Катехоламины в слезной жидкости как маркеры болезни Паркинсона: клиническое и экспериментальное исследование

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Болезнь Паркинсона (БП) - распространенное нейродегенеративное заболевание, которое характеризуется, в частности, гибелью дофаминергических нейронов нигростриатной системы мозга. Клинически БП проявляется через много лет после начала патологического процесса при гибели большей части дофаминергических нейронов черной субстанции, что объясняет существующие ограничения фармакотерапии заболевания [1]. Отсюда следует, что важнейшей задачей является разработка ранней (доклинической) диагностики БП, которая позволит выявить заболевание до появления первых двигательных симптомов и использовать превентивную нейропротекторную терапию [1]. В последнее время все большее внимание уделяется изучению изменений зрения при БП и приводящих к этому патологических процессов в глазу и вспомогательном аппарате глаза как потенциальных источников периферических биомаркеров БП [2]. Важную роль играет нарушение метаболизма катехоламинов, которые обеспечивают передачу зрительной информации в сетчатке, регулируют скорость аккомодации и внутриглазное давление [2]. Кроме того, при БП изменениям подвергается и ткань век, содержащая многочисленные железы, секреторный продукт которых входит в состав слезной жидкости. Конъюнктива, выстилающая внутреннюю поверхность век, и находящиеся в ней железы имеют симпатическую иннервацию [3], дисфункция которой отмечается при БП в рамках мультисистемной дегенерации, затрагивающей как центральные, так и периферические отделы автономной нервной системы [4]. Сбор слезной жидкости - это несложная неинвазивная процедура, в отличие от взятия крови или ликвора, которые традиционно используются для поиска периферических биомаркеров [5]. Тем не менее, поиску биомаркеров БП в слезе посвящены лишь единичные работы, причем в них анализируется только белковый состав слезы. Так, показано, что в слезной жидкости больных с БП повышается уровень фактора некроза опухоли [6], увеличивается концентрация олигомерного α-синуклеина [7] и меняется протеомный профиль в целом [8]. Эти исследования указывают на перспективность поиска биомаркеров БП в слезе. Однако имеет смысл анализировать не только белки, но и низкомолекулярные вещества, вовлеченные в патогенез БП, в частности катехоламины, которые активно изучают в качестве потенциальных биомаркеров БП в крови и ликворе [9]. Следует подчеркнуть, что нет данных, согласно которым биомаркеры, обнаруженные у пациентов с диагностированной клинической стадией БП, могут использоваться на доклинической стадии этого заболевания [1]. Поэтому нами проведен сравнительный анализ изменения концентрации катехоламинов в слезной жидкости нелеченых больных с ранней стадией БП и у животных при моделировании доклинической и клинической стадий этого заболевания. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Пациенты с БП и контрольная группа Анализировали пробы слезной жидкости, взятые у 26 пациентов с диагнозом БП на 1-2 стадиях по Hoehn-Yahr до начала противопаркинсонической терапии и у лиц сходного возраста без двигательных нарушений. Все пациенты дали письменное согласие на проведение исследования. Диагноз БП был поставлен в соответствии с клиническими диагностическими критериями Международного общества изучения двигательных расстройств 2015 года (MDS-2015). В контрольную группу вошли индивиды того же возраста без неврологических болезней. В исследование не включали пациентов с офтальмологическими заболеваниями. Ключевые клинические характеристики когорт представлены в табл. 1. Сбор слезной жидкости проводили утром с помощью стерильной фильтровальной бумаги (шириной 5 мм), которую закладывали за нижнее веко, как при проведении теста Ширмера. Слезную жидкость собирали путем естественной сорбции на тест-полоску в отсутствие стимуляции слезотечения в течение 5 мин. Длину намокшей части полоски измеряли для расчета объема пробы, после чего помещали полоски в пробирки с 0.1 н. HClO4, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°C. Животные В работе использовали 30 мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 2-2.5 месяцев и массой 22-26 г (питомник «Пущино»). Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. Для моделирования БП на доклинической стадии проводили двукратное подкожное введение 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) (Sigma, США) в разовой дозе 8 мг/кг. Для моделирования БП на клинической стадии подкожно вводили МФТП 4 раза в дозе 10 мг/кг. Интервал между инъекциями в обоих случаях составлял 2 ч [10]. Контрольная группа получала 0.9% NaCl по аналогичной схеме. Через 2 недели после введения МФТП или 0.9% NaCl оценивали состояние мышей по показателю пройденного пути в тесте «открытое поле» с помощью установки для анализа поведения животных PhenoMaster (TSE Systems, Германия). Далее у животных, находящихся под изофлурановым наркозом, собирали слезную жидкость с помощью полосок из фильтровальной бумаги шириной 2.5 мм, аналогичных полоскам Ширмера. После сбора слезной жидкости анестезированных мышей декапитировали, из мозга выделяли дорсальный стриатум согласно ранее описанной методике [10]. Пробы стриатума взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Концентрацию катехоламинов (норадреналин, адреналин и дофамин) измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД). Пробы гомогенизировали с помощью ультразвукового гомогенизатора Labsonic M (Sartorius, Франция) в 200 мкл 0.1 н. HClO4 (Sigma, США), содержащих внутренний стандарт 3,4-дигидроксибензиламин (ДГБА, Sigma) в концентрации 25 пмоль/мл, после чего центрифугировали (20 мин при 2000 g). ВЭЖХ проводили на обращенно-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3, 4 × 100 мм с диаметром пор 3 мкм (Dr. Majsch GMBH, Германия) при температуре +30°С и скорости подвижной фазы 1.2 мл/мин, поддерживаемой жидкостным хроматографом LC-20ADsp (Shimadzu, Япония) согласно [11]. Статистика Данные ВЭЖХ представлены в виде среднего в процентах от контроля ± стандартная ошибка среднего. Поскольку БП развивается асимметрично, в группе больных данные были перегруппированы на соответствующие ипсилатеральной стороне (пробы слезной жидкости, собранной из глаза на стороне начала и большей тяжести двигательных симптомов) и контралатеральной стороне (пробы, собранные на стороне, где двигательные симптомы отсутствовали или были выражены минимально). В контрольной группе и у экспериментальных животных данные, полученные при анализе слезной жидкости правого и левого глаза, усредняли. Нормальность данных проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистический анализ результатов проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента или непараметрического критерия Манна-Уитни в программном пакете GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, США). Критерием значимости считали р ≤ 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В этой работе впервые измерена концентрация катехоламинов в слезной жидкости пациентов с БП до начала лечения. Показано, что уровень норадреналина и дофамина в слезной жидкости больных значительно выше, чем у здоровых лиц (контроль) того же возраста (рис. 1). Обнаружена отчетливая асимметрия: повышение концентрации норадреналина и дофамина в большей степени выражено на ипсилатеральной стороне, т.е. на стороне большей выраженности моторных симптомов, по сравнению с контралатеральной стороной. Поскольку нами не обнаружены статистически значимые различия в объеме собранных проб (данные не представлены), выявленную асимметрию в концентрации дофамина и норадреналина у пациентов с БП нельзя объяснить асимметричной гипокинезией мышц глаз с нарушением оттока слезной жидкости. Тем не менее, асимметрия в изменении содержания маркеров в слезе хорошо согласуется с представлениями об асимметричном характере развития БП. Так, при диагностировании БП на ранней клинической стадии пороговая деградация нигростриатной дофаминергической системы и моторные нарушения проявляются только с одной стороны [12]. Следует подчеркнуть, что асимметрия в составе слезы является первым наблюдением асимметричности развития БП за пределами нигростриатной системы [12]. В отличие от норадреналина и дофамина, уровень адреналина в слезной жидкости снижался как на ипси-, так и на контралатеральной стороне (рис. 1). Такая реакция похожа на выявленное ранее снижение содержания адреналина в плазме крови у больных с БП [9]. Следует отметить, что источник катехоламинов в слезной жидкости точно не установлен. При этом известно, что в кровь адреналин попадает из надпочечников, а норадреналин и дофамин - преимущественно из окончаний симпатических норадренергических нейронов [13]. Вероятно, обнаруженные в слезе катехоламины имеют такое же происхождение. Изменения концентрации катехоламинов в слезной жидкости больных БП потенциально могли бы использоваться для разработки ранней диагностики. Тем не менее, всегда существует риск того, что биомаркеры, выявленные у больных на клинической стадии, отсутствуют на доклинической стадии. В связи с этим, особую ценность приобретает экспериментальное моделирование БП, поскольку с его помощью можно воспроизвести обе стадии заболевания [1, 10]. Так, согласно созданной нами общей методологии, совпадение биомаркеров, обнаруженных у больных и у животных при моделировании клинической стадии БП, свидетельствует о корректном воспроизведении данных аспектов патогенеза этого заболевания (рис. 2). Некоторые из них можно считать биомаркерами доклинической стадии БП, если они выявляются и на модели доклинической стадии [9]. Важной особенностью БП является то, что для нее точно определен пороговый уровень нейродегенерации, после которого возникают двигательные симптомы: это гибель 50-60% тел дофаминергических нейронов в черной субстанции, потеря 70-80% аксонов дофаминергических нейронов в стриатуме и соответственно снижение уровня дофамина в стриатуме на 70-80% по сравнению с контролем [1]. Как следует из представленных результатов, через 2 недели после двукратного введения МФТП в дозе 8 мг/кг у мышей отсутствовали изменения в тесте «открытое поле», а уровень дофамина в стриатуме снизился на 65.6% (рис. 3). В свою очередь, у животных, получивших четыре инъекции по 10 мг/кг МФТП, показатель пройденного пути снизился почти в 2 раза, а уровень дофамина в стриатуме упал на 83.3% (рис. 3). Таким образом, воспроизведенные в данной работе модели доклинической и ранней клинической стадий БП у мышей полностью соответствуют описанным выше ключевым параметрам. Концентрация норадреналина в слезной жидкости мышей на модели доклинической стадии БП имела тенденцию (p < 0.15) к повышению на 57.6% и на 111% - на модели клинической стадии БП по сравнению с контролем (рис. 4). Уровень адреналина и дофамина был ниже порога чувствительности метода, что скорее всего связано с малым объемом собранных проб (1-2 мкл). Существуют способы стимулировать слезотечение у животных с помощью холиномиметиков [14], однако известно, что состав слезной жидкости при стимуляции значительно меняется [15]. Сравнение изменений в содержании норадреналина, адреналина и дофамина в слезной жидкости больных с БП и у мышей при моделировании БП выявило во всех трех случаях повышение концентрации норадреналина в сравнении с контролем (табл. 2). Таким образом, у больных с БП и у мышей на моделях доклинической и клинической стадий БП обнаружено повышение концентрации норадреналина в слезной жидкости, которое можно рассматривать как перспективный биомаркер для ранней диагностики БП.

Об авторах

А. Р. Ким

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: alexandrrkim@gmail.com
Россия

М. Р. Нодель

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет); Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Российский геронтологический научно-клинический центр

Email: alexandrrkim@gmail.com
Россия

Т. А. Павленко

Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца Минздрава России

Email: alexandrrkim@gmail.com
Россия

Н. Б. Чеснокова

Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца Минздрава России

Email: alexandrrkim@gmail.com
Россия

Н. Н. Яхно

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)

Email: alexandrrkim@gmail.com
Россия

М. В. Угрюмов

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: alexandrrkim@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы