Белки семейства Snail: роль в канцерогенезе и перспективы противоопухолевой терапии

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

В процессе метастазирования опухолевые клетки приобретают локомоторный фенотип и появляются в сосудистом русле [1, 2]. Процесс, в результате которого высокодифференцированные поляризованные эпителиальные клетки приобретают локомоторный фенотип мезенхимальных клеток, называется эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП) [3]. В регуляции этого процесса ключевую роль играют белки семейства Snail – транскрипционные факторы, контролирующие экспрессию генов, продукты которых реализуют фенотип/фенотипы ЭМП и, в итоге, прогрессию новообразований [4]. За последние 15 лет созданы противоопухолевые средства нового поколения. Терапия опухолей становится мишень-направленной и ориентированной на отдельные механизмы регуляции жизнедеятельности опухолевых клеток. В практику вошли ингибиторы протеинкиназ, модуляторы баланса «выживание–гибель», ингибиторы протеасом и др. – эти средства позволяют получить значимые терапевтические эффекты в отдельных группах больных [5–8]. Наряду с «классическими» схемами химиотерапии испытываются персонализированные подходы, учитывающие биологические характеристики конкретного новообразования. Такие подходы особенно важны при разработке оптимальных схем терапии больных с метастатическими опухолями.

Несмотря на прогресс в понимании механизмов метастазирования, эффективные антиметастатические препараты по-прежнему отсутствуют, поэтому актуальным остается изучение молекул, снижающих метастатический потенциал опухоли.

В обзоре обсуждаются сигнальные пути белков семейства Snail, их роль в поддержании агрессивного поведения опухолевой клетки, а также перспективы фармакологического воздействия на ЭМП для решения клинических вопросов.

МЕТАСТАЗИРОВАНИЕ И ЭМП

За время, прошедшее после первого описания феномена ЭМП [3], были выяснены его основные механизмы. К основным критериям ЭМП относятся изменение экспрессии генов-маркеров эпителиальных и мезенхимальных клеток, а также морфологии клеток и увеличение их миграционной способности. Цитокины, факторы роста, молекулы внеклеточного матрикса (ВКМ) активируют сигнальные пути, запускающие программу ЭМП. Эти пути реализуются посредством ряда транскрипционных факторов (Slug, Snail, ZEB1/2, Twist1/2 и др.), связывающихся с регуляторными областями генов-мишеней. Регуляция ЭМП продуктами этих генов приводит к ингибированию эпителиальных маркеров (Е-кадгерин, клаудины, окклюдин и др.) и активации мезенхимальных (виментин, фибронектин, N-кадгерин и др.). Мезенхимальные клетки обладают повышенной подвижностью, инвазивностью, устойчивостью к апоптозу, в них увеличена продукция компонентов ВКМ [9, 10].

После приобретения мезенхимального фенотипа опухолевые клетки могут мигрировать из эпителиального пласта по кровеносному руслу, а достигая метастатической ниши путем мезенхимально-эпителиального перехода (МЭП), возвращаются к исходному фенотипу, что ведет к образованию метастазов. Изучены некоторые механизмы, регулирующие МЭП, включая динамическую регуляцию факторов, индуцирующих ЭМП во время метастатического каскада. Постепенное снижение экспрессии Snail в опухолевых клетках в процессе колонизации, обусловленное ингибированием с помощью микроРНК, приводит к индукции МЭП. В частности, miR-34 и miR-200 подавляют транскрипционные факторы Snail и ZEB1/2 [11–13]. Однако не до конца ясно, является ли МЭП активно регулируемым процессом, запускаемым определенными сигнальными молекулами, или же происходит пассивно при отсутствии факторов, стимулирующих и поддерживающих ЭМП в метастатическом очаге, по сравнению с первичной опухолью.

ЭМП встречается при многих процессах в эмбриональном (формирование мезодермы, миграция клеток нервного гребня, определение лево-правой асимметрии, а также образование париетальной энтодермы) и постнатальном развитии [14, 15]. В патологических условиях ЭМП сопровождает злокачественную трансформацию и прогрессию опухолей, а также развитие фиброза. Белки Snail и Slug исследованы в качестве регуляторов ЭМП при прогрессии опухолей, где они участвуют в регуляции выживания и пролиферации клеток, инвазии и формировании метастазов [16–18], а также регулируют энергетический метаболизм и поддерживают резистентность к терапии [19].

Новая классификация ЭМП включает четыре стадии: эпителиальную, раннюю гибридную, позднюю гибридную и мезенхимальную. Показано, что активность Snail возрастает, начиная с ранней гибридной стадии, тогда как изменения формы клеток от округлой к вытянутой наступают только на поздней гибридной стадии. Эти изменения сопровождаются постепенной утратой межклеточной адгезии [20].

СТРУКТУРА БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА Snail

Белки семейства Snail – Snail/SNAI1 и Slug/SNAI2 – являются репрессорами транскрипции [21]. Эти белки имеют высококонсервативную С-концевую область, включающую четыре (Snail) и пять (Slug) «цинковых пальцев», которая участвует в связывании белков с промоторами генов-мишеней, содержащими последовательность Е-box. N-Концевые участки содержат эволюционно консервативный домен SNAG, необходимый для репрессии транскрипции; к нему могут присоединяться метилтрансферазы и деацетилазы гистонов [4]. Несмотря на сходство N- и C-концевых областей Snail и Slug, центральные обогащенные пролином области, опосредующие убиквитинирование и протеолитическую деградацию этих белков, различаются. Snail содержит область для деградации белка (DB) и последовательность (сигнал) ядерного экспорта NES, а Slug несет специфическую последовательность SLUG. Домены SNAG и SLUG белка Slug необходимы для репрессии промотора гена Е-кадгерина. Домен SLUG взаимодействует с корепрессором CtBP1, а домен SNAG с корепрессором NCoR [22]. Интересно, что домен SNAG необходим для индукции ЭМП, в то время как домен SLUG, возможно, осуществляет негативную регуляцию Slug-опосредованного ЭМП [23] (рис. 1).

Функциональная активность белков определяется их структурой, конфигурацией и посттрансляционными модификациями [24].

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА Snail

Snail – лабильный белок, время полужизни которого не превышает 4 ч [25]. Как и многие белки, Snail подвергается различным посттрансляционным модификациям, влияющим на его стабильность, внутриклеточную локализацию и транскрипционную активность. Выявлены два сайта фосфорилирования Snail – один определяет его протеолиз в протеасоме, другой – внутриклеточную локализацию. Протеинкиназа GSK-3β (киназа гликогенсинтазы-3β) связывается со Snail и фосфорилирует его, что приводит к экспорту белка из ядра в цитоплазму. Последующее фосфорилирование посредством GSK-3β уже в цитоплазме обеспечивает связывание Snail с E3-убиквитинлигазой β-TrCP и деградацию Snail в протеасоме [26]. С убиквитинлигазой FBXL14 могут связываться как фосфорилированные, так и нефосфорилированные формы Snail, что также приводит к его протеасомной деградации. Показано, что деубиквитиназа DUB3 способна «уберегать» Snail от деградации в протеасоме, тем самым стабилизируя его [27]. Для стабилизации Snail в ядре также необходима протеинкиназа PAK1, обеспечивающая его фосфорилирование по остатку серина в положении 246. В свою очередь, протеинкиназа А (PKA) фосфорилирует Snail по остаткам серина в положениях 11 и 92, усиливая его трансактивацию [28].

Рис. 1. Структура белков Snail и Slug

Стабильность транскрипционного фактора Slug регулируется схожим образом и зависит от фосфорилирования протеинкиназой GSK-3β. Идентифицированы сайты фосфорилирования Slug (Ser-4 и 88). Для индукции ЭМП посредством Slug необходимо фосфорилирование серина-4 [23].

Кроме фосфорилирования протеинкиназами, в стабилизации Snail/Slug участвуют ацетилтрансферазы гистонов (HAT), которые обеспечивают их ядерную локализацию и взаимодействие с коактиваторами [29]. Е3-убиквитинлигаза А20 моноубиквитинирует Snail по трем остаткам лизина, что снижает его аффинность к GSK-3β и поддерживает ядерную локализацию, облегчая ЭМП клеток рака молочной железы (РМЖ), индуцированный трансформирующим фактором роста β (TGF-β1). Нокдаун А20 или повышенная экспрессия Snail c заменой моноубиквитинированных остатков лизина на аргинин предотвращает развитие метастазов в моделях РМЖ [30].

МИШЕНИ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ СЕМЕЙСТВА Snail

Между белками Slug и Snail, несмотря на значительную (~ 70%) гомологию их аминокислотных последовательностей, имеются важные функциональные различия. Например, активность Snail необходима в раннем эмбриогенезе, так как эмбрионы мышей с нокаутом гена snai1 погибают на стадии гаструляции: у них нарушается образование слоя мезодермы, в котором клетки сохраняют эпителиальные признаки – полярность, плотные межклеточные контакты и экспрессию E-кадгерина [31]. Мыши с нокаутом snai2 жизнеспособны, но у них нарушено образование клеток нервного гребня и формирование мезодермы [32]. Как Snail, так и Slug, необходимы для формирования костной ткани, хондрогенеза [33] и сомитогенеза [34].

Snail и Slug необходимы для регенерации тканей взрослого организма, в частности, для заживления ран [15]. Ключевую роль здесь играет именно Slug, который находится под контролем фактора роста эпидермиса (EGF), секретируемого при заживлении [35]. У мышей с нокаутом snai2 отсутствует миграция кератиноцитов в рану при сохранении маркеров пролиферации K6 и Ki-67 и высоких уровнях E-кадгерина и К8 [36].

На модели колоректального рака человека с помощью ChIPseq показано, что транскрипционный фактор Snail в основном связывается с областями, расположенными выше сайта старта транскрипции (в пределах 1 т.п.н.), а также в межгенных участках и интронах, дистальных по отношению к промотору. Таким образом, Snail контролирует транскрипцию в большей степени, связываясь с отдаленными регуляторными элементами ДНК [37]. Оказалось, что Snail преимущественно связывается с генами, ответственными за дифференцировку, морфогенез, органогенез, передачу сигнала и клеточные контакты, что хорошо согласуется с его известными биологическими функциями [37]. В клетках трижды негативного РМЖ идентифицированы два дополнительных сайта связывания Snail: мотивы TAL / GATA1 и TGG RREB1 / RUNX2 / PAX4, что обеспечивает более специфичное узнавание генов-мишеней по сравнению с другими факторами транскрипции [38].

Рис. 2. Snail-опосредованная репрессия Е-кадгерина. 1 – образование репрессорного комплекса (Snail, деацетилаза, Sin3A); 2 – деацетилирование гистонов Н3 и Н4; 3 – присоединение ингибирующего комплекса PRC2 и метилтрансферазы G9a; 4 – гиперметилирование ДНК. Адаптировано из [42]

Snail и Slug могут действовать и как транскрипционные репрессоры и служить активаторами транскрипции генов, кодирующих мезенхимальные белки – N-кадгерин, виментин, фибронектин и др. [39, 40]. Snail может также индуцировать транскрипцию путем взаимодействия с транскрипционными факторами EGR1 и SP1 [41].

Snail-опосредованный механизм репрессии экспрессии генов детально изучен на примере Е-кадгерина – маркера эпителиальных клеток (рис. 2).

Домен SNAG белка Snail взаимодействует с гистондеацетилазами HDAC1 и 2, а также с белком Sin3A. Образовавшийся комплекс связывается с областью Е-box в промоторе гена Е-кадгерина – CDH1, что приводит к деацетилированию гистонов Н3 и Н4. Эта модификация облегчает присоединение ингибиторного комплекса PRC2 и гистон-метилтрансферазы G9a: второй акт ингибирования экспрессии Е-кадгерина происходит путем гиперметилирования ДНК. После первоначального подавления Е-кадгерина Snail индуцирует экспрессию транскрипционного фактора ZEB1, что приводит к дальнейшему торможению экспрессии Е-кадгерина, но уже посредством PRC2-независимого механизма, детали которого пока неизвестны [42].

Snail/Slug-зависимая транскрипция приводит не только к репрессии E-кадгерина, но и к разборке десмосом и плотных межклеточных контактов вследствие репрессии генов окклюдина, клаудинов типа 3, 4, 7 и десмоплакинов [43, 44]. Snail и Slug также увеличивают синтез матриксных металлопротеиназ (ММП), способствуя тем самым деградации компонентов ВКМ [45, 46].

Изменение подвижности клеток при ЭМП и образование локомоторного фенотипа связаны с активностью белков Rho-семейства – малых GTP-аз Rac1, RhoA, RhoV и Cdc42, контролирующих динамику актина [47]. Rac1 регулирует TGF-β-зависимую активацию Snail: нокдаун Rac1 приводит к снижению активности Snail и MMP9 [48]. Напротив, ингибирование RhoA увеличивает уровень Snail [49]. RhoV вместе со Snail индуцируют Slug при ЭМП в ходе эмбрионального развития [50]. Увеличение подвижности клеток рака поджелудочной железы с повышенным уровнем Snail зависит от Rac1 [45], а повышение уровня Slug приводит к подавлению ROCK1/2 [46]. Подавление Snail значительно снижает подвижность клеток за счет меньшей активности Cdc42 и одновременного увеличения активности RhoA [51]. Таким образом, оба белка – Snail и Slug – контролируются малыми GTP-азами, отвечающими за подвижность клеток, и сами способны регулировать их активность, позволяя координировать изменения фенотипов клеток в эмбриогенезе и при прогрессии опухолей.

Snail играет важную роль в клеточном цикле и выживании клеток. Во время эмбрионального развития Snail репрессирует транскрипцию гена циклина D2 и увеличивает экспрессию гена p21^Cip1/WAF1 для регуляции перехода от ранней фазы G1 к поздней. Повышение экспрессии циклинзависимых киназ CDK4/6 способствует стабилизации Snail через опосредованное DUB3 деубиквитинирование [27]. В клетках эпителия почки (линия MDCK), стабильно экспрессирующих экзогенный Snail, около 90% клеток находились в фазе G0/G1 после 72 ч культивирования. Сверхэкспрессия Snail приводит к снижению CDK4 и фосфорилирования Rb, а также к увеличению уровня p21^Cip1/WAF1 [52]. Таким образом, с помощью Snail можно вызвать задержку или остановку продвижения клеток по клеточному циклу.

Slug также участвует в регуляции смены фаз клеточного цикла. Показано, что Slug действует в функциональной кооперации с циклином D1. Нокдаун Slug в линии клеток трижды негативного РМЖ MDA-MB-231 снижает скорость пролиферации клеток, вероятно, за счет снижения уровня циклина D1 [53]. Согласно другому исследованию, индуцированная экспрессия Slug может привести к ингибированию циклина D1 и остановке клеток рака предстательной железы в фазе G0/G1. Таким образом, в клетках разного тканевого происхождения Slug играет разную роль [54].

Snail регулирует выживание клеток при снижении концентрации сыворотки в культуральной среде, активируя сигнальные пути MAPK (Mek/Erk) и PI3K. Snail и Slug подавляют экспрессию ряда проапоптотических факторов на уровне транскрипции, таких, как: p53, BID, каспаза 6, PUMA/BBC3, ATM, DFF40 (фактор фрагментации ДНК), PTEN (фосфатаза в каскаде PI3K) [52, 55–57]. Интересно, что с опухолевым супрессором р53 белок Snail может взаимодействовать напрямую, блокируя его ДНК-связывающий домен [58].

Интересно отметить, что транскрипционные мишени Snail и Slug схожи, но сведений о взаимной регуляции этих белков недостаточно. По нашим данным, экспрессия Snail и Slug взаимозависима. Так, при сверхэкспрессии Snail в клетках линии MDA-MB-231 наблюдается резкое снижение уровня белка Slug, а при ингибировании Snail малыми интерферирующими РНК уровень Slug повышается. Возможно, Snail и Slug компенсируют друг друга в определенных условиях [59].

Активировать транскрипционные факторы семейства Snail могут различные экзогенные стимулы. Ниже приведены результаты анализа основных сигнальных путей, регулирующих Snail и Slug.

РЕГУЛЯЦИЯ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА Snail ПРИ ЭМП

ЭМП – это динамичный процесс, который может инициироваться, например, белками ВКМ и секретируемыми растворимыми факторами роста: эпидермиса (EGF), гепатоцитов (HGF), фибробластов (FGF), морфогенетическими белками костной ткани (BMP), TGF-β, Wnt, Notch, фактором некроза опухоли α (TNF-α), цитокинами [60, 61]. Многие из этих сигнальных молекул микроокружения опухолевых клеток индуцируют экспрессию белков семейства Snail (рис. 3).

Сигнальные каскады, инициируемые активацией рецепторных тирозинкиназ (RTK) и факторами роста, приводят к увеличению уровня Snail, а также его стабилизации и транслокации в ядро. Сигнальные каскады MAPK или PI3K участвуют в регуляции ЭМП в кооперации с TGF-β [62]. Репрессия MAPK в некоторых моделях опухолей достаточна для снижения экспрессии Snail и Slug и ингибирования ЭМП [63–65].

Многофункциональный белок TGF-β регулирует пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. На ранних стадиях канцерогенеза TGF-β выступает как супрессор опухолевого роста, а на более поздних способствует формированию злокачественного фенотипа [66]. Snail играет важную роль в регуляции ответа клеток на TGF-β, обеспечивая их устойчивость к TGF-β-опосредованному апоптозу и прогрессию опухоли. На поздних стадиях TGF-β индуцирует ЭМП, действуя SMAD-зависимым способом через Snail. Белки SMAD взаимодействуют с промотором гена SNAI1 и индуцируют экспрессию Snail, что приводит к репрессии E-кадгерина и инвазивному фенотипу [4]. Показано, что при TGF-β-индуцированном ЭМП Snail образует комплекс со SMAD3/4. Этот комплекс связывается с областями E-box и SMAD-связывающими элементами в промоторах генов, кодирующих белки межклеточных контактов, и репрессирует эти гены [67].

Активация сигнального пути Notch индуцирует ЭМП, опосредованный Snail/Slug, что способствует инвазии и метастазированию клеток РМЖ [68]. Notch контролирует экспрессию Snail с помощью двух синергичных механизмов: прямой активации транскрипции и непрямого воздействия через лизилоксидазу (LOX), стабилизирующую Snail. Notch рекрутирует индуцируемый гипоксией фактор 1α (HIF-1α) на промотор LOX, активируя этот ген [67]. Кроме того, Notch, активируемый лигандом Jagged1, стимулирует репрессор Slug и подавляет E-кадгерин, что приводит к так называемому гибридному (промежуточному) фенотипу ЭМП. Для этого фенотипа характерны частичное увеличение экспрессии мезенхимальных маркеров и снижение экспрессии эпителиальных маркеров. При этом отсутствуют значительные морфологические изменения клеток и нет полной потери межклеточных контактов [69].

Регулировать экспрессию гена SNAI1 также может ядерный фактор NF-κB/p65. NF-κB, после его активации цитокином TNF-α, связывается с промотором SNAI1; активация транскрипции этого гена индуцирует ЭМП [25]. Экспрессия SNAI1 может увеличиваться и через сигнальный путь Akt: протеинкиназа Akt1 фосфорилирует IKKα, что приводит к протеолитической деградации ингибиторной субъединицы IκB, высвобождению димеров NF-κB, их транслокации в ядро и трансактивации SNAI1 [70]. Показано, что одновременное подавление Snail и NF-κB повышает чувствительность клеток РМЖ к антиэстрогенам [71]. Одновременное воздействие на эти два фактора транскрипции может представлять интерес для разработки подходов к противоопухолевой терапии.

Рис. 3. Механизмы Snail-индуцированного ЭМП

При активации сигнального пути Wnt наблюдается ингибирование фосфорилирования β-катенина и Snail посредством GSK-3β, что приводит к накоплению β-катенина и Snail в ядре. β-катенин, действующий как фактор транскрипции во взаимодействии с TCF/LEF, необходим для индукции ЭМП в эпителиоцитах. Синергический эффект Snail и β-катенина позволяет опухолевым клеткам выживать при инвазии и метастазировании [72].

Свою роль в ЭМП играет также белок MDM2. Повышенная экспрессия MDM2 в линии клеток MCF7 РМЖ приводит к изменению их морфологии с эпителиальной на мезенхимальную. Нокдаун MDM2 в клетках MDA-MB-231, напротив, изменяет морфологию клеток с мезенхимальной на эпителиальную (МЭП). Кроме того, повышенная экспрессия MDM2 увеличивает экспрессию N-кадгерина и виментина, а также снижает экспрессию E-кадгерина на уровне мРНК и белка. Понижение экспрессии MDM2 уменьшает экспрессию N-кадгерина и виментина и увеличивает экспрессию E-кадгерина. MDM2 увеличивает уровень как мРНК, так и белка Snail путем активации сигнального пути TGF-β–SMAD. Показано, что нокдаун SNAI1 в клетках, вступивших в индуцированный MDM2 ЭМП, приводит к возвращению этих клеток к исходному эпителиальному фенотипу. Таким образом, MDM2, как и Snail, можно рассматривать в качестве терапевтической мишени при метастатическом РМЖ [73].

Важно, что ключевые транскрипционные факторы, опосредующие ЭМП, могут влиять на экспрессию друг друга. Нами показано, что нокдаун генов TWIST1 и ZEB1 малыми интерферирующими РНК приводит к снижению уровня белка Slug, однако обратный эффект при этом не наблюдался [59].

ГИПОКСИЯ И ЭМП

Одним из факторов регуляции ЭМП является гипоксия. Увеличение массы опухоли по мере ее роста приводит к дефициту кислорода и питательных веществ в ней. Этот «голод», с одной стороны, тормозит пролиферацию клеток, с другой – индуцирует в них «адаптационные» процессы, в частности, ЭМП, который позволяет опухолевым клеткам мигрировать к кровеносным сосудам. В адаптации клеток к гипоксии участвуют такие индуцируемые гипоксией белки, как транскрипционный фактор HIF-1 – гетеродимер, состоящий из субъединиц HIF-1α и HIF-1β [74, 75]. В условиях нормоксии HIF-1α гидроксилируется пролилгидроксилазой, что обусловливает его связывание с белком Хиппеля–Линдау (VHL) – маркером убиквитинирования. Взаимодействие VHL с HIF-1α приводит к деградации HIF-1α в протеасоме. При недостатке кислорода активность пролилгидроксилазы снижается, и HIF-1α не подвергается быстрой деградации, поскольку отсутствие гидроксилированных остатков пролина стабилизирует HIF-1α [76]. HIF-1α накапливается в клетке и димеризуется с HIF-1β, образуя активный транскрипционный фактор, который транслоцируется в ядро, связывается там с участками HRE (hypoxia responsive element) на ДНК и активирует транскрипцию генов-мишеней.

Регуляция ЭМП при гипоксии обеспечивается, главным образом, факторами HIF-1 и Snail/Slug. Индукция ЭМП в условиях гипоксии показана на различных линиях опухолевых клеток [77, 78]. Гипоксия снижает экспрессию Е-кадгерина, действуя через HIF-1α-опосредованную экспрессию SNAI1. Кроме того, HIF-1α индуцирует экспрессию LOX, что приводит к стабилизации Snail [79].

В ответ на гипоксию в опухолевых клетках повышается уровень белка LOX, а подавление экспрессии/активности LOX предотвращает развитие метастазов. Высокий уровень LOX считается фактором клинически неблагоприятного прогноза, ассоциированным с метастазированием РМЖ и опухолей головы и шеи [80].

Yang и соавт. показано, что HIF-1α регулирует активацию ЭМП, повышая уровень Snail в стволовых клетках рака желудка. Экспрессия HIF-1α в этих клетках значительно возрастает в условиях гипоксии. C увеличением HIF-1α повышается экспрессия Snail, виментина и N-кадгерина, а также снижается уровень Е-кадгерина, что указывает на инициацию ЭМП. При гипоксии значительно увеличивается возможность миграции и инвазии стволовых клеток рака желудка [81].

Мы изучали взаимосвязь β-катенин- и Snail-зависимых путей в клетках РМЖ при гипоксии. И обнаружили Snail-зависимую активацию β-катенина. Активированный β-катенин регулирует экспрессию генов ответа на гипоксию и поддерживает устойчивость клеток РМЖ к пониженному парциальному давлению кислорода. Координированная активация системы белков Snail/β-катенин/HIF-1α может рассматриваться как важный фактор, определяющий устойчивость опухоли к гипоксии [82].

Нами показано, что клеточная линия HBL-100 РМЖ с нокдауном Snail более чувствительна к гипоксии, при которой наблюдается блок репликации и уменьшение доли митотических клеток. Кроме того, на чувствительность клеток РМЖ к гипоксии прямо влияет плотность культуры [83].

Таким образом, в результате ответа на гипоксию клетки приобретают мезенхимальный фенотип через ЭМП, индуцированный HIF-1,2α и Snail/Slug. Эти фенотипические изменения могут регулироваться различными эпигенетическими факторами [76].

На рис. 4 показана регуляция многочисленных процессов, опосредованных Snail.

ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА Snail В ОПУХОЛЯХ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МАРКЕР

Snail и Slug аберрантно экспрессируются во многих опухолях, а также в опухоль-ассоциированных фибробластах и в макрофагах, заселяющих поврежденные ткани [84–86]. Многочисленные исследования показывают, что в прогрессии опухоли эти белки играют разную роль.

Экспрессия как SNAI1, так и SNAI2 в опухолевых клетках может характеризовать степень злокачественности и служить прогностическим маркером заболевания. Распространение открытых баз с результатами секвенирования позволяет использовать различные биоинформатические инструменты для предварительной оценки прогноза заболевания. Подобный анализ проводят на начальном этапе поиска и валидации новых маркеров, а также клинически значимых критериев. Одна из таких баз – KM-plotter – содержит профили экспрессии генов из баз GEO, EGA и TCGA [87]. В KM-plotter можно оценить влияние экспрессии генов на общую выживаемость больных методом Каплана–Мейера [88]. Всего доступен анализ 54000 генов в новообразованиях 21 типа. Совокупные данные по экспрессии SNAI1 и SNAI2 в опухолях каждого типа представлены в таблице. В анализ включены данные по экспрессии этих генов в 19 типах новообразований, и для четырех из них не найдено статистически значимых отличий (хотя бы по одному из показателей) в общей выживаемости. Показано статистически значимое влияние экспрессии SNAI1 на медиану общей выживаемости при 12 типах новообразований. Наибольшее отличие медианы общей выживаемости обнаружено в случае плоскоклеточного рака шейки матки – медиана выживаемости в группе с низкой экспрессией SNAI1 была в 2.4 раза выше, чем в группе с высокой экспрессией этого гена. Эти данные согласуются c результатами, представленными в недавней публикации Huilun Yang и соавт. [89], которые доказывают взаимосвязь SNAI1 и TWIST1 с активным метастазированием рака шейки матки. Кроме того, эти данные подтверждены с помощью иммуногистохимического анализа [90] 154 образцов опухолей шейки матки. Наименьшее (значимое) отличие в общей выживаемости в зависимости от уровня SNAI1 выявлено для аденокарциномы желудка и прямой кишки. Интересно, что экспрессия SNAI2 не влияет на показатели общей выживаемости при аденокарциноме прямой кишки. На ограниченность использования Snail в качестве отдельного (независимого) прогностического маркера рака прямой кишки указывают результаты [91], где маркеры ЭМП предлагают комбинировать с маркерами стволовых клеток, чтобы повысить прогностическую значимость каждого из показателей в отдельности. Схожие закономерности получены при изучении взаимосвязи экспрессии SNAI2 с общей выживаемостью при 10 типах опухолей. В большинстве типов опухолей изменение экспрессии SNAI2 имеет такую же тенденцию, как и у SNAI1, – высокая экспрессия маркера считается фактором неблагоприятного прогноза. Исключение из этого правила представляет рак тела матки: высокая экспрессия SNAI2 при этом новообразовании соответствует более продолжительной общей выживаемости. Одним из объяснений такого наблюдения может быть низкая активность Slug в клетках рака тела матки. Так, ядерная локализация Slug выявлена лишь в 3.7% опухолевых образцов, т.е. клиническое значение этого показателя весьма ограничено [92]. По другим данным, в 25% случаев рака тела матки выявлена высокая экспрессия Slug, этот показатель связан с низкой выживаемостью, следовательно, его можно считать фактором неблагоприятного прогноза [93]. Уточнить прогностическую роль Slug (или доказать ее отсутствие) при раке тела матки еще предстоит.

Рис. 4. Регуляция и основные мишени транскрипционного фактора Snail

Несмотря на отсутствие статистически значимых различий в общей выживаемости больных РМЖ в группах с различным уровнем SNAI1 и SNAI2 (база KM-plotter), в ряде работ показано важное клиническое значение маркеров ЭМП, в частности Snail, при этом заболевании. В клетках РМЖ наблюдается высокая экспрессия Notch (74%), Slug (36%), Snail (62%), N-кадгерина (77%), в то время как экспрессия Е-кадгерина повышена примерно в 20% случаев [68]. Aнализ 157 образцов РМЖ выявил статистически значимую корреляцию между экспрессией Snail и Slug и их коактиватора – фактора NF-κB [94]. По данным Cao и соавт., высокая экспрессия Snail и низкий уровень Е-кадгерина коррелируют с количеством метастазов РМЖ в лимфатических узлах. Кроме того, высокий уровень Snail в значительной степени связан с низкой экспрессией E-кадгерина, а повышенная экспрессия Slug – с увеличением N-кадгерина у пациентов с РМЖ [68].

Экспрессия SNAI1 и SNAI2 и общая выживаемость больных онкологическими заболеваниями: анализ данных, представленных в базе KM-plotter

Опухоль	Показатель
	SNAI1*		SNAI2*
	Общая выживаемость (медиана)	Статистическая значимость	Общая выживаемость (медиана)	Статистическая значимость
Рак мочевого пузыря	Низкая экспрессия (эксп.) = 42.33 мес., высокая эксп. = 28.63 мес.	P = 0.0264, q >0.5	Низкая экспрессия (эксп.) = 47.33 мес., высокая эксп. = 20.77 мес.	P = 0.0008, q = 0.2
Плоскоклеточный рак шейки матки	Низкая эксп. = 68.4 мес., высокая эксп. = 27.9 мес.	P = 0.027, q >0.5	Разница статистически незначима
Аденокарцинома пищевода	Низкая эксп. = 46.83 мес., высокая эксп. = 20.33 мес.	P= 0.0449, q >0.5	Разница статистически незначима
Плоскоклеточный рак головы и шеи	Низкая эксп. = 58.73 мес., высокая эксп. = 46.6 мес.	P = 0.0398, q >0.5	Низкая эксп. = 58.73 мес., высокая эксп. = 37.77 мес.	P = 0.0174, q >0.5
Светлоклеточный рак почки	Низкая эксп. = 73 мес., высокая эксп. = 37.03 мес.	P = 0.0058, q >0.5	Низкая эксп. = 52.8 мес., высокая эксп. = 37.03 мес.	P = 0.0323, q >0.5
Папиллярный почечно-клеточный рак почки	Низкая эксп. = 89.47 мес., высокая эксп. = 43.53 мес.	P = 8.2e–5, q = 0.02	Низкая эксп. = 86.97 мес., высокая экспю = 43.8 мес.	P = 0.0014, q >0.2
Аденокарцинома легкого	Низкая эксп. = 50.93 мес., высокая эксп. = 40.3 мес.	P = 0.0124, q >0.5	Низкая эксп. = 54.4 мес., высокая эксп. = 35.77 мес.	P=0.0014, q>0.5
Плоскоклеточный рак легкого	Низкая эксп. = 72.33 мес., высокая эксп. = 35.83 мес.	P = 0.0002, q = 0.05	Разница статистически незначима
Рак яичника	Низкая эксп. = 49.97 мес., высокая эксп. = 38.97 мес.	P = 0.0089, q >0.5	Низкая эксп. = 46.13 мес., высокая эксп. = 38.7 мес.	P = 0.0192, q >0.5
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы	Разница статистически незначима		Низкая эксп. = 37.67 мес., высокая эксп. = 18.93 мес.	P = 0.0006, q = 0.2
Аденокарцинома прямой кишки	Низкая эксп. = 43.8 мес., высокая эксп. = 41.93 мес.	P = 0.0384, q > 0.5	Разница статистически незначима
Саркома	Разница статистически незначима		Низкая эксп. = 86.63 мес., высокая эксп. = 48.87 мес.	P = 0.001, q = 0.2
Аденокарцинома желудка	Низкая эксп. = 43.8 мес., высокая эксп. = 41.93 мес.	P = 0.0384, q >0.5	Низкая эксп. = 46.9 мес., высокая эксп. = 20.23 мес.	P = 0.0013, q = 0.2
Рак щитовидной железы	Низкая эксп.= не достигнута, высокая эксп. = не достигнута	P = 3.3–6, q = 0.01	Разница статистически незначима
Рак тела матки	Низкая эксп. = 114.1 мес., высокая эксп. = 51.6 мес.	P = 0.0614, q = 0.01	Низкая эксп. = 36.87 мес., высокая эксп. = 78.4 мес.	P = 0.0113, q ≥ 0.01

*При плоскоклеточном раке пищевода, раке печени, молочной железы и эндометриальном раке тела матки различия в экспрессии SNAI1 и SNAI2 статистически незначимы.

В опухолевых клетках, имеющих морфологические признаки ЭМП (способность к миграции и инвазии), уровень Snail, Slug, ZEB1 выше, чем в клетках без признаков ЭМП [95]. Нокдаун генов SNAI1 и SNAI2 приводит к возвращению эпителиальной морфологии и существенному снижению количества клеток, мигрирующих в камере Бойдена. Feng и соавт. показали, что уровни Snail, Е-кадгерина, Slug и Twist, но не N-кадгерина, в озлокачествленных эпителиальных клетках выше, чем в клетках доброкачественных новообразований [96].

Низкий уровень экспрессии E-кадгерина и высокий уровень N-кадгерина характерны для метастазов рака желудка и для недифференцированных опухолевых клеток, что коррелирует с плохим прогнозом. Высокая экспрессия Snail в первичной опухоли и низкая в метастазах коррелирует с дальнейшим увеличением метастазирования и негативным прогнозом [97].

Высокая экспрессия Snail, но не Slug, и низкая экспрессия Е-кадгерина связаны с худшей выживаемостью при раке мочевого пузыря [98]. При раке шейки матки увеличение Snail и снижение E-кадгерина являются негативными прогностическими факторами. По последним данным экспрессия Snail является более значимым фактором прогноза этого заболевания, чем экспрессия других регуляторов ЭМП (Slug, ZEB1 и Twist) [99].

Сверхэкспрессия рецептора эпидермального фактора роста Her2/Neu стабилизирует Snail, способствуя лекарственной устойчивости рака желудка [100] и РМЖ [101]. Используя индуцибельную модель РМЖ с экспрессией Her2/Neu, Moody и соавт. обнаружили, что частота рецидивирования опухоли коррелирует с высоким уровнем Snail [102]. С повышением экспрессии Snail и Twist ассоциирован неблагоприятный прогноз эстрогенположительных форм РМЖ [103].

Таким образом, экспрессия маркеров ЭМП, в частности белков семейства Snail, связана со степенью злокачественности и, в целом, с прогрессией заболевания. Правомерно полагать, что исследованные маркеры ЭМП в ряде случаев могут быть прогностически значимыми [96]. Однако для внедрения в клиническую практику нужно выбрать методы анализа, валидировать их и доказать экономическую целесообразность использования новых маркеров.

БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА Snail И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ХИМИОТЕРАПИИ

Белки-регуляторы ЭМП могут определять не только способность опухолевых клеток к метастазированию и инвазии, но и их устойчивость к генотоксическим и таргетным противоопухолевым препаратам. Механизмы такой резистентности опосредуются антиапоптотическим действием, снижением пролиферации и индукцией множественной лекарственной устойчивости. Роль Slug и Snail в формировании устойчивости к химио- и лучевой терапии показана в ряде исследований [104].

Так, уровень белка Snail повышен в опухолях и линиях клеток, устойчивых к цисплатину [105]. Кроме этого, Snail вызывает устойчивость к гемцитабину в моделях рака поджелудочной железы [106] и РМЖ [107], к этопозиду – в модели мелкоклеточного рака легкого [108].

Haslehurst и соавт. показано, что в линии клеток рака яичника A2780, устойчивой к цисплатину, повышена экспрессия генов SNAI1, SNAI2, TWIST и ZEB2. Резистентные к цисплатину клетки имели мезенхимальный фенотип, межклеточные контакты отсутствовали, в то время как чувствительные клетки сохраняли эпителиальную морфологию. При нокдауне генов ключевых регуляторов ЭМП – Snail и Slug – клетки возвращались к исходному эпителиальному фенотипу [42].

Стабильность Snail при действии цисплатина обусловлена деубиквитинированием Snail белком USP1, который индуцируется при повреждении ДНК и стабилизирует ряд репарационных и антиапоптотических белков [109]. Сходным образом Snail стабилизируется деубиквитиназой USP27x, индуцируемой TGF-β, в модели устойчивости к цисплатину [110]. Репарационные ферменты PARP-1 и PARP-3 являются еще одним механизмом взаимосвязи повреждения ДНК и экспрессии Snail в ответ на химиотерапию. PARP-1 контролирует экспрессию Snail на уровне транскрипции в клетках, подвергшихся воздействию доксорубицина, а ABT-888, ингибитор PARP-1, способен усиливать ответ клеток РМЖ (линия MDA-MB-231) на доксорубицин. Ингибирование PARP-1 может повысить чувствительность опухолевых клеток in vivo, снижая экспрессию Snail [111]. Сходным образом истощение PARP-3 ингибирует TGF-β-зависимый ЭМП клеток РМЖ, предотвращая связывание Snail с E-кадгерином и повышая чувствительность к химиопрепаратам [112].

Факторы транскрипции семейства Snail также опосредуют резистентность клеток к отдельным таргетным препаратам. Экспрессия Slug повышена в модели рака легкого, устойчивой к ингибитору EGFR гефитинибу, и в биоптатах пациентов, получавших ингибиторы EGFR. В этой модели Slug репрессировал каспазу-9 и проапоптотический белок Bim, а подавление Slug повышало чувствительность клеток к ингибиторам EGFR [113]. Snail определяет устойчивость клеток трижды негативного РМЖ к рапамицину и эверолимусу – ингибиторам протеинкиназы mTOR. В этой модели ингибитор гистондеацетилаз траметиниб подавлял Snail-индуцированный ЭМП [102].

Роль Snail и Slug в лекарственной устойчивости опухолевых клеток связана с репрессией генов проапоптотических белков PUMA, ATM, PTEN, р53, BID, каспазы-6 и дерепрессией генов белков, связанных с фенотипом стволовости [52, 55, 57]. Помимо антиапоптотического действия Snail также повышает экспрессию ABC-транспортеров – важнейший механизм множественной лекарственной устойчивости [114].

Рис. 5. Фармакологические ингибиторы функций Snail

Snail может регулировать иммунные реакции. Так, TGF-β индуцирует Snail в макрофагах, мигрирующих в очаг воспаления и в рану [81]. Опухоли с высоким уровнем экспрессии Snail содержат мало инфильтрирующих CD8⁺ цитотоксических Т-лимфоцитов и повышенное количество проопухолевых макрофагов M2 [115]. Snail также индуцирует иммуносупрессию и иммунорезистентность через цитокин TSP1 и активируемые TGF-β регуляторные Т-клетки, снижающие экспрессию стимулирующих молекул в дендритных клетках, что подавляет цитотоксические Т-лимфоциты [116].

Опухолевые стволовые клетки (ОСК) – небольшая популяция клеток, для которых характерны экспрессия маркеров стволовости и плюрипотентность. Считают, что ОСК – источник гетерогенности опухоли. В частности, клональность опухоли, поддерживаемая популяцией ОСК, является фактором химио- и радиорезистентности. Получены свидетельства в пользу того, что ОСК имеют повышенный метастатический потенциал, но механизмы этого процесса изучены недостаточно [117–119]. Показано, что регулятор стволовости SOX2, индуцируемый фактором роста эндотелия сосудов (VEGF-A), запускает ЭМП и метастазирование. В линиях РМЖ и клетках нативных опухолей VEGF-A активирует экспрессию SOX2, что приводит к индукции SNAI2 через miR-452, запуску ЭМП, увеличению инвазии и метастазированию. Таким образом, VEGF-A стимулирует SOX2- и Slug-зависимую инвазию [120]. Следовательно, сверхэкспрессия транскрипционного фактора ЭМП Slug повышает миграционную активность ОСК [96].

В результате активации сигнального пути SCF/c-Kit происходит увеличение уровня Slug, что обусловливает устойчивость клеток рака яичника к радиотерапии и способствует выживанию ОСК [57]. Кроме того, SCF/c-Kit/Slug опосредует лекарственную устойчивость клеток мезотелиомы человека. Нокдаун c-Kit/KIT или SNAI2 увеличивает чувствительность клеток мезотелиомы к химиотерапевтическим агентам доксорубицину, паклитакселу и винкристину. Трансфекция c-Kit/KIT в клетки мезотелиомы в присутствии SCF усиливает активность Slug и повышает устойчивость к этим препаратам. Клетки мезотелиомы с высоким уровнем Slug устойчивы к лекарственной терапии [121].

Таким образом, белки семейства Snail могут принимать непосредственное участие в развитии резистентности к терапии и подавлении противоопухолевого иммунитета. Эти свойства Snail, наряду с участием в ЭМП, указывают на необходимость фармакологического ингибирования этих белков.

ВОЗМОЖНОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ИНГИБИРОВАНИЯ Snail

Сигнальные пути с участием белков семейства Snail представляют интерес для поиска новых подходов в химиотерапии. Прямое фармакологическое ингибирование затруднено сложностью выбора функционального домена белка в качестве мишени. Тем не менее отдельные попытки успешно реализованы (рис. 5).

В качестве мишени Vistain и соавт. [122] предложили E-box – последовательность, с которой связывается Snail. Синтезирован комплекс Co(III), конъюгированный с гексануклеотидом CAGGTG. Проникая в клетку, комплекс Co(III)-E-box связывает Snail и препятствует его взаимодействию с ДНК. Созданные конструкции значительно понижали инвазивный потенциал опухолевых клеток. Таким образом, авторы надеются на высокую эффективность данного соединения в качестве терапевтического ингибитора прогрессирования опухоли и метастазирования РМЖ.

Проведен поиск химического ингибитора Snail [123]. В качестве мишени выбран комплекс Snail с p53. Была синтезирована серия соединений и найдены два лидерных (GN25 и GN29), которые увеличивали экспрессию p53 и разобщали его со Snail. Соединения GN25 и GN29 показали селективность для клеток с мутацией K-Ras и низкую токсичность для неопухолевых клеток. Однако влияние этих соединений на опухолевые клетки неоднозначно, а механизм их действия изучен недостаточно, поэтому еще рано говорить о клинических испытаниях этих веществ.

Описан ряд соединений, которые влияют на экспрессию Snail, но при этом не являются его прямыми ингибиторами. Дисульфирам (DSF), использующийся в терапии алкогольной зависимости, ингибирует NF-κB. DSF ингибирует TGF-β-индуцированный ЭМП в клетках РМЖ, миграцию и инвазию, а также рост опухолевых трансплантатов. DSF подавляет сигнальный путь ERK/NF-κB/Snail, приводя к МЭП [124]. На данный момент DSF проходит фазу 2 клинических испытаний для лечения пациентов со стадией 4 РМЖ в Чехии. Обнаружено, что Z-FY-CHO – селективный ингибитор катепсина L, протеазы компонентов ВКМ – снижает экспрессию Snail и запускает МЭП в клетках рака предстательной железы с мезенхимальным фенотипом [125].

Способностью инициировать МЭП обладают фитоэстрогены, которые модулируют передачу сигналов посредством Snail и Twist1. Флавонон нарингенин понижал инвазивность клеток рака предстательной железы, блокируя Snail и Twist1 [126]. Схожая активность описана для нобилетина – флавоноида из цитрусовых растений. Это соединение влияет на сигнальные пути TGF-β, ZEB, Slug и Snail, оно способно подавлять инвазию и миграцию опухолевых клеток [127]. Интерес исследователей к потенциальным ингибиторам ЭМП природного происхождения подкреплен относительно низкой токсичностью этих соединений для неопухолевых тканей, а также антиканцерогенными свойствами [128–130]. Действительно, флавонон апигенин проявляет антипролиферативное действие на клетках РМЖ с мезенхимальными характеристиками [131]. Описано подавление экспрессии Snail, ЭМП и метастазирования клеток этим фитоэстрогеном [132–134]. Антиметастатическим эффектом обладает также флавоноид кверцетин [135]. Обработка клеток рака легкого кверцетином приводила к снижению их инвазивной и миграционной активности. Кверцетин влиял на сигнальный путь Akt-Snail, поддерживающий выживаемость клеток и способность к метастазированию. Кверцетин проходит ряд клинических испытаний в качестве средства для лечения пациентов с раком предстательной железы (фаза 2), легкого (фаза не указана) и почки (фаза 2). Для предотвращения ЭМП актуальным представляется создание соединений, инактивирующих белки семейства Snail и предотвращающих трансактивацию их генов-мишеней.

Способность перечисленных соединений ингибировать функции и активность Snail вселяет надежду, что эти вещества после более детального и тщательного изучения механизмов их действия будут участвовать в клинических испытаниях в качестве средств для лечения прогрессирующих и метастазирующих опухолей.

В настоящее время перед исследователями стоит задача модифицировать соединения, найти наилучший способ их доставки, а также разработать методы терапии совместно с другими цитотоксическими препаратами [136].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Белки семейства Snail – ключевые регуляторы ЭМП – модулируют множество процессов в онтогенезе и онкобиологии. Подробное изучение ЭМП в опухолевых клетках определило важную роль этого процесса в инвазии и метастазировании. Транскрипционные факторы Snail являются специфическими «переключателями» эпителиального, более благоприятного фенотипа клеток, на агрессивный прометастатический. Именно поэтому молекулярные события, опосредованные этими белками, представляют интерес как мишени терапии, в частности, резистентных метастатических форм опухолей. Разработка фармакологических подходов к ингибированию Snail только начинается. Тем не менее охарактеризованы химические классы синтетических и природных соединений, воздействующих на транскрипционную активность, экспрессию Snail и инициирующих МЭП. Дальнейшее исследование ЭМП и его регуляторов перспективно для персонализированной терапии опухолей.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВКМ – внеклеточный матрикс; ММП – матриксные металлопротеиназы; МЭП – мезенхимально-эпителиальный переход; ОСК – опухолевые стволовые клетки; РМЖ – рак молочной железы; ЭМП – эпителиально-мезенхимальный переход.

Авторы выражают благодарность А.А. Штилю за обсуждение работы и Е.А. Варламовой за помощь в оформлении рукописи. Иллюстрации созданы с использованием шаблонов Servier Medical Art (лицензия Creative Commons Attribution 3.0 Unported); https://smart.servier.com. При написании обзора использованы данные, находящиеся в открытом доступе (https://clinicaltrials.gov/; https://www.uniprot.org/; https://kmplot.com/analysis/).

Работа поддержана грантом Минобрнауки Российской Федерации (соглашение № 14.W03.31.0020 с Институтом биологии гена РАН).

Об авторах

Маргарита Андреевна Ястребова

Институт биологии гена РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: RitaYastrebova2009@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0405-9360
Scopus Author ID: 57196485300
Россия, Москва

Альвина Ильвировна Хамидуллина

Институт биологии гена РАН

Email: 94Alvina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8137-0625
ResearcherId: K-5781-2017
Россия, Москва

Виктор Вячеславович Татарский

Институт биологии гена РАН; Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России

Email: tatarskii@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Aлександр Mихайлович Щербаков

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России

Email: alex.scherbakov@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы