GLAD-ПЦР-анализ сайтов метилирования ДНК в регуляторных областях генов-онкосупрессоров при раке желудка

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Рак желудка (РЖ) – одно из наиболее распространенных онкологических заболеваний, занимающее третье место в мире по числу смертельных исходов (более 700 тысяч в год) [1]. По данным ВОЗ, в 2018 году диагностировано свыше 1 млн новых случаев РЖ, а число умерших составило примерно 783 тысячи [2].

Прогноз заболевания в значительной степени зависит от клинической стадии, но в целом остается достаточно неблагоприятным: только у 40% пациентов к моменту постановки диагноза болезнь является потенциально излечимой, а общая пятилетняя выживаемость при РЖ в большинстве стран мира не превышает 25–30% [3, 4]. Вместе с тем выявление заболевания на ранней стадии (IA–IB) позволяет увеличить этот показатель до 80% и более [5, 6].

Перспективным инструментом раннего выявления и мониторинга РЖ считается эпигенетическая ДНК-диагностика, включающая определение аберрантно метилированных регуляторных участков генов-онкосупрессоров в опухолевой ДНК, которые инактивируются при такой модификации. Аберрантное метилирование характерно для начальных стадий большинства ненаследственных (спорадических) форм рака, составляющих в среднем более 90% всех случаев злокачественных новообразований [7, 8].

Известно, что метилирование ДНК de novo, в том числе и аберрантное, осуществляют ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a и Dnmt3b, которые узнают преимущественно сайт RCGY (где R – A или G, Y – T или C) и модифицируют его с образованием последовательности R(5mC)GY в обеих цепях ДНК [5]. В дальнейшем метилирование таких сайтов поддерживается в ходе репликации ДНК-метилтрансферазой Dnmt1 [9].

Метилзависимая сайт-специфичная ДНК-эндонуклеаза GlaI узнает и расщепляет именно сайты R(5mC)GY, что делает ее удобным инструментом для изучения метилирования ДНК [10]. На основе уникальной специфичности фермента GlaI нами ранее был разработан метод GLAD-ПЦР, позволяющий выявлять сайты R(5mC)GY в геноме даже в условиях значительного избытка молекул ДНК, в которых эти сайты неметилированы [11].

GLAD-ПЦР отличается более высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов в сравнении с общепринятым методом бисульфитного секвенирования ДНК, поскольку бисульфитная конверсия часто сопровождается существенной деградацией ДНК и значительными потерями исследуемого материала [11].

Ранее мы применили метод GLAD-ПЦР для изучения метилирования генов-онкосупрессоров в тканях колоректального рака и выявили аберрантное метилирование сайтов RCGY в генах fbn1, cnrip1, adhfe1, ryr2, sept9I и eid3 более чем в 75% образцов опухолевой ДНК [12, 13].

Цель данной работы состояла в применении GLAD-ПЦР-анализа для обнаружения аберрантно метилированных сайтов R(5mC)GY в регуляторных областях генов-онкосупрессоров в ДНК из тканей РЖ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалом для анализа служили образцы ДНК, выделенные из опухолей слизистой желудка, полученных от 29 пациентов в ходе оперативного вмешательства. Во всех случаях диагностирована аденокарцинома желудка различной степени дифференцировки. Пять больных имели I клиническую стадию заболевания (T1N0-1M0, T2N0M0), 11 – II стадию (T1N2-3M0, T2N1-2M0, T3N0-1M0, T4aN0M0), 10 – III стадию (T2N3M0, T3N2-3M0, T4aN1-3M0, T4bN0-3M0), у трех пациентов выявлена IV стадия РЖ (наличие отдаленных метастазов (М1) при любом размере первичной опухоли (T) и наличии или отсутствии метастатического поражения регионарных лимфатических узлов (N)).

В качестве сравнительного контроля использовали образцы ДНК, выделенные из фрагментов морфологически неизмененной слизистой желудка, взятой у 25 больных на линии резекции – на расстоянии не менее 5 см от макроскопически определяемого края опухоли.

От всех пациентов получено информированное согласие на участие в исследовании.

Образцы тканей, полученные при выполнении оперативного вмешательства, помещали в пробирку, содержащую раствор RNA-later, и хранили в течение суток в холодильнике при температуре +4°С, затем переносили в морозильную камеру и хранили при температуре –20°С [12].

Выделение и очистку ДНК проводили методом фенольно-хлороформной экстракции [14].

GLAD-ПЦР-анализ

GLAD-ПЦР-анализ образцов ДНК включал три стадии: 1) гидролиз ДНК ферментом GlaI; 2) лигирование полученных гидролизатов ДНК с универсальным адаптером; 3) последующую ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентного зонда и первого праймера, комплементарных целевому участку ДНК, а также второго праймера, соответствующего последовательности адаптера и участку ДНК вблизи определяемого сайта GlaI (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема метода GLAD-ПЦР

 

Для постановки всех этапов GLAD-ПЦР применяли реагенты производства ООО «Сибэнзайм».

Ферментативный гидролиз ДНК проводили в течение 30 мин при 30°С. Реакционная смесь (объемом 21.5 мкл) включала 9.0 нг ДНК исследуемого образца, 1× SE-буфер TMN (10 мМ Трис-HCl (pH 7.9), 5 мМ MgCl₂, 25 мМ NaCl), 2.0% диметилсульфоксида (ДМСО), 2.0 мкг бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1.5 ед. акт. эндонуклеазы GlaI.

Для лигирования продуктов гидролиза с адаптером (в объеме 30.0 мкл) к каждой пробе добавляли АТР и универсальный двухцепочечный адаптер (5’-CCTGCTCTTTCATCG-3’/3’-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5’) до конечной концентрации каждого 0.5 мкМ и 240 ед. акт. высокоактивной T4-ДНК-лигазы. Реакцию проводили в течение 15 мин при 25°С.

На заключительной стадии в реакционную смесь вносили компоненты ПЦР до следующих концентраций в конечном объеме 60.0 мкл: 1× SE-буфер GLAD (50 мМ Трис-SO₄ (pH 9.0), 30 мМ KCl, 10 мМ [NH₄]₂SO₄), 3 мМ MgCl₂, смесь dNTP по 0.2 мМ каждого, 0.1 мкг/мкл БСА, соответствующую смесь двух праймеров и зонда по 0.4 мкМ каждого, 0.05 ед. акт. SP Taq-ДНК-полимеразы. Для повышения эффективности амплификации GC-богатых участков гена tfpi2 в ПЦР-смесь дополнительно добавляли ДМСО до концентрации 4%.

Затем по 20.0 мкл полученной смеси переносили в три отдельные микропробирки и проводили ПЦР в режиме реального времени в детектирующем амплификаторе «CXF-96» (Bio-Rad Lab., США) по программе: 3 мин при 95^оС и 45 циклов – 10 c при 95°С, 15 с при 61°С (bves, gata4, sox17, tcf21) или при 62°С (cacna2d3, galr1, hs3st2, pcdh10, rprm, sfrp2, wnt5a), или при 63°С (cdh11, cpeb1, fgf2, hopx, tfpi2, zfp82), 20 с при 72°С. Для устранения влияния возможных начальных флуктуаций на форму кривой амплификации флуоресценцию на первых пяти циклах ПЦР не детектировали.

Подбор специфичных праймеров и зондов

Для подбора специфичных праймеров и зондов анализировали нуклеотидные последовательности, представленные в базе данных GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov/genbank), по версии генома человека GRCh38/hg38, семейство программ Vector NTI 11.5 (Invitrogen, США) и онлайн-ресурс BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Структуры использованных в работе праймеров и зондов приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Структуры праймеров и флуоресцентных зондов, используемых для GLAD-ПЦР-анализа генов-онкомаркеров РЖ

Генa	Кодируемый белковый продуктa	Локализация гена в хромосомеa	Последовательность первого праймера и флуоресцентного зондаb
brinp1	BMP / retinoic acid inducible neural specific 1	9q33.1	FAM-CCGTAAAGTCCCCTTCGCTGGTCCC-BHQ1 GAGCCGGGATTCATGCCTGTC
bves	Blood vessel epicardial substance	6q21	CCGGCGGCATTCGTCGTT FAM-CCCTACCCGGACCGCACTTCTCGAA-BHQ1
cacna2d3	Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit alpha2delta 3	3p21.1-p14.3	FAM-CGCACTCGGGAAAAGCACTAAGAGCCTC-BHQ1 CGAGGGAGAAGGACTGCTACCGA
cdh11	Cadherin 11	16q21	CGCTCCAGCTGGCCAGGC FAM-CTTCCCCCAACCACCATCCCGGC-BHQ1
cpeb1	Cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1	15q25.2	CTGCCCTGGGCCTCAGTTTCC FAM-CCCCTGCGAGCGGCGGCG-BHQ1
epha7	EPH receptor A7	6q16.1	FAM-CCAAGCACGGAGCCCGGACAGTGA-BHQ1 CCCAGCCCGCGGAGGTTC
fgf2	Fibroblast growth factor 2	4q28.1	CGGGGTCCGGGAGAAGAGC FAM-CCGACCCGCTCTCTCCGCCTCATT-BHQ1
galr1	Galanin receptor 1	18q23	FAM-TGCAGCAGAGAAGCCCCTGGCACC-BHQ1 GGCGAGAGCTCTTTTGGGAGGC
gata4	GATA binding protein 4	8p23.1	CCTTTCTGGCCGGCCTCCT FAM-AGTCCCTGGACCCCAGCCCCGA-BHQ1
hopx	HOP homeobox	4q12	CGGGCAGAAGCGATGGGAGA FAM-CCCGCCGGGCTGCCCTCC-BHQ1
hs3st2	Heparan sulfate-glucosamine 3-sulfotransferase 2	16p12.2	GCCTCCCGGAGGAGTACTATGCC FAM-CACCTTCGTTTCACCGCCCCAAAGC-BHQ1
irx1	Iroquois homeobox 1	5p15.33	GCCAGGGAGCGGGTAGCGA FAM-CTCCACGGGCCTGCTTCTGCGG-BHQ1
lrrc3b	Leucine rich repeat containing 3B	3p24.1	FAM-TGCTCACCCCGTGCTGTGCAACTTG-BHQ1 GGGCTGGGGGAAGGGCAA
pcdh10	Protocadherin 10	4q28.3	CCGGCCCTTGTATCTCTGGTGC FAM-CCGCCCATCTCTGCTCCCACAACG-BHQ1
rprm	Reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator homolog	2q23.3	CCCCGTTCAAATTCGCAGGC FAM-CCCCCCACCCCTTCTCCCACAATGA-BHQ1
runx3	Runt related transcription factor 3	1p36.11	FAM-CCCTCCCAACTGTAGCCGGCCCC-BHQ1 CTGGGGCGATAATTCGGAATGA
sfrp2	Secreted frizzled related protein 2	4q31.3	FAM-CTCCCTTGCTCCCCCCACCCTCC-BHQ1 CCAGCCCTCCTCGGATTACCC
sox17	SRY (sex determining region Y)-Box 17	8q11.23	CGCCCTCCGACCCTCCAA FAM-TCCCGGATTCCCCAGGTGGCC-BHQ1
tcf21	Transcription factor 21	6q23.2	FAM-TGCCCCCCGACACCAAGCTCTCC-BHQ1 CCAGCCTGAGCGTGTCCAGC
tfpi2	Tissue factor pathway inhibitor 2	7q21.3	CCGAGCGGAGGGGCCTCT FAM-AGCGAGTCCCCCCTGCCAGCG-BHQ1
wnt5a	Wnt family member 5A	3p14.3	FAM-CCCTTCCCTGCCCTCCCCACAGC-BHQ1 CAGGTGTGGGGTGGGAGGGA
zfp82	Zinc finger protein 82	19q13.12	FAM-CAGCTGCAGAGAAATGGCCCTCGGTC-BHQ1 CCCCAGCATCCTCTGCCCAC
znf331	Zinc finger protein 331	19q13.42	FAM-CCGCACACTCGCTGGCCCTTTCAC-BHQ1 GCCCGATCCCGACCAGTCAC

^aОбозначение, хромосомная локализация генов и наименования конечных белковых продуктов приведены согласно указаниям Международного комитета по номенклатуре генов – HUGO Gene Nomenclature Committee (http://www.genenames.org).

^bВ последовательности флуоресцентных зондов FAM – 6-карбоксифлуоресцеин, BHQ1 – Black Hole Quencher 1.

 

Гибридные праймеры, соответствующие сайтам R(5mC)GY, метилированным с наибольшей частотой, подбирали экспериментально. Каждый такой праймер имеет нуклеотидную последовательность 5’-CCTGCTCTTTCATCGGYNN-3’, где 15 5’-концевых нуклеотидов соответствуют адаптеру, а четыре 3’-концевых нуклеотида (подчеркнуты) комплементарны геномной последовательности в точке гидролиза ДНК. В регуляторной области каждого гена с применением гибридных праймеров, соответствующих концевым тетрануклеотидам, получаемым после гидролиза последовательности NNR(5mC)↓GYNN, проанализированы все сайты RCGY, расположенные в пределах ~200 п.н. от участка гибридизации флуоресцентного зонда. Наименьшее значение порогового цикла (Cq), получаемое в ПЦР в режиме реального времени, указывало на максимальную степень метилирования сайта R(5mC)GY [12, 13].

Статистический анализ

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программного обеспечения MedCalc 15.11 (MedCalc Software, Бельгия). Исходя из значений Cq образцов ДНК для анализируемых сайтов RCGY получали характеристические кривые (ROC-кривые; Receiver Operating Сharacteristic Curves) с 95% доверительным интервалом. Величина площади под ROC-кривой (ППК) отображает взаимосвязь чувствительности и специфичности диагностического теста. ППК является интегральным показателем диагностической эффективности сайта-онкомаркера (в «идеальном» тесте ППК = 1) [15].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение кандидатных генов-онкомаркеров рака желудка

К настоящему времени показано, что развитие РЖ ассоциировано с эпигенетической инактивацией целого ряда генов. По опубликованным данным мы сформировали исходную панель из 23 генов-онкосупрессоров, сайты RCGY в регуляторных областях которых мы исследовали методом GLAD-ПЦР. Эта панель включает гены brinp1 [16], bves [17], cacna2d3 [18], cdh11 [16], cpeb1 [19], epha7, fgf2, galr1 [16], gata4 [20], hopx [21], hs3st2 [16], irx1 [17], lrrc3b [22], pcdh10 [23], rprm [24], runx3, sfrp2 [17], sox17 [25], tcf21 [26], tfpi2 [27], wnt5a [17], znf331 [28] и znf545 [29].

Выявление сайтов RCGY в ДНК из тканей РЖ, перспективных для GLAD-ПЦР-анализа

На первом этапе использовали случайную выборку из 10 препаратов опухолевой ДНК, выделенных из тканей РЖ, с помощью которой отобрали наиболее часто метилированные сайты RCGY в пределах регуляторных областей генов-онкосупрессоров как описано ранее [12, 13].

В качестве критерия отбора сайтов RCGY, перспективных для проведения GLAD-ПЦР-анализа, использовали значение Cq, которое не должно превышать 30 по меньшей мере у одного из 10 образцов. По результатам предварительного анализа для дальнейшего исследования всей коллекции образцов ДНК опухолевых (n = 29) и морфологически неизмененных тканей (n = 25) больных РЖ отобрали по одному сайту RCGY в составе генов brinp1, bves, cacna2d3, cpeb1, epha7, galr1, irx1, lrrc3b, pcdh10, runx3, sfrp2, tcf21, tfpi2 и znf331 (табл. 2).

 

Таблица 2. Сайты RCGY, выбранные для GLAD-ПЦР-анализа, их локализация в геноме и последовательности соответствующих им гибридных праймеров

Ген	Сайт	Координаты сайтаa	Гибридный праймерb
brinp1	GCGC	сhr9: 119369161-119369164	CCTGCTCTTTCATCGGCGG
bves	GCGC	chr6:105137614-105137617	CCTGCTCTTTCATCGGCGC
cacna2d3	GCGC	chr3:54120898-54120901	CCTGCTCTTTCATCGGCGA
cpeb1	GCGC	chr15: 82648343-82648347	CCTGCTCTTTCATCGGCGG
epha7	GCGC	chr6:93419955-93419958	CCTGCTCTTTCATCGGCGA
galr1	GCGC	chr18:77249828-77249831	CCTGCTCTTTCATCGGCGG
irx1	GCGC	chr5:3596424-35966427	CCTGCTCTTTCATCGGCGG
lrrc3b	GCGC	chr3:26623493-26623500	CCTGCTCTTTCATCGGCGG
pcdh10	GCGT	chr4:133152953-1331152956	CCTGCTCTTTCATCGGCGA
runx3	GCGT	chr1:24931357-24931360	CCTGCTCTTTCATCGGTGG
sfrp2	GCGC	chr4:153789030-15379033	CCTGCTCTTTCATCGGCGC
tcf21	GCGC	chr6:133889653-133889658	CCTGCTCTTTCATCGGCGA
tfpi2	GCGC	chr7:93890478-93890481	CCTGCTCTTTCATCGGCGC
znf331	GCGT	chr19:53521737-53521740	CCTGCTCTTTCATCGGTCT

^a Координаты сайта приведены в соответствии с последней сборкой генома человека GRCh38/hg38.

^b Подчеркнут 3’-концевой тетрануклеотид гибридного праймера, комплементарный последовательности ДНК в точке гидролиза ферментом GlaI.

 

GLAD-ПЦР-анализ сайтов метилирования в препаратах ДНК из клинических образцов

GLAD-ПЦР-анализ выбранных сайтов RCGY выполняли в трех повторах, каждый из которых содержал 3.0 нг ДНК (~10³ копий исследуемого участка гена). Диаграммы на рис. 2 отображают средние значения Cq для исследованных сайтов.

 

Рис. 2. Результаты GLAD-ПЦР-анализа выбранных R(5mC)GY-сайтов в препаратах ДНК из образцов тканей больных РЖ. По оси ординат приведены значения Cq с диапазонами стандартных отклонений, по оси абсцисс – номера исследованных образцов тканей (о – опухоль, н – неизмененная ткань на линии резекции)

 

Результаты анализа сайтов R(5mC)GY в генах bves, cacna2d3, cpeb1, epha7, galr и tfpi2 показывают, что значения Cq (23–27) для большинства образцов опухолевой ДНК в среднем на три и более цикла ниже значений Cq для соответствующих образцов ДНК из здоровых тканей. В то же время у маркеров brinp1, lrrc3b, runx3, tcf21 и znf331 это различие в значении Cq для основной части образцов ДНК невелико (менее 1.5 цикла), что затрудняет их использование для выявления опухолевой ткани из-за возможного перекрывания диапазона стандартных отклонений.

На рис. 3 показаны ROC-кривые, полученные при статистической обработке данных GLAD-ПЦР 14 сайтов RCGY, а в табл. 3 представлены значения рассчитанных параметров. В столбцах 2 и 3 указано количество положительных результатов для опухолевых тканей по каждому гену и соответственно чувствительность определения по данному сайту. В столбцах 4 и 5 приведено число отрицательных результатов при проведении GLAD-ПЦР-анализа образцов ДНК из морфологически неизмененных тканей и соответственно специфичность выявления опухолевой ДНК. В столбце 6 указана величина площади под ROC-кривой (ППК), выраженная в виде доли от всей площади квадрата с указанием стандартной ошибки измерения, а в столбце 7 представлены значения 95% доверительного интервала определения данного параметра.

 

Таблица 3. Результаты ROC-анализа данных, полученных методом GLAD-ПЦР образцов ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей больных РЖ (в порядке уменьшения значений ППК)

Ген	Образцы РЖ, определенные как положительные / общее число образцов РЖ	Чувствительность, %	Образцы морфологически неизмененных тканей, определенных как отрицательные / общее число образцов морфологически неизмененных тканей	Специфичность, %	ППК (стандартная ошибка)	95% доверительный интервал
irx1	27/29	93.1	22/25	88.0	0.934 (0.038)	0.833–0.984
cpeb1	25/29	86.2	24/25	96.0	0.911 (0.047)	0.802–0.971
galr1	24/29	82.7	24/25	96.0	0.866 (0.054)	0.745–0.943
tfpi2	23/29	79.3	22/25	88.0	0.846 (0.059)	0.721–0.929
cacna2d3	21/29	72.4	23/25	92.0	0.834 (0.054)	0.708–0.921
epha7	22/29	75.7	24/25	96.0	0.832 (0.066)	0.706–0.920
pcdh10	22/29	75.9	24/25	96.0	0.830 (0.061)	0.703–0.918
sfrp2	21/29	72.4	24/25	96.0	0.795 (0.064)	0.663–0.893
tcf21	15/29	51.7	25/25	100.0	0.790 (0.063)	0.657–0.889
lrrc3b	21/29	72.4	22/25	88.0	0.762 (0.070)	0.627–0.867
znf331	14/29	48.3	24/25	96.00	0.698 (0.075)	0.558–0.815
runx3	14/29	48.3	21/25	84.0	0.673 (0.074)	0.532–0.795
bves	18/29	62.1	22/25	88.0	0.627 (0.082)	0.485–0.755
brinp1	3/29	10.3	25/25	100.0	0.514 (0.081)	0.374–0.652
Комбинация генов irx1, cacna2d3 и epha7	28/29	96.6	25/25	100.0	0.985 (0.016)	0.907–1.000

 

Рис. 3. ROC-кривые, полученные при статистическом анализе данных GLAD-ПЦР-анализа сайтов R(5mC)GY в препаратах ДНК из опухолевых и неизмененных тканей больных РЖ. По оси ординат указана чувствительность в %, по оси абсцисс приведено значение [100 – специфичность (%)]

 

Статистический анализ результатов GLAD-ПЦР (рис. 3 и табл. 3) показывает, что большинство проверенных маркеров характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, и позволяет дифференцировать образцы ДНК из опухолевых и нормальных тканей РЖ. Полученные значения ППК (за исключением генов znf331, runx3, bves и brinp1) больше 0.7, что, согласно общепринятым критериям оценки данных ROC, свидетельствует о возможности их использования в качестве диагностических моделей [15].

Наиболее высоким диагностическим потенциалом обладают сайты RCGY в составе генов-онкосупрессоров irx1 и cpeb1: значения ППК для них превышают 0.91.

С применением метода логистической регрессии (алгоритм последовательного включения / исключения) проведена оценка общих диагностических характеристик всех исследованных сайтов RCGY, что позволило отобрать оптимальную комбинацию маркеров, дающую максимальную площадь под ROC-кривой и позволяющую различать образцы ДНК из опухолевых и нормальных тканей с наибольшей эффективностью. Как видно из табл. 3, анализ комбинации маркеров irx1, cacna2d3 и epha7 позволяет проводить такую дифференциацию со 100% специфичностью и чувствительностью 96.6%.

Таким образом, с помощью GLAD-ПЦР-анализа препаратов ДНК из клинических образцов опухолевых и нормальных тканей больных РЖ сформирована диагностическая панель сайтов RCGY, позволяющая выявлять опухолевые ткани.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известны четыре молекулярных подтипа РЖ, которые различаются профилем метилирования ДНК [17]. В них входят: а) ВЭБ-позитивный, ассоциированный с вирусом Эпштейна–Барр; б) MSI (mlh1 silencing), характеризующийся функциональной инактивацией локуса mlh1; в) вариант со стабильными микросателлитными повторами; г) подтип с большим числом мутаций в микросателлитных повторах. Однако в подавляющем большинстве случаев (> 90%) гистологическим типом РЖ является аденокарцинома.

В настоящее время выявлено значительное количество генов с различными биологическими функциями, районы промотора или первого экзона в которых метилируются при РЖ [30]. При этом метилирование регуляторных областей генов bves, irx1, runx3, cacna2d3, lrrc3b и sfrp2, представленных в табл. 3, ассоциировано по меньшей мере с тремя подтипами РЖ [17]. При исследовании метилирования ДНК на уровне генома используется метод бисульфитной конверсии с последующим секвенированием на NGS-платформе. J.L. Sepulveda и соавт. применили этот подход к исследованию препаратов ДНК из нормальной слизистой и опухолевой ткани и показали существенное увеличение метилирования CpG-динуклеотидов в генах brinp1, epha7 и galr1 при РЖ [16].

Выводы, сделанные в перечисленных исследованиях, основывались на сравнении медианных значений степени метилирования в выборках образцов тканей без определения частотных показателей метилирования или экспрессии генов для групп «норма» и «опухоль». Такие показатели описаны для остальных пяти генов, представленных в табл. 3.

Выключение гена cpeb1 при метилировании промотора наблюдали во всех девяти изученных клеточных линиях РЖ и в 91% первичных опухолей [19]. Похожие результаты получены для гена pcdh10, метилирование которого находят в 82% случаев опухолей желудка и в 94% линий опухолевых клеток желудка [23]. Также более чем в 80% образцов опухолей желудка выявлено метилирование промотора гена tfpi2 [27]. В 71% клеточных линий РЖ установлено выключение гена znf331. Этот эффект наблюдали и в значительном количестве образцов ДНК из опухолевых тканей, тогда как в морфологически неизмененных тканях, включая ткань желудка, этот ген не был метилирован [28]. Метилирование промоторной области гена tcf21 наблюдали только в 65% случаев [26]. Результаты, представленные в табл. 3, хорошо коррелируют с ранее полученными количественными данными по метилированию генов в опухолях РЖ [19, 23, 26–28].

Список генов с аберрантно метилированными сайтами в опухолях РЖ (табл. 3) существенно отличается от списка генов при колоректальном раке, полученного нами ранее [13]. Исключением является ген sfrp2, метилирование регуляторной области которого в опухолевой ДНК наблюдается в обоих случаях с практически одинаковой частотой (72% при колоректальном раке).

Возможности GLAD-ПЦР-анализа для диагностики рака желудка

Результаты, полученные в настоящей работе, соответствуют ранее опубликованным данным и показывают, что GLAD-ПЦР позволяет выявлять аберрантно метилированные сайты R(5mC)GY в регуляторных областях генов-онкосупрессоров в образцах ДНК, выделенных из тканей РЖ. При этом степень метилирования сайта связана отрицательной корреляционной зависимостью со значением Cq в ПЦР в режиме реального времени.

Наиболее оптимальным комплексным маркером РЖ оказалась комбинация сайтов RCGY в регуляторных областях генов irx1, cacna2d3 и epha7. Применение данной панели генов делает специфичность дифференциации опухолевых и морфологически неизмененных тканей равной 100%, а чувствительность анализа при этом повышается до 96.6% (табл. 3).

В настоящее время наиболее перспективным и активно разрабатываемым методом онкодиагностики является так называемая «жидкая биопсия», основанная на анализе свободно циркулирующей ДНК в крови. Один из основных источников такой ДНК при онкологических заболеваниях – опухолевые клетки, разрушающиеся в результате апоптоза и некроза [31]. В дальнейшем планируется провести тестирование подобранной панели эпигенетических маркеров на образцах ДНК из крови больных РЖ с целью разработки чувствительного метода лабораторной диагностики данной онкопатологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом GLAD-ПЦР определены сайты R(5mC)GY, возникающие при аберрантном метилировании регуляторных областей генов-онкосупрессоров в образцах ДНК из тканей РЖ. Предложена панель сайтов в генах irx1, cacna2d3 и epha7, являющихся эпигенетическими маркерами РЖ, показана высокая диагностическая эффективность этой панели при дифференциации ДНК из морфологически неизмененных и опухолевых тканей. Суммарные показатели чувствительности и специфичности панели составляют 96.6% и 100% соответственно. Мы полагаем, что выбранные сайты RCGY могут использоваться также для разработки систем диагностики РЖ методом GLAD-ПЦР образцов ДНК, выделенных из крови пациентов.

Работа проведена при финансовой поддержке гранта фонда Сколково № Г102/16 от 06 декабря 2016 г.

Об авторах

Борис Сотиволдиевич Малышев

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: malyshevb@vector.nsc.ru
Россия, Новосибирская обл., р.п. Кольцово, 630559

Нина Александровна Нетесова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: ninanet@vector.nsc.ru
Россия, Новосибирская обл., р.п. Кольцово, 630559

Наталья Анатольевна Сметанникова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: smetannikova@vector.nsc.ru
Россия, Новосибирская обл., р.п. Кольцово, 630559

Мурат Абдурашитович Абдурашитов

ООО «ЭпиДжин»

Email: abd@sibenzyme.ru
Россия, Новосибирск, 630090

Александр Григорьевич Акишев

ООО «ЭпиДжин»

Email: aki@sibenzyme.ru
Россия, Новосибирск, 630090

Евгений Викторович Дубинин

2ООО «ЭпиДжин»

Автор, ответственный за переписку.
Email: evgeny.dubinin@epigene.ru
ORCID iD: 0000-0003-3384-8406

зам.директора по развитию, к.э.н.

Россия, Новосибирск, 630090

Артур Закирчанович Азанов

Областной клинический онкологический диспансер

Email: 05-guz-okod@kuzdrav.ru
Россия, Кемерово, 650036

Игорь Владиславович Вихлянов

Алтайский краевой онкологический диспансер

Email: akod@akod22.ru
Россия, Алтайский край, Барнаул, 656049

Максим Константинович Никитин

Алтайский краевой онкологический диспансер

Email: privet_com@mail.ru
Россия, Алтайский край, Барнаул, 656049

Андрей Борисович Карпов

Северский биофизический научный центр ФМБА России

Email: andrey.karpov@remhc.org
Россия, Томская обл., Северск, 636039

Сергей Харитонович Дегтярев

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора; ООО «ЭпиДжин»

Email: degt@sibenzyme.com
ORCID iD: 0000-0003-1920-8023
Scopus Author ID: 7006512820

Доктор биологических наук, Профессор

Россия, Новосибирская обл., р.п. Кольцово, 630559; Новосибирск, 630090

Список литературы

Дополнительные файлы