Структура генома клинических изолятов Mycoplasma hominis, устойчивых к ципрофлоксацину

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Mycoplasma hominis – один из наиболее распространенных представителей класса Mollicutes, характеризуется отсутствием ригидной клеточной стенки, способностью к персистенции на мембране клеток эукариот, малым размером генома, генетическим и клеточным полиморфизмом, ограниченностью метаболических путей, устойчивостью к антибактериальным препаратам, действие которых направлено на ингибирование биосинтеза клеточной стенки [1].

Известно, что штаммы M. hominis колонизируют преимущественно органы урогенитального тракта женщин и мужчин как в норме, так и при воспалительных процессах (уретрит, цервицит, вагинит, бактериальный вагиноз и др.). Доказана способность M. hominis колонизировать верхние дыхательные пути новорожденных и вызывать респираторные инфекции [1, 2].

Полученные за последние годы данные литературы свидетельствуют об увеличении частоты выявления урогенитальных микоплазм, резистентных к препаратам фторхинолонового ряда и макролидам, наиболее часто применяемым в терапии воспалительных заболеваний органов малого таза [3–5]. Мониторинг антибиотикорезистентности бактерий, в том числе M. hominis, – возбудителей репродуктивно-значимых инфекций, представляет важную медико-биологическую проблему, решение которой связано с изучением основ патогенности, резистентности и адаптации микоплазм к стрессовым условиям среды. Современные молекулярно-генетические технологии, в частности NGS-секвенирование, позволили приблизиться к пониманию этих процессов. Полная нуклеотидная последовательность генома M. hominis (M. hominis ATCC 23114 номер GenBank FP236530.1) была впервые секвенирована и расшифрована группой французских ученых под руководством S. Pereyre в 2009 г. [6]. В настоящее время в международной базе данных GenBank представлена информация о полногеномных последовательностях 23 штаммов M. hominis. Следует отметить, что изучение эволюционного разнообразия популяции M. hominis как в Российской Федерации, так и за рубежом сопряжено с трудностями, связанными с отсутствием информации об особенностях организации их генома, включая факторы патогенности и резистентности.

В нашей работе проанализирована структура генома ципрофлоксацин-резистентных клинических изолятов M. hominis, выделенных от женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Нами изучены три клинических изолята M. hominis (М45, М57, МН1866), выделенных из соскобов эпителия цервикального канала женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, от которых получено письменное информированное согласие на участие в исследовании. Обнаружение, идентификацию, определение антибиотикограммы микоплазм осуществляли с использованием коммерческих жидких дифференциально-диагностических сред производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора (РУ № ФСР 2008/03366). Все штаммы, включенные в исследование, обладали устойчивостью к ципрофлоксацину. Результаты многолетнего микробиологического мониторинга распространенности и антибиотикорезистентности урогенитальных микоплазм, выделенных от женщин и мужчин как здоровых, так и с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, опубликованы ранее [7–10]. ДНК выделяли и очищали с использованием набора АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва). Полногеномное секвенирование проводили на секвенаторе MiSeq (Illumina, США). Концентрацию ДНК в образцах определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, Австрия). Подготовку библиотеки ДНК для секвенирования осуществляли с использованием набора Nextera XT (Illumina), секвенирование проводили с использованием набора MiSeq reagent kit v2 (Illumina) на 500 циклов. В качестве референсной была выбрана полногеномная последовательность штамма M. hominis АТСС 23114 (GenBank FP236530.1). Нуклеотидные последовательности выравнивали с использованием встроенного программного обеспечения секвенатора MiSeq (Isis version 2.6.2.3). Полученные данные визуализировали и анализировали с помощью программного обеспечения UGENE Unipro [11] и MEGA 7.0 [12]. Аннотацию генома проводили с использованием сервера RAST (Rapid Annotationusing Subsystem Technology) [13] и NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/). Филогенетический анализ полногеномных последовательностей проводили с использованием web-сервиса REALPHY [14] Online tool версия 1.12 (https://realphy.unibas.ch/fcgi/realphy). В анализ включены все полные нуклеотидные последовательности геномов M. hominis, депонированные в базу данных RefSeq NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq). Построение филогенетических деревьев осуществляли методом ближайшего соседа (Neighbor-Joining) [15] с использованием программного обеспечения MEGA 7.0 [12].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полные нуклеотидные последовательности геномов M. hominis депонированы в международную базу данных GenBank NCBI под номерами MRAY00000000 (M. hominis М45), MRAX00000000 (M. hominis М57) и QOKO00000000 (M. hominis МН1866). Исходные архивы ридов доступны под номерами: SUB 6713744 (M. hominis М57), SUB 6713764 (M. hominis М45), SUB 6713769 (M. hominis МН1866). В результате секвенирования и сборки первичных прочтений получено от 18 (штамм МН1866) до 27 (штаммы М45, М57) контигов. Вероятнее всего, разрывы, обнаруженные при картировании геномов исследуемых изолятов M. hominis, связаны с отсутствием покрытия данного региона в исходном архиве ридов. Размер генома исследуемых штаммов варьировал от 633 286 п.н. (М57) до 642 227 п.н. (М45), доля GC составила 27.2%. Основные метрические показатели сборки генома M. hominis представлены в таблице.

 

Структурный анализ генома клинических изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866)

Характеристика	Изоляты M. hominis/ номер GenBank
	М45/ MRAY00000000	М57/ MRAX00000000	МН1866/ QOKO00000000	Референсный штамм АТСС 23114
Длина сборки, п.н.	642 227	633 286	639 787	665 445
Число контигов	27	27	18	1
Кратность покрытия	599, 4945	316, 929169	256, 2492	-
Число прочтений, млн	3.8	2.6	1.3	-
N50	33.392	49.675	57.877	665.445
L50	6	4	4	1
GC, %	27.2	27.2	27.2	27.1
Число генов/псевдогенов	592/28	589/30	581/16	598/12
Число белоккодирующих последовательностей	546	543	546	557
Число оперонов 16S-23S-5S	2	2	2	2

 

Анализ данных, полученных с помощью сервера RAST (Rapid Annotationusing Subsystem Technology), выявил у штамма M. hominis М57 543 белоккодирующих гена и 546 – как у штамма M. hominis М45, так и у МН1866. В структуре генома M. hominis МН1866 обнаружено 16 псевдогенов, 30 – у штамма M. hominis М57 и 28 – у M. hominis М45. Подавляющее большинство псевдогенов представлено неполными нуклеотидными последовательностями с неизвестной функцией. Однако у части псевдогенов M. hominis выявлены преждевременные стоп-кодоны (три у штамма M. hominis М57) и мутации сдвига рамки считывания (четыре у M. hominis МН1866, по две – M. hominis М45 и M. hominis М57). В геномах всех штаммов обнаружено по две копии оперона 16S-23S-5S рРНК.

Установлено, что геномы исследуемых штаммов M. hominis являются высокогомологичными, степень гомологии на уровне аминокислотных последовательностей составляет около 95% (рис. 1).

 

Рис. 1. Сравнительный анализ идентичности аминокислотных последовательностей штаммов M. hominis М45, М57 и МН1866. Результаты получены с помощью сервера RAST

 

Геномы всех трех штаммов имеют сходную структуру, поэтому на рис. 2 представлена диаграмма, отображающая распределение генов по функциям их продуктов, на примере изолята M. hominis МН1866.

 

Рис. 2. Диаграмма распределения генов по функциональным группам на примере штамма M. hominis МН1866. Изображение получено с помощью сервера RAST. Цифры от 1 до 27 – условные обозначения подсистем в структуре генома. В скобках указано количество генов в подсистеме / % (процент генов в общей структуре генома)

 

Показано, что функции подавляющего числа генов M. hominis связаны с синтезом белка (39.1%), ДНК (13%) и РНК (11.6%) (рис. 2). Система центрального углеводного обмена (доля генов составляет 6.9%) исследуемых штаммов является усеченной и состоит из отдельных компонентов, участвующих в метаболизме пирувата, пентозофосфатов (предшественников рибозы и дезоксирибозы), глюкозы и лактозы. Отмечено, что геном микоплазм содержит гены pdP, deoD, deoB и deoC, кодирующие катаболические ферменты: пиримидин-нуклеозидфосфорилазу, пурин-нуклеозидфосфорилазу, фосфопентомутазу и дезоксирибоальдолазу соответственно. Эти ферменты участвуют в катаболизме дезоксирибозы и дезоксинуклеозида. В качестве единственного источника углерода и энергии штаммы M. hominis могут использовать 2-дезокси-D-рибозильную часть 2’-дезоксирибонуклеозидов в результате каскада биохимических реакций ферментации дезоксирибозы. Наличие генов, кодирующих ферменты цикла пуриновых оснований – аргининдезаминазу (ArcA), орнитинтранскарбамилазу (ArgF) и карбаматкиназу (ArqC), позволяет микоплазмам получать энергию в форме АТР альтернативным путем – посредством деградации аргинина и орнитина [6]. Доля продуктов мембранного транспорта, как и ферментов, преобразующих пурины, составляет 3% от общей структуры генома.

У каждого исследуемого изолята микоплазм выявлены гены, кодирующие эффлюксные системы, участвующие в мембранном транспорте, а именно АВС-транспортеры (ATP-binding cassette superfamily) и белки семейства MATE (Multidrug and toxic compound extrusion family). Система АВС-транспортеров представлена структурными элементами, осуществляющими транспорт олигопептидов через мембрану бактериальной клетки, а именно, тремя копиями гена oppB (кодирует транспортные белки – пермеазы OopB) и одной копией гена oppС (кодирует пермеазу OopС). Работа эффлюксных насосов системы МАТЕ обеспечивается электрохимическим градиентом ионов натрия (Na⁺) [16]. Полная последовательность гена, кодирующего белки семейства МАТЕ, в каждом анализируемом штамме микоплазм составила 1809 п.н.

Как уже сказано, исследуемые штаммы M. hominis (М45, М57, МН1866) характеризуются устойчивостью к ципрофлоксацину. Поиск мутаций, определяющих устойчивость к фторхинолонам, проводили путем анализа QRDR-области в генах, кодирующих топоизомеразы – gyrA и gyrB (субъединицы ДНК-гиразы), parС и parЕ (субъединицы топоизомеразы IV). Детальная характеристика генов gyrA, gyrB, parС и parЕ у изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 приведена в ранее опубликованной работе [16]. Установлено, что резистентность изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 к ципрофлоксацину связана с заменой серина (Ser) на лейцин (Leu) в позиции 83 А-субъединицы ДНК-гиразы [16]. Определено, что гены gyrA, gyrB, parС и parЕ изолята МН1866 содержат большое количество нуклеотидных полиморфизмов. Так, в гене gyrА обнаружено 47 точечных замен, в gyrB – 10, в parС – 45, в parЕ – 19. Показано, что устойчивость M. hominis МН1866 к ципрофлоксацину обусловлена мутацией в QRDR-участке гена parС, приводящей к замене лизина (Lys) на аргинин (Arg) в позиции 144 большой субъединицы топоизомеразы IV (рис. 3).

Значимые замены в QRDR-области генов gyrA, gyrB и parЕ у M. hominis МН1866 нами не обнаружены.

 

Рис. 3. Выравнивание аминокислотной последовательности А-субъединиц топоизомеразы IV клинического изолята M. hominis МН1866 и референсного штамма M. hominis АТСС 23114 (PG21). Красным цветом выделена замена лизина (К) на аргинин (R) в позиции 144

 

Дендрограмма полной нуклеотидной последовательности генома штаммов M. hominis (М45, М57, МН1866) относительно геномов M. hominis, депонированных в базу данных GenBank, представлена на рис. 4.

 

Рис. 4. Дендрограмма полных нуклеотидных последовательностей генома штаммов M. hominis, депонированных в международной базе данных GenBank/NCBI. *Выделен клинический изолят M. hominis М45, наиболее удаленный от других российских изолятов

 

Результаты филогенетического анализа показали, что изолят M. hominis М45 занимает обособленное положение относительно российских изолятов микоплазм и представляет отдельную филогенетическую ветвь. Изолят M. hominis MH1866 генетически близок к M. hominis МН1817 и формирует с ним единый кластер. Штамм M. hominis М57 выделен в отдельную ветвь среди основной группы российских изолятов микоплазм.

ОБСУЖДЕНИЕ

Современные молекулярные методы позволяют понять, как функционирует один из самых малых по размеру геномов прокариот – геном M. hominis, а также оценить его эволюцию. Впервые полная структура генома M. hominis ATCC 23114 (GenBank FP236530.1) длиной 665 445 п.н. была расшифрована группой французских ученых под руководством S. Pereyre в 2009 г. [6]. В настоящее время (на 23 августа 2019 г.) в базе данных GenBank/NCBI доступна информация о полной структуре геномов семи штаммов M. hominis и неполных геномах 16 штаммов в виде контигов (пять штаммов) и скаффолдов (11 штаммов). Размер генома исследуемых изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866) оказался меньше, чем у геномов микоплазм, депонированных в GenBank/NCBI. Однако результаты биоинформатического анализа, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что основные характеристики (количество генов, псевдогенов, РНК, белоккодирующих последовательностей) генома штаммов M. hominis (М45, М57, МН1866) и референсного штамма M. hominis ATCC 23114 являются одинаковыми. Следует отметить, что полученные нами данные соответствуют информации о других представителях вида M. hominis, представленной в NCBI Genome (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/3075?).

Биоинформатический анализ структуры генома M. hominis (М45, М57, МН1866) выявил большое число псевдогенов. Известно, что псевдогены рассматриваются в качестве резерва последовательностей, которые рекомбинируют с функциональными паралогичными генами, и таким образом создают их генетическое разнообразие [17]. Отмечено, что количество псевдогенов в геноме изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 в 2 раза превышало аналогичные показатели у референсного штамма. Вероятно, что множественные псевдогены микоплазм обеспечивают ассортимент последовательностей, необходимый для создания генетического разнообразия поверхностных антигенов [17].

Филогенетические взаимоотношения между изученными штаммами и штаммами, геномы которых депонированы в GenBank, оценивали на основе сравнения однонуклеотидных полиморфизмов. Данные филогенетического анализа свидетельствуют о генетической гетерогенности исследуемых ципрофлоксацин-резистентных изолятов M. hominis. Однако сравнительный анализ с использованием сервера RAST [13] выявил высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей белков штаммов микоплазм. Большое количество точечных мутаций в геноме M. hominis обусловливает их высокую генетическую пластичность и склонность к быстрой эволюции.

Преобладание в геноме M. hominis генов, кодирующих белки с катаболическими функциями, подтверждает ограниченность биохимических возможностей микоплазм. Импорт питательных веществ в клетку микоплазм из клеток хозяина происходит преимущественно при помощи транспортных белков [1], менее специфичных, чем аналогичные белки других бактерий. Транспортные белки микоплазм выполняют несколько функций. Так, белки OopB и OopС, входящие в систему АВС-транспортеров, участвуют не только в транспорте олигопептидов, но и в выведении лекарственных препаратов из бактериальной клетки [18]. При характеристике неспецифического механизма устойчивости M. hominis (М45, М57, МН1866) к фторхинолонам следует отметить, что геном каждого исследуемого изолята содержит одну копию гена, кодирующего белки множественной лекарственной резистентности MATE. В состав этого гена входят гомологичные последовательности генов norM и mepA Staphylococcus aureus, которые, как доказано, участвуют в удалении катионных антибактериальных препаратов из бактериальной клетки [19].

Установлено, что молекулярный механизм устойчивости анализируемых клинических изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866) к фторхинолонам обусловлен нуклеотидными заменами в генах gyrA (Ser83Leu) и parC (Lys144Arg), приводящих к изменению первичной структуры больших субъединиц ДНК-гиразы и топоизомеразы IV. Такой механизм описан у ряда классических бактерий (E. coli, Streptococcus spp, Staphylococcus spp.) [20]. Многочисленные однонуклеотидные замены в генах gyrA, gyrB, parC и parЕ изолятов M. hominis являются причиной высокого генетического полиморфизма и играют ведущую роль в формировании антибиотикорезистентности, что согласуется с данными [21–23].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного нами исследования выявлено сходство в организации геномов ципрофлоксацин-резистентных клинических изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866) и референсного штамма M. hominis ATCC 23114 (GenBank FP236530.1). Установлено преобладание в геноме генов, кодирующих белки, участвующие в катаболических процессах, что подтверждает ранее предложенную теорию об ограниченности биосинтетических возможностей M. hominis [1, 6]. В геноме изученных нами клинических изолятов микоплазм обнаружено большое количество нуклеотидных замен, не затрагивающих первичную структуру белка, что свидетельствует об их внутривидовом генетическом и эволюционном разнообразии. Отсутствие у изученных штаммов детерминант резистентности с конъюгативным механизмом передачи объясняет доминирование классического молекулярного механизма устойчивости микоплазм к фторхинолонам (ципрофлоксацину), а именно, мутаций в области QRDR генов gyrA и parC. Вероятно, обнаруженные нами гены, кодирующие белки системы MATE, в определенных условиях могут обусловливать процессы выведения антибактериальных препаратов из клеток M. hominis. Проведение подобных исследований необходимо как для понимания эволюции M. hominis, так и для оценки структуры генома популяции урогенитальных микоплазм в целом.

Об авторах

Елена А. Колесникова

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: shmelevael@yandex.ru
Россия, Нижний Новгород

Нина Ф. Бруснигина

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: shmelevael@yandex.ru
Россия, Нижний Новгород

Мария А. Махова

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: shmelevael@yandex.ru
Россия, Нижний Новгород

Анна Е. Алексеева

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: shmelevael@yandex.ru
Россия, Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы