Подтипы рецепторов нонапептидов нейрогипофиза и их функции в почках крысы

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Нонапептиды нейрогипофиза влияют на функции различных органов и систем у млекопитающих, участвуют в регуляции социального поведения [1]. Среди периферических эффектов этих гормонов важную роль играет регуляция работы почек при поддержании водно-солевого гомеостаза [2]. В нейрогипофизе большинства позвоночных животных секретируются вазопрессин-подобный (вазотоцин, вазопрессин, лизипрессин, фенипрессин) и окситоцин-подобный (окситоцин, мезотоцин, изотоцин, глумитоцин) гормоны [3]. Вазопрессин-подобные пептиды содержат остаток основной аминокислоты в положении 8 (Arg, Lys), а окситоцин-подобные – остаток нейтральной аминокислоты (Leu, Ile, Pro) [4]. Вазопрессин млекопитающих и человека участвует в регуляции функций почек: усиливает реабсорбцию воды, мочевины и натрия [5]. К основным периферическим эффектам окситоцина относятся утеротонический эффект [6] и стимуляция выведения молока [7]. Введение высоких доз вазопрессина и окситоцина выявляет их натрийуретическое действие [8–10], а инъекции низких доз окситоцина оказывают гидроуретическое действие [11]. Ранее мы показали, что введение млекопитающим вазотоцина (гормон нейрогипофиза у других классов позвоночных) вызывает интенсивный натрийурез, существенно превышающий эффект вазопрессина и окситоцина [12]. Синтезированы и охарактеризованы аналоги вазотоцина с селективным антидиуретическим и натрийуретическим действием (повышение экскретируемой фракции натрия с 0.5% до 15–20%) [13]. Выявлены также пептиды, усиливающие выведение почками ионов калия [12]. В ходе эволюции позвоночных изменялась структура как гормонов нейрогипофиза, так и соответствующих им рецепторов. Принципиально важно понять, при участии рецепторов каких подтипов опосредуются эффекты нонапептидов и их аналогов в почке. Связаны ли они с действием пептида на известные подтипы рецепторов вазопрессина (V₂, V_1a, V_1b) и окситоцина [14] или существуют другие подтипы рецепторов? Описан новый рецептор мыши, имеющий более высокое сродство к вазотоцину, чем к вазопрессину и окситоцину [15]. Задача настоящей работы заключалась в том, чтобы, используя методы биоинформатики, определить спектр подтипов рецепторов к пептидам семейства вазопрессина и окситоцина у млекопитающих, а также выявить возможность воспроизведения эффектов, оказываемых аналогами вазотоцина, при введении крысам различных доз их природных гормонов – вазопрессина и окситоцина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Гомологи гена вазотоцинового рецептора искали в геноме крысы (Rattus norvegicus), в протеомах и транскриптомах 9 видов млекопитающих: крысы, человека (Homo sapiens), шимпанзе (Pan troglodytes), орангутана (Pongo abelii), белощекого гиббона (Nomascus leucogenys), собаки (Canis lupus familiaris), мыши (Mus musculus), домового опоссума (Monodelphis domestica), утконоса (Ornithorhynchus anatinus), доступных на ресурсе Genome (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/). Список геномных сборок приведен в табл. 1. Для поиска гомологов использовали программы nHMMER и pHMMER, построенные на скрытых марковских моделях, а также оригинальный программный код на языке shell [16]. Степень гомологии оценивали по значениям e-value и score, которые автоматически присваивались программой на основании внутренних алгоритмов. В качестве запроса использовали марковскую модель, построенную по аминокислотным и нуклеотидным последовательностям рецепторов вазотоцина (V_1a-подтип) различных позвоночных. Пороговое значение e-value выбрано на уровне 1e^–3 для аминокислотных выравниваний и 1e^–10 – для нуклеотидных согласно опубликованной методике [17]. Последовательности, не удовлетворяющие данным параметрам, в дальнейшем не рассматривали. Все найденные последовательности ранжировали в порядке уменьшения показателя сходства с запрашиваемой последовательностью (индекс Score) и представляли в графическом виде для выбора порогового уровня. В ходе дальнейших исследований использовали все последовательности с индексом Score больше порогового, а также по две последовательности ниже порогового уровня у каждого вида млекопитающих. Полученные последовательности были сохранены в одном файле в формате fasta. Множественные выравнивания найденных гомологов выполнены с помощью программы MAFFT [18]. Алгоритм L-INS-i выбран нами как наиболее подходящий для работы с базами, содержащими менее 200 последовательностей [19]. Fasta-файл с результатами множественного выравнивания для дальнейшего анализа преобразовывали в nexus-файл с помощью web-инструмента Alignment Format Converter (http://www.ibi.vu.nl/programs/convertalignwww/). С использованием программы MrBayes и файла в формате nexus, полученного на прошлом этапе, выполнена байесовская реконструкция филогении гомологов [20]: произведено 300 000 генераций в случае аминокислотных последовательностей и 20 000 в случае нуклеотидных последовательностей. Число генераций выбрано на основе предварительно проведенного вычислительного эксперимента, где после всех генераций стандартное отклонение вероятностей расщепления было ниже 0.01 (значение выбрано на основании опубликованных данных [20]). Кладограмма с апостериорными вероятностями для каждого расщепления и филограмма со средней длиной ветвей были сгенерированы и записаны в nexus-файл. Визуализацию и редактирование деревьев выполняли инструментом FigTree (github.com/rambaut/figtree/). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей рецепторов вазопрессина, окситоцина и нейропептида S крысы выполнено с помощью Clustal Omega 1.2.4 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

 

Таблица 1. Список версий использованных протеомов, транскриптомов и геномов

Вид	Версия
Homo sapiens	GRCh38.p12
Pan troglodytes	Clint_PTRv2
Pongo abelii	Susie_PABv2
Nomascus leucogenys	Nleu_3.0
Canis lupus familiaris	CanFam3.1
Rattus norvegicus	Rnor_6.0
Mus musculus	GRCm38.p6
Monodelphis domestica	MonDom5
Ornithorhynchus anatinus	Ornithorhynchus_anatinus-5.0.1

 

Физиологические эксперименты выполнены на самках крыс линии Вистар весом 180–230 г. В каждой серии использовали 10 животных. Крысы получали стандартный гранулированный корм («Мелькомбинат», Россия) и имели свободный доступ к воде. С вечера накануне эксперимента крыс не кормили, но сохраняли доступ к воде. Содержание животных и проведение экспериментов соответствовали российским и международным правилам работы с лабораторными животными. В дни экспериментов у животных определяли фазы эстрального цикла с помощью микроскопического анализа мазков влагалищных смывов. Соотношение фаз проэструс, эструс, метэструс и диэструс составило в среднем 15 ± 6, 11 ± 5, 26 ± 6 и 48 ± 7% соответственно. Вазопрессин и окситоцин (Sigma-Aldrich, США), селективные агонисты окситоциновых (Carbetocin, Tocris, Великобритания) и V_1a-рецепторов (Phe²,Ile³,Orn⁸-вазопрессин, Bachem, США) в дозах 0.005, 0.015, 0.15 нмоль на 100 г массы тела (м.т.) вводили внутримышечно на фоне водной нагрузки (вода в объеме 2 мл на 100 г м.т. через зонд в желудок), которую использовали для подавления секреции вазопрессина. Контролем служили животные с водной нагрузкой и внутримышечной инъекцией 0.1 мл физиологического раствора на 100 г м.т. Селективные антагонисты окситоциновых (Pmp¹-Tyr(Me)²-Thr⁴-Orn⁸-des-Gly-NH₂⁹-вазотоцин, Bachem, США) и V_1a-рецепторов (Pmp¹-Tyr(Me)²-вазопрессин, Bachem, США) вводили в дозе 2 нмоль на 100 г м.т. внутрибрюшинно одновременно с вазопрессином в дозе 0.15 нмоль на 100 г м.т. на фоне водной нагрузки. Крыс помещали в специальные индивидуальные клетки для сбора проб мочи при спонтанных мочеиспусканиях. Осмоляльность мочи определяли на микроосмометре Advanced Instruments 3300 (США), концентрацию ионов натрия и калия – на пламенном фотометре Sherwood-420 (Великобритания). Показатели экскреции ионов и реабсорбции воды рассчитывали за период 60 мин от начала эксперимента. При расчете реабсорбции осмотически свободной воды использовали усредненное значение осмоляльности сыворотки крови у крыс после водной нагрузки, равное 288 ± 1 мОсм/кг H₂O. Во всех сериях экспериментов эффекты гормонов и агонистов их рецепторов наблюдали на протяжении всего эстрального цикла, поэтому значения показателей функции почек у крыс усредняли без учета фазы цикла. Показатели функции почек нормировали на 100 г м.т. Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Сравнение групп проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим использованием t-теста с поправкой Бонферрони. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поиск подтипов рецепторов вазопрессина и окситоцина методами биоинформатики

Найденные последовательности, сходные с рецептором вазотоцина, ранжировали в порядке убывания индекса Score (рис. 1). Показано, что у последовательностей с наилучшим совпадением с запрашиваемой индекс Score составил более 600, далее степень сходства резко снижалась, и у большинства последовательностей индекс равен примерно 100. В качестве порогового значения был принят уровень 200 (рис. 1). Последовательности, у которых Score был выше порогового, анализировали вручную по базе данных NCBI. Все обнаруженные белки, сходные на уровне первичной структуры с рецептором вазотоцина, аннотировали как рецепторы окситоцина и вазопрессина различных подтипов. Из дальнейшего анализа исключали дублирующие последовательности (в том числе мутантные аллельные варианты). Найдены актуальные версии ряда последовательностей, обновленных в базах данных.

 

Рис. 1. Распределение найденных последовательностей по уровню сходства (Score) с усредненным рецептором вазотоцина. Пунктиром показано пороговое значение для дальнейшего анализа

 

У всех изученных видов млекопитающих выявлены четыре белка-рецептора семейства вазопрессина и окситоцина: V_1a (AVPR1A), V_1b (AVPR1B), V₂ (AVPR2) и рецептор окситоцина (ОXTR). Исключение составили три случая. Во-первых, среди последовательностей P. abelii, отобранных по уровню Score, не найден V₂-рецептор. Просмотр результатов поиска выявил последовательность XP_009233694.1 (Score = 144.7) – фрагмент V₂-рецептора. В базе данных NCBI найдена ее обновленная версия XP_024096521.1. Во-вторых, V₂-рецептор не найден в протеоме M. domestica. Ручной поиск в базе NCBI также не выявил рецептор вазопрессина данного подтипа у этого вида опоссумов, но найден белок, аннотированный как фрагмент V₂-рецептора у D. virginiana. В-третьих, у R. norvegicus обнаружены две аминокислотные последовательности, аннотированные как V_1b-рецептор вазопрессина (NP_001276729.1 и NP_058901.3).

Наиболее сходными с белками-рецепторами семейства вазопрессина у всех изученных видов оказались рецепторы нейропептида S (NPSR1) и гонадотропин-рилизинг гормона (GNRHR). Аминокислотные последовательности этих белков включены в построение филограмм наряду со всеми найденными последовательностями рецепторов вазопрессина и окситоцина. Обозначения и номера аминокислотных последовательностей белков, использованных для построения филограмм, приведены в табл. 2. Построение филограммы (рис. 2) показало, что все последовательности с индексом Score выше 200 четко разделились на четыре клады, соответствующие рецепторам вазопрессина V_1a, V_1b и V₂-подтипов и рецептору окситоцина. Отдельные клады, сестринские по отношению к V₂-рецепторам, сформировали рецепторы нейропептида S и гонадотропин-рилизинг гормона. Анализ опубликованной ранее последовательности кДНК «вазотоцинового» рецептора мыши (GenBank: AK033957) [15], а также предсказанной по ней структуры белка показал их соответствие нуклеотидной и аминокислотной последовательностям рецептора нейропептида S. На рис. 3 представлены результаты множественного выравнивания последовательностей рецепторов вазопрессина, окситоцина и рецептора нейропептида S крысы. Показано, что по аминокислотной последовательности рецепторы вазопрессина и окситоцина идентичны друг другу примерно на 50%: V_1a-рецептор имеет 54% гомологии с V_1b-рецептором, 51% – с окситоциновым и 46% – с V₂-рецептором. Рецептор нейропептида S имеет меньшее сходство с рецепторами вазопрессина (с V_1a – 33, с V_1b – 33, с V₂ – 30%) и окситоцина (32%), он содержит радикальные замены в лигандсвязывающих участках (рис. 3).

 

Рис. 2. Филограмма аминокислотных последовательностей рецепторов вазопрессина, окситоцина, нейропептида S и гонадотропин-рилизинг гормона у млекопитающих

 

Рис. 3. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей рецепторов вазопрессина, окситоцина и нейропептида S крысы. Серой заливкой выделены трансмембранные домены 1–7, рамкой обведены участки связывания рецептора с лигандами

 

Таблица 2. Идентификаторы нуклеотидных последовательностей мРНК и аминокислотных последовательностей белков-рецепторов млекопитающих, схожих с рецептором вазотоцина позвоночных

Вид	Белок	мРНК	Обозначение на филограммах
Homo sapiens	NP_000697.1	NM_000706.4	Avpr1a_Homo
	NP_000698.1	NM_000707.4	Avpr1b_Homo
	NP_000907.2	NM_000916.3	Oxtr_Homo
	NP_000045.1	NM_000054.4	Avpr2_Homo
	NP_997055.1	NM_207172.1	Npsr1A_Homo
	NP_001287864.1	NM_001300933.1	Npsr1G_Homo
	NP_997056.1	NM_207173.1	Npsr1B_Homo
	NP_000397.1	NM_000406.2	Gnrhr_Homo
Pan troglodytes	XP_016778615.1	XM_016923126.2	Avpr1a_Pan
	XP_525039.2	XM_525039.6	Avpr1b_Pan
	XP_001144020.1	XM_001144020.5	Oxtr_Pan
	XP_001145732.2	XM_009439827.2	Avpr2_Pan
	XP_024213409.1	XM_024357641.1	Npsr1_Pan
	XP_526608.1	XM_526608.5	Gnrhr_Pan
Pongo abelii	XP_002823515.2	XM_002823469.3	Avpr1a_Pongo
	XP_002813528.1	XM_002813482.3	Oxtr_Pongo
	XP_024089895.1	XM_024234127.1	Avpr1b_Pongo
	XP_024096521.1	XM_024240753.1	Avpr2_Pongo
	XP_002818110.2	XM_002818064.3	Npsr1_Pongo
	XP_024101999.1	XM_024246231.1	Gnrhr_Pongo
Nomascus leucogenys	XP_003252777.1*	XM_003252729.3	Avpr1a_Nleu
	XP_003272998.1	XM_003272950.3	Avpr1b_Nleu
	XP_012357682.1	XM_012502228.1	Oxtr_Nleu
	XP_003279348.1	XM_003279300.2	Avpr2_Nleu
	XP_003279243.1	XM_003279195.2	Npsr1_Nleu
	XP_003268473.1	XM_003268425.1	Gnrhr_Nleu
Canis lupus familiaris	NP_001185587.1	NM_001198658.1	Avpr1a_Canis
	NP_001185588.1	NM_001198659.1	Oxtr_Canis
	XP_545695.2	XM_545695.3	Avpr1b_Canis
	NP_001003177.1	NM_001003177.1	Avpr2_Canis
	XP_022283280.1	XM_022427572.1	Npsr1_Canis
	NP_001003121.1	NM_001003121.1	Gnrhr_Canis
Rattus norvegicus	NP_444178.2	NM_053019.2	Avpr1a_Rat
	NP_058901.3	NM_017205.3	Avpr1b_Rat
	NP_001276729.1	NM_001289800.1	Avpr1b_Rat
	NP_037003.2	NM_012871.3	Oxtr_Rat
	NP_062009.1	NM_019136.1	Avpr2_Rat
	NP_001100278.1	NM_001106808.1	Npsr1_Rat
	NP_112300.2	NM_031038.3	Gnrhr_Rat
Mus musculus	NP_058543.2	NM_016847.2	Avpr1a_Mus
	NP_036054.1	NM_011924.2	Avpr1b_Mus
	NP_001074616.1	NM_001081147.1	Oxtr_Mus
	NP_062277.1	NM_019404.2	Avpr2_Mus
	NP_783609.1	NM_175678.3	Npsr1_Mus
	NP_034453.1	NM_010323.2	Gnrhr_Mus
Monodelphis domestica	XP_001372716.1	XM_001372679.3	Avpr1a_MonDom
	XP_001372263.1	XM_001372226.2	Avpr1b_MonDom
	XP_016279957.1	XM_016424471.1	Oxtr_MonDom
	XP_001365641.2	XM_001365604.4	Npsr1_MonDom
	XP_001362289.1	XM_001362252.2	Gnrhr_MonDom
Ornithorhynchus anatinus	XP_001520677.1	XM_001520627.2	Avpr1a_OrnAnat
	XP_007660695.1	XM_007662505.1	Oxtr_OrnAnat
	XP_007663815.1	XM_001520222.2	Avpr2_OrnAnat
	XP_007658276.1*	XM_007660086.1	Avpr1b_OrnAnat
	XP_016082441.1* #	XM_016226955.1	Npsr1_OrnAnat
	NP_001116830.1	NM_001123358.1	Gnrhr_OrnAnat

Примечание: * – неполная последовательность, ^# – не обнаружена при автоматическом поиске, добавлена вручную из базы NCBI.

 

В транскриптомах 9 видов млекопитающих проведен поиск нуклеотидных последовательностей, сходных с транскриптом гена рецептора вазотоцина. Выявленные таким образом мРНК полностью соответствовали белкам, обнаруженным на предшествующем этапе исследования в протеоме. У R. norvegicus найдены две разные последовательности мРНК, кодирующие рецептор вазопрессина V_1b-подтипа: NM_017205.3 и NM_001289800.1. У M. domestica, как и при поиске по протеому, не найдена последовательность, соответствующая V₂-рецептору. Наиболее близкими к нуклеотидной последовательности мРНК рецептора вазотоцина оказались мРНК рецепторов гонадотропин-рилизинг гормона и нейропептида S. Обозначения и номера нуклеотидных последовательностей, использованных для построения филограмм, приведены в табл. 2. На рис. 4 представлена филограмма мРНК рецепторов семейства вазопрессина, которая в целом оказалась сходной с филограммой белков. В геноме крысы выявлено пять локусов, сходных с геном рецептора вазотоцина (табл. 3). Обнаружена дупликация гена V_1b-рецептора на длинном плече хромосомы 13 (рис. 5). Белки, кодируемые этими генами, полностью идентичны.

 

Рис. 4. Филограмма нуклеотидных последовательностей мРНК рецепторов вазопрессина, окситоцина, нейропептида S и гонадотропин-рилизинг гормона у млекопитающих

 

Рис. 5. Дупликация гена V_1b-рецептора в хромосоме 13 у крысы Rattus norvegicus (Chr 13 (NC_005112.4): 48 358 720 – 48 406 569)

 

Таблица 3. Результаты поиска генов, сходных с нуклеотидной последовательностью рецептора вазотоцина, в геноме крысы Rattus norvegicus

Score	Хромосома (нить)	Начало – конец гена, п.н.	ID транскрипта	ID белка	Длина белка, а.о.
Avpr1a (ID гена – ENSRNOG00000004400)
852.5	7(–)	67341080-67345308	ENSRNOT 00000005829	ENSRNOP 00000005829	424
LOC100909648 (ID гена – ENSRNOG00000049261)
500.8	13(–)	48390417-48400632	ENSRNOT 00000074204	ENSRNOP 00000067252	421
Avpr1b (ID гена – ENSRNOG00000048522)
500.5	13(+)	48367307-48378831	ENSRNOT 00000074512	ENSRNOP 00000064689	421
Oxtr (ID гена – ENSRNOG00000005806)
464.3	4(–)	144403358-144416116	ENSRNOT 00000007724	ENSRNOP 00000007724	388
Avpr2 (ID гена – ENSRNOG00000059862)
238.2	X(–)	156889410-156891213	ENSRNOT 00000091495	ENSRNOP 00000071931	371

 

Физиологические эффекты вазопрессина и окситоцина на почки крыс

В опытах на крысах показано, что эффект вазопрессина на экскрецию ионов натрия, калия или реабсорбцию осмотически свободной воды зависит от дозы гормона. Этот нонапептид вводили животным на фоне водной нагрузки, которая на время угнетала секрецию вазопрессина нейрогипофизом. Инъекция вазопрессина в дозе 0.005 нмоль на 100 г м.т. оказала антидиуретическое действие. Несмотря на водную нагрузку, моча животных была осмотически концентрированной (осмоляльность составила 546 ± 31 мОсм/кг H₂O; 89 ± 14 мОсм/кг H₂O в группе без вазопрессина), происходила реабсорбция осмотически свободной воды в канальцах почек (рис. 6). Экскреция ионов калия была такой же, как в контроле, а выведение ионов натрия уменьшилось вдвое, т.е. вазопрессин в этой дозе оказал антинатрийуретическое действие (рис. 6). Повышение дозы вазопрессина в 3 раза (до 0.015 нмоль на 100 г м.т.) привело к росту реабсорбции осмотически свободной воды, а выведение натрия было таким же, как в контрольной группе. Действие гормона в этой дозе вызывало усиление экскреции ионов калия на 130% (рис. 6), т.е. приводило к селективному калийурезу. При повышении дозы до 0.15 нмоль на 100 г м.т. вазопрессин не только усиливал реабсорбцию осмотически свободной воды, но и повышал выведение одновалентных катионов. При этом наблюдался рост экскреции ионов калия и натрия с преобладанием выведения ионов натрия (рис. 6).

 

Рис. 6. Влияние внутримышечного введения различных доз вазопрессина на фоне водной нагрузки у крыс на экскрецию почками ионов натрия, калия и реабсорбцию осмотически свободной воды. * – значимость отличий (p < 0.05) от контроля (0 нмоль/100 г м.т.)

 

Введение в таких же физиологических условиях окситоцина (0.005 и 0.015 нмоль на 100 г м.т.) привело к усилению диуреза, селективному натрийурезу и уменьшению реабсорбции осмотически свободной воды (рис. 7). Экскреция ионов калия не отличалась от экскреции в контроле. Повышение дозы окситоцина до 0.15 нмоль на 100 г м.т. привело к антидиуретическому эффекту, росту реабсорбции осмотически свободной воды, наряду с ростом экскреции ионов натрия отмечался подъем выведения ионов калия. Экскреция ионов натрия при действии окситоцина была ниже, чем после введения вазопрессина в той же дозе (рис. 6, 7).

 

Рис. 7. Влияние внутримышечного введения различных доз окситоцина на фоне водной нагрузки у крыс на экскрецию почками ионов натрия, калия и реабсорбцию осмотически свободной воды. * – значимость отличий (p < 0.05) от контроля (0 нмоль/100 г м.т.)

 

Селективный V_1a-агонист воспроизвел натрийуретический эффект вазопрессина, при этом экскреция натрия усилилась в значительно большей степени, чем при действии гормона (рис. 8). Блокада V_1a-рецепторов полностью препятствовала развитию индуцированного вазопрессином натрийуреза; окситоциновый антагонист не вызывал такого эффекта (рис. 8). При действии окситоцина и агониста его рецепторов в отличие от V_1a-агониста усиление экскреции натрия сопровождалось усилением образования осмотически свободной воды (рис. 9).

 

Рис. 8. Сопоставление действия вазопрессина и V_1a-агониста (V_1a-аг) в дозе 0.15 нмоль/100 г м.т. на экскрецию натрия и эффект антагонистов V_1a-рецепторов (V_1a-ант) и рецепторов окситоцина (O-ант) на натрийуретическое действие вазопрессина у крыс, получивших водную нагрузку (ВН). Значимость отличий (p < 0.05): * – от ВН, $ – от ВН + вазопрессин

 

Рис. 9. Сопоставление действия агонистов V_1a-рецепторов (V_1a-аг) и рецепторов окситоцина (O-аг) в дозе 0.015 нмоль/100 г м.т. на фоне водной нагрузки (ВН) на экскрецию натрия почками и клиренс осмотически свободной воды (C_H2O) у крыс. * – значимость отличий (p < 0.05) от ВН

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В крупноклеточных нейронах гипоталамуса синтезируются различные нонапептиды, которые секретируются в кровь в нейрогипофизе. У большинства млекопитающих это вазопрессин и окситоцин, в то время как у позвоночных других классов – вазотоцин и мезотоцин [4, 21]. Эффекты нонапептидов опосредуются рецепторами, входящими в семейство мембранных G-связанных рецепторов. Согласно современным представлениям, у позвоночных произошли три последовательных дупликации генов рецепторов вазопрессин- и окситоцин-подобных пептидов. Данные, полученные при изучении круглоротых и хрящевых рыб, позволяют предположить, что у челюстноротых позвоночных было как минимум шесть разных генов, кодирующих рецепторы гормонов семейства вазопрессина: пять подтипов вазопрессиновых (вазотоциновых) рецепторов (V_1a, V_1b, V_2a, V_2b, V_2c) и один подтип рецептора окситоцина (у разных животных он называется окситоциновым, изотоциновым или мезотоциновым в зависимости от гормона окситоцинового ряда) [22]. V_2b-рецептор пока описан только у рыб, V_2c-рецептор обнаружен у всех позвоночных, кроме млекопитающих (у сумчатых в виде псевдогена). Передача сигнала рецепторами данного семейства происходит при участии фосфолипазы С, инозитолтрифосфата и кальция. Исключением является V_2a-рецептор, который активирует аденилатциклазу и стимулирует образование сАМР в качестве вторичного посредника.

В поисках ответа на вопрос о молекулярных механизмах полифункциональности вазопрессина и окситоцина проведен поиск их рецепторов у млекопитающих, сходных по аминокислотной и нуклеотидной последовательности с рецептором вазотоцина других позвоночных. Данные настоящей работы подтвердили, что в геноме крыс имеются гены трех подтипов V-рецепторов – V_1a, V_1b, и V₂, и один ген рецептора окситоцина. Следующим, наиболее близким к ним по структуре белком является рецептор нейропептида S. Учитывая низкую степень гомологии с другими рецепторами вазопрессина и окситоцина, особенно лигандсвязывающих участков, маловероятным представляется его участие в реализации эффектов вазопрессина и окситоцина в почке, хотя это требует отдельной экспериментальной проверки. Выявленные в данной работе различия в действии возрастающих доз вазопрессина (рис. 6), а также во влиянии вазотоцина и его аналогов [12] на экскрецию одновалентных катионов и реабсорбцию воды в почке крыс могут быть связаны с различиями в спектрах активации трех существующих подтипов V-рецепторов. Это предположение подтверждается результатами нашей работы, а также более ранними исследованиями с применением агонистов и антагонистов V-рецепторов [12]. Наиболее хорошо изучен механизм антидиуретического и антинатрийуретического эффектов вазопрессина, направленных на обеспечение осмотического концентрирования мочи. V₂-рецепторы активируются уже при низких концентрациях вазопрессина в крови, повышают проницаемость собирательных трубок для воды и активность транспортеров натрия в дистальных отделах нефрона [5, 23]. По-видимому, при повышении концентрации вазопрессина наряду с V₂-рецепторами активируются V_1b- и V_1a-рецепторы и изменяется экскреция ионов натрия и калия. Ранее было показано, что агонист V_1b-рецепторов усиливает экскрецию калия [24], а стимуляция V_1a-рецепторов угнетает реабсорбцию натрия в толстом восходящем отделе петли Генле [10, 12, 13, 25] и приводит к натрийурезу. Нами показано, что натрийуретическое действие вазопрессина полностью устраняется антагонистом V_1a-рецепторов. V_1a-агонист, лишенный V₂-активности, в значительно большей степени усиливает экскрецию натрия, чем вазопрессин, активирующий все подтипы V-рецепторов. Соотношение вовлечения подтипов V-рецепторов в физиологический ответ почки на введение вазопрессина в разных дозах может зависеть от различий в плотности рецепторов в мембранах канальцевых клеток нефронов и от разного сродства рецепторов к гормону. Различными методами показано присутствие в почке всех подтипов рецепторов вазопрессина и окситоцина (AVPR2 > AVPR1A > ОXTR > AVPR1B) [26], экспрессия V₂-рецептора значительно превышает экспрессию всех остальных подтипов рецепторов этого семейства [27]. Для активации V_1a-рецепторов у крысы требуется в 100 раз более высокая концентрация вазопрессина, чем для передачи сигнала через V₂-рецепторы [28].

Более сложным представляется обсуждение механизма действия окситоцина в почке. В разных дозах этот нонапептид вызывает противоположные эффекты (рис. 7): в низкой дозе увеличивает выведение осмотически свободной воды и ионов натрия, а в высокой – усиливает реабсорбцию осмотически свободной воды и экскрецию ионов калия при повышении натрийуретического эффекта. Анализ протеома, транскриптома и генома крысы не выявил подтипов рецептора окситоцина, поэтому механизм физиологического эффекта следует объяснять, исходя из существования рецептора одного типа. Согласно анализу мРНК, кодирующей рецептор окситоцина [27, 29], этот рецептор наиболее представлен в проксимальном отделе нефрона. Известно, что снижение реабсорбции натрия в проксимальном канальце создает условия для увеличения клиренса осмотически свободной воды [11]. Этот эффект наблюдали при изучении механизма действия ингибиторов карбоангидразы [30] и глюкагоноподобного пептида-1 в почке [10]. Выполненные ранее эксперименты показали, что окситоцин [11] вызывает уменьшение реабсорбции жидкости в проксимальном канальце, вследствие чего больший объем жидкости поступает в последующие отделы нефрона. Так как на фоне водной нагрузки прекращается секреция вазопрессина нейрогипофизом, увеличение под действием окситоцина объема жидкости, поступающей в дистальный сегмент нефрона, способствует росту клиренса осмотически свободной воды. Нами показано, что усиление экскреции натрия и воды под действием окситоцина воспроизводится при введении селективного агониста рецепторов окситоцина. Кроме того, полученные данные указывают на различия в механизмах натрийуреза, вызванного окситоцином и вазопрессином – рост экскреции натрия обусловлен снижением реабсорбции натрия в проксимальном и дистальном отделах нефрона при активации рецепторов окситоцина и V_1a-рецепторов соответственно. Эффекты, наблюдающиеся при введении высокой дозы окситоцина (0.15 нмоль/100 г м.т.), аналогичны описанным для вазопрессина и, вероятно, связаны с действием нонапептида на рецепторы вазопрессина. В отличие от окситоцина селективный агонист рецепторов окситоцина в этой дозе не оказывает антидиуретического действия.

ВЫВОДЫ

1. Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей в протеомах и транскриптомах 9 видов млекопитающих выявил три подтипа рецепторов вазопрессина и один рецептор окситоцина.
2. При исследовании генома крысы методами биоинформатики выявлены гены, кодирующие четыре подтипа рецепторов к нонапептидам семейства вазопрессина и окситоцина (Avpr1a, Avpr1b, Avpr2, Oxtr).
3. В экспериментах на ненаркотизированных крысах, получавших водную нагрузку в объеме 2 мл на 100 г м.т., установлены три эффекта вазопрессина в почке: 1) увеличение реабсорбции осмотически свободной воды, 2) возрастание экскреции ионов калия, 3) снижение реабсорбции ионов натрия. Обосновано предположение об обусловленности этих эффектов селективной стимуляцией V_1a-, V_1b- и V₂-рецепторов в почке соответственно.
4. В экспериментах на ненаркотизированных крысах с водной нагрузкой показаны два эффекта окситоцина в почке: 1) снижение реабсорбции воды, 2) усиление экскреции натрия. Обсуждены возможные физиологические механизмы их реализации при участии одного подтипа рецептора окситоцина.
5. В зависимости от действующей концентрации гормонов нейрогипофиза изменяется спектр активируемых подтипов рецепторов и преобладающий эффект на функции почек, что обеспечивает точную регуляцию водно-солевого гомеостаза.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (грант № 18-15-00358).

Об авторах

Анна Вячеславовна Кутина

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: kutina_anna@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

А. А. Макашов

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: kutina_anna@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Е. В. Балботкина

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: kutina_anna@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Т. А. Каравашкина

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: kutina_anna@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Ю. В. Наточин

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: kutina_anna@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы