Связь экспрессии мРНК кальпаинов 1 и 2 и мРНК белков, участвующих в перестройке цитоскелета

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

САР1 – белок 1, ассоциированный с аденилилциклазой; РГ – плоскоклеточный рак гортани и гортаноглотки; АСБ – актинсвязывающие белки; CFN1 – кофилин; PFN1 – профилин; EZR – эзрин; FSCN1 – фасцин; CAPN1 – кальпаин 1; CAPN2 – кальпаин 2.

ВВЕДЕНИЕ

Характерный для клеток опухоли высокий пролиферативный и миграционный потенциал тесно связаны с изменением механики мембран, ассоциированной с ремоделированием цитоскелета. Для понимания механизмов опухолевого роста актуально детальное изучение процессов перестройки цитоскелета. В процессах реорганизации цитоскелета участвуют различные белки: регуляторные (транскрипционные факторы: Snai1, Slug, ZEB, Twist), сигнальные (семейство малых GTP-аз RhoA, семейство протеинкиназ B и др.), адгезивные молекулы, протеазы (металлопротеазы, кальпаины, протеасомы и др.), белки цитоскелета (белки промежуточных филаментов (виментин, кератины и др.), актинсвязывающие белки (АСБ) и др.) [1–4].

Известно, что кальпаины – внутриклеточные Са²⁺-зависимые цистеиновые протеазы – участвуют в регуляции ремоделирования цитоскелета. Кальпаины имеют широкий спектр субстратов: белки цитоскелета, факторы транскрипции, различные ферменты, а их направленное ингибирование можно считать аналогичным блокированию разнообразных сигнальных путей [3, 4]. Динамика актина регулируется большим семейством АСБ, служащих субстратами кальпаинов. Вклад АСБ, участвующих в ремоделировании актинового цитоскелета, в опухолевую прогрессию и метастазирование имеет фундаментальное значение [5–8]. В настоящее время активно изучается роль тандема АСБ и протеаз в процессах опухолевого роста [7, 8]. Поэтому связь между уровнем экспрессии генов CAPN1 и 2 и генов маркеров клеточной подвижности (SNAI1, VIM, RND3) и актинсвязывающих белков кофилина (CFN1), профилина (PFN1), эзрина (EZR), фасцина (FSCN1) и белка 1, ассоциированного с аденилилциклазой (CAP1), изучена нами на модели высокоагрессивного рака гортани и гортаноглотки (РГ).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материал и характеристика групп

В работе использовали парные образцы опухолевой и морфологически неизмененной ткани гортани и гортаноглотки, полученные при видеоларингоскопии от 44 больных, поступивших на лечение в НИИ онкологии ТНИМЦ РАН. Диагноз был гистологически верифицирован как плоскоклеточный рак гортани и гортаноглотки (РГ), стадии T_1-4N_0-2M₀ (T_1-4N₀M₀ – 21, T_1-4N₁M₀ – 16, T_1-4N₂M₀ – 7). Средний возраст больных составил 56 ± 7 лет. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан», получено разрешение этического комитета института. Образцы тканей помещали в раствор RNAlater (Ambion, США), хранили при температуре –80°С до анализа.

Методы исследования

Суммарную мРНК выделяли с помощью набора CCR-50 («Биосилика», Новосибирск) согласно протоколу производителя. Качество мРНК оценивали с помощью капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, США) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, США). кДНК получали на матрице мРНК с помощью набора реагентов для обратной транскрипции ОТ-1 («Синтол», Москва) согласно протоколу производителя. Уровень экспрессии мРНК оценивали методом ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии Sybr Green на амплификаторах iCycler (Bio-Rad, США) и рассчитывали по методу 2^-ΔΔСT. Праймеры подобраны с помощью программы Vector NTI Advance 11.5 и базы данных NCBI. Последовательности праймеров приведены в таблице [7]. В качестве референсного гена использовали ген GAPDH «домашнего хозяйства». Продукты реакции оценивали с помощью капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, США) и использовали анализ кривой плавления (Rotor Gene 6000).

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием непараметрических критериев: тестов Манна–Уитни, Краскела–Уоллиса и рангового теста множественных сравнений, коэффициента корреляции Спирмена, коэффициента корреляции Кенделла. Результаты приведены как М ± m, где М – среднее, m – стандартное отклонение; n – количество человек в группе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Больные были разделены на группы с низкой экспрессией CAPN1: «L–capn1» от 0.0 до 5.1 (n = 24) и высокой экспрессией «H–capn1» от 5.03 и выше (n = 20); с низкой экспрессией CAPN2 «L–capn2» от 0.0 до 2.0 (n = 23) и высокой экспрессией «H–capn2» от 2.01 и выше (n = 21). Высокий уровень экспрессии CAPN1 в представленной выборке больных РГ был связан с наличием регионарных метастазов (r = 0.4, p ≤0.05), а связь уровня экспрессии CAPN2 с метастатическим статусом на данном этапе была незначимой (r ≥ 0.3, р = 0.055). Можно предположить, что увеличение использованной выборки больных РГ позволит выявить значимую ассоциацию экспрессии CAPN2 с метастазированием.

Анализ экспрессии генов SNAI1, RND3 и VIM, кодирующих маркеры клеточной подвижности, показал, что на фоне высокого уровня экспрессии CAPN1 уровень экспрессии VIM был значимо ниже (табл. 1). Зависимость уровня экспрессии мРНК SNAI1, RND3 и VIM от наличия метастазов была на уровне тенденций. Полученные результаты не согласуются с данными [6] и могут быть связаны с особенностями метастазирования рака гортани, что нуждается в проведении дополнительных исследований.

 

Таблица 1. Уровень экспрессии мРНК генов, кодирующих маркеры клеточной подвижности, в зависимости от уровня экспрессии генов, кодирующих протеазы

Ген	L–capn1	H–capn1	Р1	L–capn2	H–capn2	Р2
SNAI1	3.89±5.09	0.43±0.54	0.11	2.56±5.28	3.54±7.17	0.88
VIM	25.31±12.6	6.8±11.08	0.04	19.26±25.89	22.52±34.62	0.98
RND3	5.7±11.8	20.33±26.59	0.28	19.88±43.44	11.72±21.60	0.54

Примечание: Р1 и Р2 – статистическая значимость различий с группой «L–capn1» и «L–capn2» соответственно.

 

Сравнение профиля экспрессии актинсвязывающих белков и уровня экспрессии протеаз (табл. 2) выявило статистически значимо низкий уровень экспрессии CAP1 на фоне высокого уровня экспрессии CAPN1. Снижение уровня экспрессии САР1 в образцах РГ не согласуется с ранее полученными результатами, согласно которым содержание белка САР1 увеличивается при развитии опухолевого процесса [7]. Роль САР1 в процессах опухолевого роста до сих пор не установлена [7], отсутствуют также данные о коэкспрессии этого белка и протеаз.

 

Таблица 2. Уровень экспрессии мРНК генов, кодирующих белки, ассоциированные с ремоделированием цитоскелета, в зависимости от уровня мРНК протеаз

Ген	L–capn1	H–capn1	Р1	L–capn2	H–capn2	Р2
FSCN1	5.06±8.19	12.91±24.56	0.52	11.45±21.34	5.96±9.01	0.93
EZR	16.37±24.03	17.31±45.88	0.56	8.92±17.61	31.38±13.96	0.02
PFN1	6.95±12.23	11.76±22.59	0.90	24.30±45.43	7.12±9.44	0.74
CFN1	19.57±25.75	16.67±28.61	0.39	14.28±25.32	21.64±26.97	0.26
CAP1	20.30±29.7	9.97±16.2	0.05	18.70±32.08	14.16±24.26	0.54

Примечание: Р1 и Р2 – статистическая значимость различий с группой «L–capn1» и «L–capn2» соответственно.

 

В группе с высокой экспрессией CAPN2 отмечена высокая экспрессия гена, кодирующего эзрин – субстрат кальпаина 1 [8]. Однако в нашей работе экспрессия EZR увеличивалась в 3.8 раза на фоне высокой экспрессии CAPN2 и не была связана с уровнем экспрессии CAPN1. Высокий уровень эзрина и экспрессии CAPN2 связывают с высокой скоростью сборки–разборки фокальных контактов [8]. Причем показано [8], что эзрин необходим для кальпаин-опосредованного протеолиза талина, киназы фокальных контактов и кортактина. Выявленная нами коэкспрессия CAPN2 и EZR может говорить об увеличении скорости процессов ассоциации–диссоциации в фокальных контактах, которые свидетельствуют о приобретении мобильности опухолевыми клетками. Нужно отметить, что высокий уровень эзрина связывают с низкой выживаемостью онкологических больных [9]. В настоящий момент не представляется возможным говорить о связи коэкспрессии CAPN2 и EZR с метастазированием рака гортани. Вероятно, этот механизм используется в других процессах, в частности, при инвазии опухолевых клеток.

Корреляционный анализ в представленных выборках больных РГ с разным уровнем экспрессии генов протеаз показал, что на фоне низкой экспрессии CAPN1 наблюдалась средней силы корреляция между уровнем VIM и CAP1, EZR и CAPN2 и уровнем PFN1 и CFN1 (r ≥ 0.6, p ≤0.05). При высоком уровне экспрессии CAPN1 наблюдалось появление взаимосвязи между экспрессией SNAI1 и PFN1, VIM и RND3, CAP1 и CFN1 (r ≥ 0.6, p ≤ 0.05). Учитывая, что высокий уровень экспрессии CAPN1 в основном связан с наличием регионарных метастазов (r = 0.4, p ≤ 0.05), можно предположить активацию процессов эпителиально-мезенхимального перехода. На фоне изменения экспрессии CAPN2 также происходило переключение связей между экспрессией генов белков, участвующих в реализации клеточной подвижности. При низком уровне экспрессии CAPN2 наблюдалась корреляция средней силы между уровнем экспрессии FSCN1 и PFN1, PFN1 и CFN1 (r ≥ 0.6, p ≤ 0.05). Средняя связь между уровнем экспрессии CAP1, PFN1 и CFN1 (r ≥ 0.6, p ≤ 0.05) отмечена на фоне высокой экспрессии CAPN2. Итак, уровень экспрессии CAPN2 в данной выборке пациентов коррелировал с экспрессионным профилем АСБ и не был связан с метастатическим статусом (r ≥ 0.3, р = 0.055) РГ. Вероятно, при увеличении выборки больных РГ могут быть получены значимо ассоциированные результаты. Возможно, уровень экспрессии и значимые корреляции кальпаинов 1 и 2 с клинико-морфологическими характеристиками зависят от других характеристик опухоли [10] или связаны с важной ролью других членов семейства кальпаинов в патогенезе РГ [11, 12].

Метастатический потенциал опухоли определяется приобретением опухолевыми клетками атипичных морфофункциональных и молекулярно-генетических свойств, приводящих к неконтролируемому росту, пролиферации и появлению локомоторного фенотипа. Мобильность опухолевых клеток связана с трансформацией актинового цитоскелета, что сопровождается изменениями в составе, функциях и активности различных белков и их генов [2, 6–8]. Так, результаты нашей работы говорят о том, что метастазирование ассоциировано с высоким уровнем экспрессии CAPN1 в сочетании с низким уровнем экспрессии VIM и CAP1. Снижение экспрессии VIM несколько противоречит принятым суждениям и требует более тщательной проверки с включением большего числа пациентов и генов-мишеней, которые могут быть задействованы в альтернативных путях регуляции метастазирования. Уровень экспрессии CAPN2 не имел значимой связи с лимфогенным метастазированием у пациентов с РГ в нашей выборке. Высокий уровень этой протеазы сопровождался высоким уровнем экспрессии EZR, что косвенно может указывать на активацию процессов инвазии [9, 10]. В целом, результаты подтверждаются данными о тканеспецифичности кальпаинов, например о связи рака гортани с CAPN10 [11], а уровень экспрессии CAPN6 отрицательно коррелирует с исходом заболевания у больных плоскоклеточным раком головы и шеи [12]. Тем не менее результаты нашего исследования говорят о необходимости детального изучения возможных молекулярных механизмов взаимодействия кальпаиновой системы и белков, ассоциированных с ремоделированием цитоскелета, на транскриптомном и протеомном уровне.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На представленной выборке больных РГ нами обнаружено, что уровень экспрессии CAPN1 связан с уровнем экспрессии генов белков цитоскелета – виментина и САР1, участвующих в ремоделировании цитоскелета. Уровень экспрессии CAPN2 коррелировал с экспрессией мРНК эзрина, белка-линкера между плазматической мембраной и актиновым цитоскелетом, высокий уровень которого ассоциирован с инвазивным ростом [10]. Лимфогенное метастазирование у больных РГ коррелировало с высоким уровнем экспрессии CAPN1, уровень CAPN2 не имел такой связи. Результаты представленной работы говорят о необходимости дополнительных исследований на увеличенной выборке пациентов с расширением панели генов-мишеней, которые теоретически могут участвовать в рабочем тандеме кальпаины–белки цитоскелета. Полученные данные важны для выяснения механизмов метастазирования и опухолевой прогрессии, что в последующем позволит найти новые маркеры прогрессии плоскоклеточного рака гортани и гортаноглотки.

Об авторах

Гелена Валерьевна Какурина

Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: kakurinagv@oncology.tomsk.ru
Россия, Томск

Елена Сергеевна Колегова

Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН

Email: elenakolegowa@mail.ru
Россия, Томск

Елена Евгеньевна Шашова

Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН

Email: SchaschovaEE@oncology.tomsk.ru
Россия, Томск

Ольга Владимировна Черемисина

Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН

Email: CheremisinaOV@oncology.tomsk.ru
Россия, Томск

Евгений Лхамацыренович Чойнзонов

Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН

Email: info@tnimc.ru
Россия, Томск

Ирина Викторовна Кондакова

Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН

Email: kondakova@oncology.tomsk.ru
Россия, Томск

Список литературы

Дополнительные файлы