Ингибитор ASIC1a мамбалгин-2 тормозит рост клеток лейкемии, вызывая арест клеточного цикла

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Хроническая миелогенная лейкемия (CML) – наиболее частый вид лейкоза у взрослых. Несмотря на прогресс в терапии CML, обусловленный разработкой ингибиторов тирозинкиназ, клетки CML часто проявляют устойчивость к терапии, а при прогрессии формируется пул быстрорастущих и устойчивых к терапии стволовых опухолевых клеток [1]. По этой причине поиск новых молекулярных мишеней для терапии CML представляет собой актуальную задачу онкологии.

Известно, что в клетках лейкемии человека экспрессируются амилорид-чувствительные протон-управляемые Na⁺-каналы ASIC [2]. Каналы ASIC являются одними из наиболее чувствительных молекулярных сенсоров изменения внеклеточного pH у млекопитающих. В настоящее время известно шесть изоформ этих каналов, широко представленных в мембранах нейрональных и ненейрональных клеток, где ASIC участвуют в таких важных регуляторных функциях, как синаптическая пластичность, обучение, память, восприятие боли, а также в развитии различных патологических состояний [3]. Однако функциональную активность каналов ASIC в клетках рака крови до настоящего времени не изучали. Ингибирование этих каналов в клетках лейкемии может стать перспективной стратегией для борьбы с CML.

Из яда черной мамбы (Dendroaspis polylepis) выделены селективные ингибиторы протон-управляемых ионных каналов ASIC1 – мамбалгины [4]. Мамбалгины обладают сильным анальгезирующим эффектом и эффективно ингибируют каналы ASIC1а [4, 5]. В работе исследовано влияние рекомбинантного мамбалгина-2 на клетки модельной линии CML К562. Впервые в клетках К562 зарегистрированы токи, опосредованные протон-управляемыми ионными каналами ASIC1a, показано, что мамбалгин-2 ингибирует активность этих каналов и тормозит пролиферацию клеток К562, вызывая арест клеточного цикла в фазе G1 и ингибируя активацию циклина D1 и циклинзависимой киназы CDK4. Таким образом, рекомбинантный мамбалгин-2 может рассматриваться в качестве прототипа таргетных препаратов нового класса для терапии хронической миелогенной лейкемии человека.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клетки хронической миелогенной лейкемии человека К562 (Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН) культивировали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Hyclone, Великобритания) при 37°C и 5% CO₂. Для электрофизиологических экспериментов клетки высевали на покровные стекла (4 × 4 мм), предварительно покрытые поли-DL-лизином (Sigma Aldrich, США).

Уровень экспрессии мРНК ASIC в клетках К562 определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Из клеток К562 выделяли суммарную РНК с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Россия), обрабатывали ДНКазой I (Sigma Aldrich) и очищали с помощью набора CleanRNA Stanadart («Евроген»). кДНК синтезировали с помощью Mint-ревертазы («Евроген») и проводили ПЦР с готовой смесью SYBRGreen HS («Евроген») и праймерами (таблица) на амплификаторе Roche LightCycler 96 (Roche, Швейцария). Уровень экспрессии целевых генов нормировали по уровню экспрессии генов домашнего хозяйства β-ACTIN, GPDH и RPL13a на ПО LightCycler SW (Roche).

 

Праймеры, использованные в работе

Ген	Праймер		Ампликон, п.н.
	Прямой	Обратный
β-actin	CATGTACGTTGCTATCCAGGC	CTCCTTAATGTCACGCACGAT	88
GPDH	ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG	GCCATCACGCCACAGTTTC	73
RPL13a	TCAAAGCCTTCGCTAGTCTCC	GGCTCTTTTTGCCCGTATGC	104
ASIC1a	CGAAGCAGGCATCAAAGTGC	TTTGGATGATAGGGAGCCACG	642
ASIC2	CACCAAGACTTCACCACAGTGTTT	TGTAGCGGGTCTCACAGTCA	409
ASIC3	TACAAGAACTGTGCCCACCC	GGTCTTCGGAACAGAGCAGA	502
ASIC4	GAGGAGAGAGACAAGCGGCA	GTCCAGCATGATCTCCAGGC	930

 

Трансмембранные ионные токи регистрировали с помощью метода патч-кламп при отведении сигнала от плазматической мембраны всей клетки (whole-cell). Использовали высокоточный усилитель Axopatch 200B, аналогово-цифровой преобразователь Digidata 1550A (Molecular Devices Corp., CША). Пипетки с сопротивлением 3–6 MОм изготавливали на пуллере Р-97 (Sutter Instrument, США) из стандартных заготовок BF 150-110-10. Наружный раствор (в камере) содержал 145 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 10 мМ HEPES/TrisOH (рН 7.4), а внутриклеточный раствор в пипетке – 140 мМ K-аспартата, 5 мМ NaCl, 2 мМ EGTA, 1 мМ MgCl₂, 20 мМ HEPES/TrisOH, и 0.176 мМ CaCl₂ для создания свободной концентрации ионов кальция на уровне 0.01 мкМ (pCa = 8). Внеклеточный раствор с pH 5.0 содержал MES. Токи регистрировали при поддерживаемом потенциале на мембране -50 мВ. Обработку экспериментальных данных проводили с использованием ПО pCLAMP 10.6 (Molecular Devices Corp.).

Мамбалгин-2 и его мутантный вариант L32A получали в Escherichia coli по разработанной ранее методике [6]. Для определения времени удвоения клетки К562 высевали в 96-луночные культуральные планшеты (5 × 10⁵ клеток/мл) и растили с заменой среды на свежую каждые 24 ч. Количество клеток после разных временных интервалов культивирования определяли подсчетом в камере Горяева («МиниМед», Россия) после окрашивания трипановым синим («ПанЭко»). Для изучения влияния мамбалгина-2 на пролиферацию клетки К562 высевали в 96-луночные культуральные планшеты (5 × 10⁵ клеток/мл или 5 × 10⁵ клеток/лунка), мамбалгин-2 (из 2 мМ стока в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО)) растворяли в культуральной среде и добавляли к клеткам в различных концентрациях. После этого клетки инкубировали в течение 72 ч с заменой среды на свежую каждые 24 ч (перед заменой среды клетки осаждали в течение 5 мин при 200 G). Максимальная концентрация ДМСО не превышала 0.5%, добавленный ДМСО не влиял на рост клеток. Пролиферацию клеток оценивали при помощи МТТ-теста. К клеткам добавляли МТТ (конечная концентрация 0.1 мг/мл), инкубировали в течение 4 ч и образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в изопропаноле с 75 мМ HCl, после чего определяли поглощение в лунках планшета при 540 нм с выравниванием на фон при 655 нм на планшетном ридере Bio-Rad 680. Оптическую плотность лунок планшета нормировали на оптическую плотность лунок с необработанными клетками и анализировали с помощью ПО Graphpad Prism 6.0 (GraphPad Software, США).

Для анализа клеточного цикла клетки К562 высевали в 6-луночные культуральные планшеты (25 × 10⁴ клеток/лунка) и инкубировали с 1 мкМ мамбалгина-2 в течение 72 ч с заменой среды на свежую каждые 24 ч. Затем клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 12 ч (-20°С), дважды промывали раствором Эрла и инкубировали в буфере для экстракции ДНК (200 мМ Na₂HPO₄ с 0.004% Triton X-100, pH 7.8) в течение 5 мин. Затем клетки промывали и ресуспендировали в растворе Эрла с 50 мг/мл йодида пропидия и 0.2 мг/мл РНКазы A, после чего анализировали на цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Процентное содержание клеток в фазах клеточного цикла определяли посредством ПО ModFit LT (Verity Software, США).

Влияние мамбалгина-2 на фосфорилирование регуляторов клеточного цикла анализировали с помощью вестерн-блотинга. Клетки лизировали в буфере RIPA с ингибиторами протеаз SIGMAFAST (Sigma Aldrich), лизаты разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Santa Cruz, США). Мембраны блокировали в 5% обезжиренном молоке («Диа-М», Россия) в течение 2 ч, а затем инкубировали в течение 16 ч (4°C) с первичными антителами кролика к циклину D1 (pSer90, Antibodies online, Германия, ABIN6271254), циклинзависимой киназе CDK4 (pThr172, Antibodies online, ABIN6271182) и циклинзависимой киназе CDK6 (pTyr24, Antibodies online, ABIN319289), а также с первичными антителами мыши к β-актину (R&D Systems, США, MAB8929). Затем мембраны промывали 3 раза в TBS + 0.1% Tween-20 и инкубировали в течение 1 ч с HRP-конъюгированными антикроличьими (Jackson Immunoresearch, Великобритания, 111-035-003) или антимышиными (Jackson Immunoresearch, 715-035-150) вторичными антителами. После этого мембраны промывали 4 раза TBS + 0.1% Tween-20 и детектировали белки с помощью субстрата ECL (Bio-Rad, США) на документирующей системе LAS500 (GE Healthcare, США). Интенсивность полос оценивали с помощью ПО ImageJ (NIH, США).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее было показано, что в линии клеток лейкемии человека К562 экспрессируются ионные каналы ASIC1 [2]. В настоящей работе с помощью ПЦР в реальном времени мы подтвердили экспрессию ASIC1a в клетках К562, в то время как экспрессия ASIC2, ASIC3 и ASIC4 не была выявлена (рис. 1А). Известно, что снижение рН в среде, окружающей клетку, приводит к активации протон-управляемых ионных каналов, опосредующих пролиферацию и миграцию опухолевых клеток [7]. Чтобы определить, вызывает ли снижение внеклеточного рН активацию входящих токов через мембрану клеток К562, мы провели электрофизиологические эксперименты методом патч-кламп в конфигурации whole-cell. Мы обнаружили, что быстрое изменение pH внеклеточного раствора с 7.4 до 5.0 приводит к активации H⁺-чувствительных натриевых токов (рис. 1Б). Снижение рН приводило к быстрому нарастанию амплитуды тока до максимальной и более медленному спаду в ходе десенситизации до стационарного уровня, что характерно для протон-управляемых катионных каналов ASIC1а [8]. Амплитуды ответов при pH 5.0 составляли 7–16 пА (n = 6). Блокирование входящих токов, наблюдаемых при низких значениях pH (5.0), производным амилорида – бензамилом (1 мкМ), подтвердило принадлежность протон-управляемых ионных каналов к семейству ASIC1а (рис. 1В). Таким образом, для клеток К562 характерны вызываемые закислением внешней среды транзиентные токи, обуславливаемые ASIC1а. Добавление 1 мкМ мамбалгина-2 во внеклеточный раствор с pH 5.0 полностью ингибировало активацию протон-управляемых натриевых токов в клетках К562 (рис. 1Г). Последующая замена внеклеточного раствора на аналогичный без мамбалгина-2 (с pH 7.4 и 5.0) приводила к повторной активации протон-управляемых ионных каналов (рис. 1Г), указывая на обратимое действие мамбалгина-2.

 

Рис. 1. Действие мамбалгина-2 на протон-управляемые натриевые каналы в клетках К562. А – анализ экспрессии мРНК различных типов ASIC с помощью ПЦР в реальном времени (n = 3). Б – активация каналов, вызванная быстрой сменой внеклеточного раствора с pH 7.4 до 5.0, поддерживаемый потенциал на мембране -50 мВ. В – токи, активированные pH 5.0, до, во время и после подачи 1 мкМ бензамила. Г – токи, активированные pH 5.0, до, во время и после подачи 1 мкМ мамбалгина-2

 

Время удвоения клеток К562, определенное подсчетом после окрашивания трипановым синим, составило ~ 35 ч (рис. 2А). Мы протестировали pH клеточной среды в процессе роста клеток К562 и обнаружили, что при ежедневной замене среды на свежую клетки К562 через 72 ч закисляют среду, снижая значение рН с 7.6 ± 0.06 до 6.6 ± 0.07 (рис. 2Б), что достаточно для активации ASIC1a [3]. Таким образом, по-видимому, быстро пролиферирующие клетки К562 в высокой плотности из-за активного метаболизма закисляют клеточную среду, активируя тем самым протон-управляемые ионные каналы.

Ранее было показано, что ингибирование ASIC1a при помощи псалмотоксина (PcTx1) из яда тарантула Psalmopoeus cambridgei и бензамила тормозит рост опухолевых клеток [9], поэтому нами было оценено влияние мамбалгина-2 на рост клеток К562. МТТ-тест показал, что инкубация клеток К562 с мамбалгином-2 в течение 72 ч приводит к сокращению числа жизнеспособных клеток до 68.2 ± 5.8% по сравнению с необработанными клетками (контроль) с полумаксимальной эффективной концентрацией (EC₅₀) 179.9 ± 20.8 нМ. При этом антипролиферативный эффект мамбалгина-2 в диапазоне концентраций от 10^-10 до 10^-7 М был выражен значительно слабее, чем у блокатора ASIC1a амилорида (рис. 2В). Для подтверждения связи антипролиферативной активности мамбалгина-2 с его взаимодействием с ASIC1a мы использовали мутантный вариант токсина с заменой L32A, который обладает пониженной аффинностью к ASIC1a и поэтому не способен ингибировать токи через ASIC1a [10]. Действительно, в отличие от рекомбинантного мамбалгина-2, мутант L32A не влиял на рост клеток К562 (рис. 2Г). Таким образом, основной молекулярной мишенью мамбалгина-2 в клетках К562 является именно ASIC1a. По-видимому, при пролиферации клеток К562 происходит закисление среды, что приводит к активации и последующей десенситизации канала ASIC1а, а мамбалгин-2 снижает рост клеток К562, стабилизируя канал в десенситизированном состоянии. Это согласуется с ранее полученными данными о взаимодействии мамбалгина-2 с каналом ASIC1a в десенситизированном состоянии [4, 11].

 

Рис. 2. Влияние мамбалгина-2 на рост клеток К562. А – зависимость роста клеток К562 от времени культивирования. Время удвоения клеток вычисляли с помощью линейной регрессии. Б – изменение рН среды при инкубации клеток в течение 72 ч. Данные приведены как значения рН ± SEM (n = 3); **** (p <0.0001) указывает на разницу между группами данных согласно двустороннему t-тесту. В – влияние различных концентраций мамбалгина-2 на пролиферацию клеток. Данные приведены как % от контроля (необработанные клетки) ± SEM (n = 3–6). * (р <0.05) и ** (р <0.01) означает различие между группами данных согласно двустороннему t-тесту. Г – антипролиферативная активность мамбалгина-2 и его мутантного варианта L32A. Данные приведены как % от контроля (необработанные клетки, пунктирная линия) ± SEM (n = 3); ** (р<0.01) означает различие между группами данных согласно двустороннему t-тесту

 

Ранее было обнаружено, что PcTx1 и бензамил вызывают остановку клеточного цикла в фазе G0/G1 и ингибируют циклинзависимые киназы [9]. Инкубация клеток К562 с мамбалгином-2 также приводила к увеличению количества клеток в фазе G1 клеточного цикла на 33% при уменьшении количества клеток в фазе G2 на 54%, что свидетельствует об аресте клеточного цикла в фазе G1 (рис. 3А,Б). Методом вестерн-блотинга показано, что инкубация клеток К562 с мамбалгином-2 приводит к падению фосфорилирования циклина D1 и циклинзависимой киназы CDK4, но не циклинзависимой киназы CDK6 (рис. 3В,Г). Формирование комплекса между циклином D1 и циклинзависимой киназой CDK4 необходимо для активации CDK4 и перехода клетки в фазу синтеза ДНК, поэтому ингибирование активности циклина D1 и CDK4 приводит к аресту клеточного цикла. Повышенная экспрессия циклина D1 в фазе акселерации CML считается негативным прогностическим фактором, поэтому ингибирование циклина D1 может стать новой стратегией для лечения больных хронической миелогенной лейкемией [12].

 

Рис. 3. Влияние мамбалгина-2 на клеточный цикл в линии клеток К562. А – распределение ядер клеток до и после инкубации в течение 72 ч с мамбалгином-2. Б – содержание клеток в различных фазах клеточного цикла. Данные представлены в виде % клеток в каждой фазе клеточного цикла ± SEM (n = 4); ** (р <0.01) и *** (р <0.001) указывают на разницу между контролем (необработанные клетки) и клетками, обработанными мамбалгином-2, согласно двустороннему t-тесту. В – репрезентативный вестерн-блот, демонстрирующий влияние мамбалгина-2 на фосфорилирование регуляторов клеточного цикла. Г – количественная оценка интенсивностей полос регуляторов клеточного цикла после инкубации клеток с мамбалгином-2. Данные приведены как нормализованная интенсивность полос ± SEM (n = 4); * (р <0.05) указывает на разницу между контролем (необработанные клетки) и клетками, обработанными мамбалгином-2, согласно двустороннему t-тесту

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые в клетках лейкемии К562 обнаружены функционально-активные протон-управляемые ионные каналы ASIC1a. Показано, что мамбалгин-2 подавляет их активность и тормозит пролиферацию клеток лейкемии, вызывая арест клеточного цикла в фазе G1 и снижая активность регуляторов клеточного цикла – циклина D1 и циклинзависимой киназы CDK4. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования ASIC1a в качестве молекулярной терапевтической мишени при CML, а рекомбинантного мамбалгина-2 – в качестве прототипа новых таргетных противоопухолевых препаратов.

ВВЕДЕНИЕ

Хроническая миелогенная лейкемия (CML) – наиболее частый вид лейкоза у взрослых. Несмотря на прогресс в терапии CML, обусловленный разработкой ингибиторов тирозинкиназ, клетки CML часто проявляют устойчивость к терапии, а при прогрессии формируется пул быстрорастущих и устойчивых к терапии стволовых опухолевых клеток [1]. По этой причине поиск новых молекулярных мишеней для терапии CML представляет собой актуальную задачу онкологии.

Известно, что в клетках лейкемии человека экспрессируются амилорид-чувствительные протон-управляемые Na⁺-каналы ASIC [2]. Каналы ASIC являются одними из наиболее чувствительных молекулярных сенсоров изменения внеклеточного pH у млекопитающих. В настоящее время известно шесть изоформ этих каналов, широко представленных в мембранах нейрональных и ненейрональных клеток, где ASIC участвуют в таких важных регуляторных функциях, как синаптическая пластичность, обучение, память, восприятие боли, а также в развитии различных патологических состояний [3]. Однако функциональную активность каналов ASIC в клетках рака крови до настоящего времени не изучали. Ингибирование этих каналов в клетках лейкемии может стать перспективной стратегией для борьбы с CML.

Из яда черной мамбы (Dendroaspis polylepis) выделены селективные ингибиторы протон-управляемых ионных каналов ASIC1 – мамбалгины [4]. Мамбалгины обладают сильным анальгезирующим эффектом и эффективно ингибируют каналы ASIC1а [4, 5]. В работе исследовано влияние рекомбинантного мамбалгина-2 на клетки модельной линии CML К562. Впервые в клетках К562 зарегистрированы токи, опосредованные протон-управляемыми ионными каналами ASIC1a, показано, что мамбалгин-2 ингибирует активность этих каналов и тормозит пролиферацию клеток К562, вызывая арест клеточного цикла в фазе G1 и ингибируя активацию циклина D1 и циклинзависимой киназы CDK4. Таким образом, рекомбинантный мамбалгин-2 может рассматриваться в качестве прототипа таргетных препаратов нового класса для терапии хронической миелогенной лейкемии человека.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клетки хронической миелогенной лейкемии человека К562 (Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН) культивировали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Hyclone, Великобритания) при 37°C и 5% CO₂. Для электрофизиологических экспериментов клетки высевали на покровные стекла (4 × 4 мм), предварительно покрытые поли-DL-лизином (Sigma Aldrich, США).

Уровень экспрессии мРНК ASIC в клетках К562 определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Из клеток К562 выделяли суммарную РНК с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Россия), обрабатывали ДНКазой I (Sigma Aldrich) и очищали с помощью набора CleanRNA Stanadart («Евроген»). кДНК синтезировали с помощью Mint-ревертазы («Евроген») и проводили ПЦР с готовой смесью SYBRGreen HS («Евроген») и праймерами (таблица) на амплификаторе Roche LightCycler 96 (Roche, Швейцария). Уровень экспрессии целевых генов нормировали по уровню экспрессии генов домашнего хозяйства β-ACTIN, GPDH и RPL13a на ПО LightCycler SW (Roche).

Трансмембранные ионные токи регистрировали с помощью метода патч-кламп при отведении сигнала от плазматической мембраны всей клетки (whole-cell). Использовали высокоточный усилитель Axopatch 200B, аналогово-цифровой преобразователь Digidata 1550A (Molecular Devices Corp., CША). Пипетки с сопротивлением 3–6 MОм изготавливали на пуллере Р-97 (Sutter Instrument, США) из стандартных заготовок BF 150-110-10. Наружный раствор (в камере) содержал 145 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 10 мМ HEPES/TrisOH (рН 7.4), а внутриклеточный раствор в пипетке – 140 мМ K-аспартата, 5 мМ NaCl, 2 мМ EGTA, 1 мМ MgCl₂, 20 мМ HEPES/TrisOH, и 0.176 мМ CaCl₂ для создания свободной концентрации ионов кальция на уровне 0.01 мкМ (pCa = 8). Внеклеточный раствор с pH 5.0 содержал MES. Токи регистрировали при поддерживаемом потенциале на мембране -50 мВ. Обработку экспериментальных данных проводили с использованием ПО pCLAMP 10.6 (Molecular Devices Corp.).

Мамбалгин-2 и его мутантный вариант L32A получали в Escherichia coli по разработанной ранее методике [6]. Для определения времени удвоения клетки К562 высевали в 96-луночные культуральные планшеты (5 × 10⁵ клеток/мл) и растили с заменой среды на свежую каждые 24 ч. Количество клеток после разных временных интервалов культивирования определяли подсчетом в камере Горяева («МиниМед», Россия) после окрашивания трипановым синим («ПанЭко»). Для изучения влияния мамбалгина-2 на пролиферацию клетки К562 высевали в 96-луночные культуральные планшеты (5 × 10⁵ клеток/мл или 5 × 10⁵ клеток/лунка), мамбалгин-2 (из 2 мМ стока в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО)) растворяли в культуральной среде и добавляли к клеткам в различных концентрациях. После этого клетки инкубировали в течение 72 ч с заменой среды на свежую каждые 24 ч (перед заменой среды клетки осаждали в течение 5 мин при 200 G). Максимальная концентрация ДМСО не превышала 0.5%, добавленный ДМСО не влиял на рост клеток. Пролиферацию клеток оценивали при помощи МТТ-теста. К клеткам добавляли МТТ (конечная концентрация 0.1 мг/мл), инкубировали в течение 4 ч и образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в изопропаноле с 75 мМ HCl, после чего определяли поглощение в лунках планшета при 540 нм с выравниванием на фон при 655 нм на планшетном ридере Bio-Rad 680. Оптическую плотность лунок планшета нормировали на оптическую плотность лунок с необработанными клетками и анализировали с помощью ПО Graphpad Prism 6.0 (GraphPad Software, США).

Для анализа клеточного цикла клетки К562 высевали в 6-луночные культуральные планшеты (25 × 10⁴ клеток/лунка) и инкубировали с 1 мкМ мамбалгина-2 в течение 72 ч с заменой среды на свежую каждые 24 ч. Затем клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 12 ч (-20°С), дважды промывали раствором Эрла и инкубировали в буфере для экстракции ДНК (200 мМ Na₂HPO₄ с 0.004% Triton X-100, pH 7.8) в течение 5 мин. Затем клетки промывали и ресуспендировали в растворе Эрла с 50 мг/мл йодида пропидия и 0.2 мг/мл РНКазы A, после чего анализировали на цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Процентное содержание клеток в фазах клеточного цикла определяли посредством ПО ModFit LT (Verity Software, США).

Влияние мамбалгина-2 на фосфорилирование регуляторов клеточного цикла анализировали с помощью вестерн-блотинга. Клетки лизировали в буфере RIPA с ингибиторами протеаз SIGMAFAST (Sigma Aldrich), лизаты разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Santa Cruz, США). Мембраны блокировали в 5% обезжиренном молоке («Диа-М», Россия) в течение 2 ч, а затем инкубировали в течение 16 ч (4°C) с первичными антителами кролика к циклину D1 (pSer90, Antibodies online, Германия, ABIN6271254), циклинзависимой киназе CDK4 (pThr172, Antibodies online, ABIN6271182) и циклинзависимой киназе CDK6 (pTyr24, Antibodies online, ABIN319289), а также с первичными антителами мыши к β-актину (R&D Systems, США, MAB8929). Затем мембраны промывали 3 раза в TBS + 0.1% Tween-20 и инкубировали в течение 1 ч с HRP-конъюгированными антикроличьими (Jackson Immunoresearch, Великобритания, 111-035-003) или антимышиными (Jackson Immunoresearch, 715-035-150) вторичными антителами. После этого мембраны промывали 4 раза TBS + 0.1% Tween-20 и детектировали белки с помощью субстрата ECL (Bio-Rad, США) на документирующей системе LAS500 (GE Healthcare, США). Интенсивность полос оценивали с помощью ПО ImageJ (NIH, США).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее было показано, что в линии клеток лейкемии человека К562 экспрессируются ионные каналы ASIC1 [2]. В настоящей работе с помощью ПЦР в реальном времени мы подтвердили экспрессию ASIC1a в клетках К562, в то время как экспрессия ASIC2, ASIC3 и ASIC4 не была выявлена (рис. 1А). Известно, что снижение рН в среде, окружающей клетку, приводит к активации протон-управляемых ионных каналов, опосредующих пролиферацию и миграцию опухолевых клеток [7]. Чтобы определить, вызывает ли снижение внеклеточного рН активацию входящих токов через мембрану клеток К562, мы провели электрофизиологические эксперименты методом патч-кламп в конфигурации whole-cell. Мы обнаружили, что быстрое изменение pH внеклеточного раствора с 7.4 до 5.0 приводит к активации H⁺-чувствительных натриевых токов (рис. 1Б). Снижение рН приводило к быстрому нарастанию амплитуды тока до максимальной и более медленному спаду в ходе десенситизации до стационарного уровня, что характерно для протон-управляемых катионных каналов ASIC1а [8]. Амплитуды ответов при pH 5.0 составляли 7–16 пА (n = 6). Блокирование входящих токов, наблюдаемых при низких значениях pH (5.0), производным амилорида – бензамилом (1 мкМ), подтвердило принадлежность протон-управляемых ионных каналов к семейству ASIC1а (рис. 1В). Таким образом, для клеток К562 характерны вызываемые закислением внешней среды транзиентные токи, обуславливаемые ASIC1а. Добавление 1 мкМ мамбалгина-2 во внеклеточный раствор с pH 5.0 полностью ингибировало активацию протон-управляемых натриевых токов в клетках К562 (рис. 1Г). Последующая замена внеклеточного раствора на аналогичный без мамбалгина-2 (с pH 7.4 и 5.0) приводила к повторной активации протон-управляемых ионных каналов (рис. 1Г), указывая на обратимое действие мамбалгина-2.

 

Рис. 1. Действие мамбалгина-2 на протон-управляемые натриевые каналы в клетках К562. А – анализ экспрессии мРНК различных типов ASIC с помощью ПЦР в реальном времени (n = 3). Б – активация каналов, вызванная быстрой сменой внеклеточного раствора с pH 7.4 до 5.0, поддерживаемый потенциал на мембране -50 мВ. В – токи, активированные pH 5.0, до, во время и после подачи 1 мкМ бензамила. Г – токи, активированные pH 5.0, до, во время и после подачи 1 мкМ мамбалгина-2

 

Время удвоения клеток К562, определенное подсчетом после окрашивания трипановым синим, составило ~ 35 ч (рис. 2А). Мы протестировали pH клеточной среды в процессе роста клеток К562 и обнаружили, что при ежедневной замене среды на свежую клетки К562 через 72 ч закисляют среду, снижая значение рН с 7.6 ± 0.06 до 6.6 ± 0.07 (рис. 2Б), что достаточно для активации ASIC1a [3]. Таким образом, по-видимому, быстро пролиферирующие клетки К562 в высокой плотности из-за активного метаболизма закисляют клеточную среду, активируя тем самым протон-управляемые ионные каналы.

Ранее было показано, что ингибирование ASIC1a при помощи псалмотоксина (PcTx1) из яда тарантула Psalmopoeus cambridgei и бензамила тормозит рост опухолевых клеток [9], поэтому нами было оценено влияние мамбалгина-2 на рост клеток К562. МТТ-тест показал, что инкубация клеток К562 с мамбалгином-2 в течение 72 ч приводит к сокращению числа жизнеспособных клеток до 68.2 ± 5.8% по сравнению с необработанными клетками (контроль) с полумаксимальной эффективной концентрацией (EC₅₀) 179.9 ± 20.8 нМ. При этом антипролиферативный эффект мамбалгина-2 в диапазоне концентраций от 10^-10 до 10^-7 М был выражен значительно слабее, чем у блокатора ASIC1a амилорида (рис. 2В). Для подтверждения связи антипролиферативной активности мамбалгина-2 с его взаимодействием с ASIC1a мы использовали мутантный вариант токсина с заменой L32A, который обладает пониженной аффинностью к ASIC1a и поэтому не способен ингибировать токи через ASIC1a [10]. Действительно, в отличие от рекомбинантного мамбалгина-2, мутант L32A не влиял на рост клеток К562 (рис. 2Г). Таким образом, основной молекулярной мишенью мамбалгина-2 в клетках К562 является именно ASIC1a. По-видимому, при пролиферации клеток К562 происходит закисление среды, что приводит к активации и последующей десенситизации канала ASIC1а, а мамбалгин-2 снижает рост клеток К562, стабилизируя канал в десенситизированном состоянии. Это согласуется с ранее полученными данными о взаимодействии мамбалгина-2 с каналом ASIC1a в десенситизированном состоянии [4, 11].

 

Рис. 2. Влияние мамбалгина-2 на рост клеток К562. А – зависимость роста клеток К562 от времени культивирования. Время удвоения клеток вычисляли с помощью линейной регрессии. Б – изменение рН среды при инкубации клеток в течение 72 ч. Данные приведены как значения рН ± SEM (n = 3); **** (p <0.0001) указывает на разницу между группами данных согласно двустороннему t-тесту. В – влияние различных концентраций мамбалгина-2 на пролиферацию клеток. Данные приведены как % от контроля (необработанные клетки) ± SEM (n = 3–6). * (р <0.05) и ** (р <0.01) означает различие между группами данных согласно двустороннему t-тесту. Г – антипролиферативная активность мамбалгина-2 и его мутантного варианта L32A. Данные приведены как % от контроля (необработанные клетки, пунктирная линия) ± SEM (n = 3); ** (р<0.01) означает различие между группами данных согласно двустороннему t-тесту

 

Ранее было обнаружено, что PcTx1 и бензамил вызывают остановку клеточного цикла в фазе G0/G1 и ингибируют циклинзависимые киназы [9]. Инкубация клеток К562 с мамбалгином-2 также приводила к увеличению количества клеток в фазе G1 клеточного цикла на 33% при уменьшении количества клеток в фазе G2 на 54%, что свидетельствует об аресте клеточного цикла в фазе G1 (рис. 3А,Б). Методом вестерн-блотинга показано, что инкубация клеток К562 с мамбалгином-2 приводит к падению фосфорилирования циклина D1 и циклинзависимой киназы CDK4, но не циклинзависимой киназы CDK6 (рис. 3В,Г). Формирование комплекса между циклином D1 и циклинзависимой киназой CDK4 необходимо для активации CDK4 и перехода клетки в фазу синтеза ДНК, поэтому ингибирование активности циклина D1 и CDK4 приводит к аресту клеточного цикла. Повышенная экспрессия циклина D1 в фазе акселерации CML считается негативным прогностическим фактором, поэтому ингибирование циклина D1 может стать новой стратегией для лечения больных хронической миелогенной лейкемией [12].

 

Рис. 3. Влияние мамбалгина-2 на клеточный цикл в линии клеток К562. А – распределение ядер клеток до и после инкубации в течение 72 ч с мамбалгином-2. Б – содержание клеток в различных фазах клеточного цикла. Данные представлены в виде % клеток в каждой фазе клеточного цикла ± SEM (n = 4); ** (р <0.01) и *** (р <0.001) указывают на разницу между контролем (необработанные клетки) и клетками, обработанными мамбалгином-2, согласно двустороннему t-тесту. В – репрезентативный вестерн-блот, демонстрирующий влияние мамбалгина-2 на фосфорилирование регуляторов клеточного цикла. Г – количественная оценка интенсивностей полос регуляторов клеточного цикла после инкубации клеток с мамбалгином-2. Данные приведены как нормализованная интенсивность полос ± SEM (n = 4); * (р <0.05) указывает на разницу между контролем (необработанные клетки) и клетками, обработанными мамбалгином-2, согласно двустороннему t-тесту

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые в клетках лейкемии К562 обнаружены функционально-активные протон-управляемые ионные каналы ASIC1a. Показано, что мамбалгин-2 подавляет их активность и тормозит пролиферацию клеток лейкемии, вызывая арест клеточного цикла в фазе G1 и снижая активность регуляторов клеточного цикла – циклина D1 и циклинзависимой киназы CDK4. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования ASIC1a в качестве молекулярной терапевтической мишени при CML, а рекомбинантного мамбалгина-2 – в качестве прототипа новых таргетных противоопухолевых препаратов.

Об авторах

М. Л. Бычков

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия, Москва

М. А. Шулепко

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия, Москва

В. Ю. Васильева

Институт цитологии РАН

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия, Санкт-Петербург

А. В. Сударикова

Институт цитологии РАН

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия, Санкт-Петербург

М. П. Кирпичников

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия, Москва

Е. Н. Люкманова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы