические свойства мутантной формы LonEKR

Протеолитическую активность Ес-Lon-протеазы и ее мутантной формы оценивали по гидролизу β-казеина (рис. 5) как в [40–45]. Форма LonEKR сохраняет характерную для ферментов СКК способность гидролизовать белковую мишень по процессивному механизму (без высвобождения крупных промежуточных продуктов) в условиях сопряжения протеолиза с гидролизом АТР (рис. 5Б). Этот механизм реализуется гексамерной структурой LonEKR, образование которой подтверждено экспериментами по гель-фильтрации (данные не приведены). В присутствии комплекса AТP/Mg за первые 10 мин реакции более 50% казеина подвергается деградации мутантной формой, что сопоставимо с известной эффективностью АТР-зависимого гидролиза этого субстрата нативной ЕсLon-протеазой [43]. Интактный фермент характеризуется также способностью деградировать белковый субстрат в присутствии комплекса негидролизуемого аналога АТР, AMPPNP, с ионами магния. Продуктами реакции в этом случае являются высокомолекулярные фрагменты, т.е. протеолиз происходит по непроцессивному механизму и с низкой эффективностью (рис. 5А). Ионы магния отдельно также можно рассматривать в качестве активаторов непроцессивного гидролиза казеина Ес-Lon-протеазой (рис. 5А). В противоположность интактному ферменту протеолитическая активность тройного мутанта LonEKR в присутствии как ионов магния, так и комплекса AMPPNP/Mg за тот же период времени практически не проявляется (рис. 5Б). Полученные результаты могут отражать как ухудшение эффективности связывания белкового субстрата с LonEKR, так и нарушения аллостерических взаимодействий между АТР-азным и протеолитическим центрами в мутантном ферменте.

 

Рис. 5. Гидролиз β-казеина Ес-Lon-протеазой (А) и ее мутантной формой LonEKR (Б) в отсутствие и в присутствии эффекторов (электрофорез в 12% ПААГ). Условия эксперимента: 50 мМ Tрис-HCl-буфер, рН 8.1; 0.2 M NaCl; 37°С; концентрации: β-казеин – 20 мкМ; нуклеотиды – 5 мМ; MgCl2 – 20 мМ; фермент – 1 мкМ

 

Из рис. 5 следует, что в отсутствие эффекторов, а также при наличии ионов магния взаимодействие фермента с белковым субстратом сопровождается выраженным автолизом интактной Lon-протеазы и слабым автолизом мутанта. Изучение автолитической функции нативной и мутантной форм Lon в отсутствие белка-мишени показало, что за исследуемый интервал времени (36 ч – для Lon и 33 ч – для LonEKR) количество обеих форм фермента значительно уменьшается (рис. 6А, Б). При этом автолиз интактной Lon наблюдается исключительно в отсутствие нуклеотидных эффекторов, в то время как автолиз мутанта LonEKR происходит при любых условиях, однако нуклеотиды и их комплексы с ионами магния заметно стабилизируют мутантную форму фермента.

 

Рис. 6. Автолитические свойства интактной Ес-Lon-протеазы (А) и ее мутантных форм LonEKR (Б) и LonEKR-1 (В). М – маркеры; Nu – нуклеотид (АТР, ADP или AMPPNP). Условия эксперимента: 50 мМ Tрис-HCl-буфер, рН 8.1; 0.2 M NaCl; 37°С. Концентрации: нуклеотиды – 5 мМ; MgCl2 – 20 мМ; фермент – 2 мкМ. А – время реакции 36 ч; 0 – контроль (время реакции – 0 ч)

 

С помощью N-концевого секвенирования установлено, что стабильные фрагменты LonEKR образуются в результате автолиза фермента по связям, локализованным во вставочном HI(CC)-домене (F138–E139 и M234–K235), а также на границе NB- и Н-доменов (L490–S491) (рис. 1Б и 7). Продуктами автолиза по связям F138–E139 и M234–K235 являются соответственно Фрагмент-1 с молекулярной массой около 50 кДа и Фрагмент-2 около 44 кДа (рис. 6Б). В этих продуктах отщеплены, по-видимому, также С-концевые части последовательности LonEKR (предположительно Р-домены). Автолитическое расщепление тройного мутанта по связи L490–S491 приводит к образованию Фрагмента-3 (33 кДа), включающего Н- и Р-домены (рис. 6Б и 7).

 

Рис. 7. Локализация сайтов автолиза в нативной EcLon-протеазе и в мутантной форме LonEKR

 

Стабильные фрагменты нативной Lon-протеазы образуются при автолизе, происходящем в NB-домене по связям М410–А411 и I488–R489, и исключительно в отсутствие нуклеотидных эффекторов [43] (рис. 7). В последнем случае так же, как и у LonEKR, образуется фрагмент, включающий α-спирализованный и протеазный домены (НР), мол. масса которого соответствует 33 кДа. Таким образом, результаты автолиза свидетельствуют о различии конформаций интактной Lon-протеазы и ее тройного мутанта LonEKR, а также о возможном влиянии введенных мутаций на эффективность связывания комплексов Nu/Mg.

Расщепление нативного фермента по связи M234–K235, расположенной в характеристической «длинной спирали» СС-участка, тоже возможно, но такой характер деградации имеет место только при ограниченном протеолизе Lon химотрипсином в присутствии нуклеотидов или комплексов Nu/Mg [50]. Таким образом, можно констатировать, что связи M234–K235 и L490–S491 (или I488–R489) локализованы в областях субъединицы Lon, доступных воздействию различных протеаз. Однако расщепление по связи F138–E139, которая находится в N-концевой α-спирали HI(CC)-домена, до сих пор не обнаружили ни в нативной Lon-протеазе, ни в каких-либо ее модифицированных формах.

Сайты автолиза в HI(CC)-домене (а.о. 124–302), не характерные для интактной Lon-протеазы, ранее нашли в трех укороченных по N-концевому домену формах фермента в присутствии комплекса АТР/Mg. Так, форма Lon-d106, утратившая первые 106 а.о., в этих условиях подвергается интенсивному расщеплению по связи A267–K268, локализованной на N-конце последней спирали СС-участка [44]. Поскольку Lon-d106 – единственная укороченная форма, которая сохраняет способность к АТР-зависимому процессивному гидролизу белкового субстрата, сделано заключение о том, что N-домен Lon-протеазы не участвует в реализации механизма процессивного протеолиза, но его присутствие обеспечивает конформационную стабильность фермента в классических условиях его функционирования [44]. Форма Lon-d172, не содержащая первых 172 остатков, также нестабильна в присутствии комплекса ATP/Mg и подвергается автолизу по связи D245–D246 (центральная часть СС-участка) [43]. Полученный методом ограниченного протеолиза фрагмент Lon-протеазы Lon-d234 (а.о. 235–784) тоже проявляет повышенную автолитическую активность в условиях сопряжения с гидролизом АТР: 50%-ный автолиз наблюдается уже через 20 мин, при этом расщепление происходит непосредственно после СС-участка, по связи А286–Е287 [50].

Таким образом показано, что введение трех мутаций в N-концевой домен Lon-протеазы приводит к заметной дестабилизации фермента и вызывает конформационные изменения, которые обусловливают экспонирование в среду скрытого в нативной структуре региона, включающего N-концевую часть α-спирализованного HI(CC)-домена.

Следует отметить, что эти особенности LonEKR становятся еще более очевидными, когда индукция мутантного гена происходит в условиях, неоптимальных для данного фермента (1 мМ IPTG). Полученная таким путем мутантная форма LonEKR-1 подвергается практически полному автолизу за сутки независимо от присутствия нуклеотидов или нуклеотид-магниевых комплексов в реакционной смеси (рис. 6В).

Для дальнейшей характеристики конформационной стабильности Lon-протеазы и ее мутантной формы LonEKR использовали также метод ограниченного протеолиза химотрипсином. Характер химотрипсинолиза нативной Lon-протеазы является эффектор-зависимым [50]. В отсутствие эффекторов образуются лишь N-концевой фрагмент (1–207), Р- и Н-домены, тогда как присутствие нуклеотида ведет к стабилизации центрального NB-домена и, как результат, к образованию добавочного фрагмента (235–584), включающего ААА⁺-модуль и, кроме того, часть HI(CC)-домена (235–302) с линкером (303–325) (рис. 8А). Продукты химотрипсинолиза Lon-протеазы схематически представлены на рис. 9. Присутствие нуклеотид-магниевых комплексов стабилизирует область между АТР-азным модулем и протеазным доменом, что приводит к образованию фрагмента (235–784), упоминаемого выше как Lon-d234 (рис. 8А и 9).

 

Рис. 8. Химотрипсинолиз нативной EcLon-протеазы (А) и мутантных форм LonEKR (Б) и LonEKR-1 (В). М – маркеры; 0 – образец реакционной смеси в начальный момент времени; Nu – нуклеотид (АТР, ADP или AMPPNP). * – Продукты химотрипсинолиза мутантных форм LonEKR и LonEKR-1, N-концы которых не подтверждены секвенированием. Условия эксперимента: 50 мМ Tрис-HCl-буфер; рН 8.1; 0.3 M NaCl; 30 °С. Концентрации: EcLon (LonEKR или LonEKR-1) – 11 мкМ; нуклеотиды – 5 мМ; MgCl2 – 20 мМ; химотрипсин – 0.2 мкМ. А – время реакции 2 ч

 

Рис. 9. Схема строения продуктов ограниченного протеолиза Lon-протеазы E. coli химотрипсином

 

Ограниченный протеолиз формы LonEKR химотрипсином происходит подобным же образом (рис. 8А и Б), и можно полагать, что образующиеся при этом фрагменты не отличаются от продуктов химотрипсинолиза интактного фермента. Однако в случае формы LonEKR-1, полученной при 1 мМ IPTG, образование стабильных фрагментов последовательности, включающих NB-домен, не зафиксировано ни в присутствии нуклеотидов, ни в присутствии их комплексов с ионами магния (рис. 8В). Результаты химотрипсинолиза, свидетельствующие о том, что нуклеотиды и нуклеотид-магниевые комплексы не стабилизируют структуру мутантной формы LonEKR-1, полностью согласуются с данными по автолизу этой формы. Таким образом, индукция гена lonEKR (1 мМ IPTG) является причиной формирования нестабильной конформации фермента LonEKR-1, что приводит к его быстрому автолитическому расщеплению в условиях эксперимента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее мы установили, что N-концевой домен обеспечивает конформационную стабильность EcLon-протеазы. В настоящей работе на основании рентгеноструктурных данных было предложено тестировать роль остатков E34, K35 и R38 N-домена в качестве остатков, участвующих в поддержании стабильной функциональной структуры фермента посредством межсубъединичных и/или междоменных взаимодействий. Показано, что замены этих остатков на аланин с образованием тройного мутанта LonEKR не приводят к значительным изменениям в характере функционирования АТР-азных и пептидгидролазных центров фермента, но вызывают ухудшение связывания белкового субстрата.

Как и нативный фермент, мутантная форма LonEKR образует гексамерные структуры, однако вопрос о возможности формирования мутантных додекамеров остается открытым. При этом форма LonEKR сохраняет главное свойство АТР-зависимых протеаз – способность к процессивной деградации белка-мишени при сопряжении протеолиза с гидролизом АТР, несмотря на детектируемое нарушение межцентровых аллостерических взаимодействий. Вместе с тем, в отличие от интактного фермента, форма LonEKR в некоторой степени дестабилизирована введенными заменами, поскольку нуклеотиды и их комплексы с ионами магния, являющиеся стабилизаторами структуры Lon-протеазы, не способны полностью предотвратить автолитическое расщепление мутанта.

Следует особо подчеркнуть, что ключевую роль в формировании стабильной структуры функционально активной Lon-протеазы играют индукция гена и последующий фолдинг белковой молекулы в условиях краудинг-эффекта. Форма LonEKR-1, полученная при относительно высокой концентрации индуктора (1 мМ IPTG), совсем не стабилизируется нуклеотидами и проявляет повышенную скорость автолиза по сравнению с интактной Lon и формой LonEKR.

Таким образом, в настоящей работе установлено, что остатки E34, K35 и R38 N-концевого домена EcLon-протеазы влияют на формирование корректного сайта связывания белкового субстрата, вовлечены в превращения фермента, вызываемые взаимодействием с нуклеотидами, и участвуют в поддержании конформационной стабильности фермента. Предполагаемое участие изучаемых остатков в образовании додекамерных форм EcLon-протеазы может служить задачей предстоящего структурного исследования мутанта LonEKR.

Об авторах

А. Г. Андрианова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия, Москва

А. М. Куджаев

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия, Москва

В. А. Абрикосова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия, Москва

А. Е. Гущина

Macromolecular Crystallography Laboratory NCI-Frederick

Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
США, Frederick

И. В. Смирнов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия, Москва

Т. В. Ротанова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы