Бактериофаг MS2 - средство доставки для таргетной химиотерапии солидных опухолей

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В последние годы усилия разработчиков противо опухолевых лекарств сконцентрированы на препа ратах направленного действия на основе как новых, так и уже известных цитостатиков [1]. Наиболее эффективным способом доставки считается ис пользование наноконтейнеров, модифицированных специфичными лигандами (липосом, мицелл, поли мерных наночастиц, вирусоподобных частиц, виру сов), заполняемых лекарственными соединениями [2]. Однако применение инновационных средств до ставки не решает проблему множественной лекар ственной устойчивости опухолей, способную свести на нет все усилия по повышению эффективности ле карственных соединений [3]. Показано, что ионы Tl+ обладают мощным цито токсическим действием и подавляют функциониро вание белковых насосов лекарственной устойчивости опухолевых клеток [4]. Включение Tl+ в «не проте кающий» наноразмерный контейнер, снабженный системой направленной доставки, позволит создать эффективное средство для разрушения опухолей при значительном снижении токсического воздей ствия Tl+ на организм в целом. В 1980-х гг. удалось наполнить Tl+ частицы вируса осповакцины [5]. Механизм наполнения заключался в образовании прочного соединения между Tl+ и вирусной РНК [6]. В качестве наноконтейнера нами был выбран бак териофаг MS2, способный размножаться только в клетках Escherichia coli, несущих F-пили и не яв ляющихся симбионтами либо патогенами человека [7]. Направленность доставки обеспечивали конъюга цией капсидных белков фага с пептидом (Gly)3-iRGD, содержащим фрагмент cycloSS-(CRGDKGPDC) (iRGD), ответственный за связывание с интегрина ми, локализованными преимущественно на внешних мембранах эндотелиоцитов вновь формируемой па тологической сосудистой сети солидных опухолей и на ряде опухолевых клеток [8]. В нашей работе проведена экспериментальная проверка эффектив ности наполненного Tl+ фага MS2 с адресным пепти дом в качестве потенциального противоопухолевого препарата. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Получение бактериофага MS2 описано в работе [9]. Количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл препарата фага определяли методом титрования в агаровых слоях. Пептид (Gly)3-iRGD получали методом ав томатического твердофазного синтеза исходя из 9-флуоренил(метоксикарбонил)-аминокислот (ChemPep, США) (синтезатор 433А, Applied Biosystems, метод FastMoc). Формирование S-S мостика проводили путем окисления I2 [10]. Пептид очищали ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка C18 Triart, 21 × 250 мм, 10.0 мкм, YMC, Швейцария, рабо чая станция Agilent 1100, Agilent, США) в градиен те концентрации CH3CN (BioSolve, Израиль) в воде в присутствии 0.1% уксусной кислоты. По данным аналитической ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка C18 Triart, 2.1 × 50 мм, 2.0 мкм (YMC), рабочая стан ция Agilent 1200) с УФ- и масс-спектрометрической детекцией чистота препарата пептида не ниже 95%. Конъюгацию пептида (Gly)3-iRGD с капсидными белками фага MS2 проводили с использованием го мобифункционального реагента диметиладипими дата (ДМАИ, Sigma, США) в молярном соотношении белок фага : пептид: ДМАИ 1 : 20 : 80 по методике [11]. Бактериофаг отделяли от избытка реагентов осаждением 25% раствором полиэтиленгликоля 6000 («Диа-М», Россия) с 1 М NaCl. Осажденный бактериофаг суспендировали в деионизованной воде. Заполнение бактериофага Tl+ проводили с исполь зованием TlNO3 (Sigma-Aldrich, США). Бактериофаг MS2, конъюгированный с пептидом (iRGD-MS2), в количестве 1011 БОЕ инкубировали в 3 мл 0.5 мкМ раствора TlNO3 (5 ч при 38оС) с последующим осаж дением, как указано выше, и диализом против фос фатно-солевого буфера (0.14 М NaCl, 0.01 M фосфат натрия, рН 7.4). Количество включенных в вирионы и присут ствующих в среде Tl+ определяли согласно [12]. Суспензию наполненных Tl+ частиц фага центрифу гировали в течение 10 мин при 5000 об/мин для уда ления осадка солей таллия, разводили 50 мМ бу фером трис-HCl, рН 9.0 до концентрации (условно) 108 БОЕ/мл, денатурировали нагреванием в течение 30 мин при +70оС с РНКазой в 0.05% SDS, затем ре гистрировали тушение флуоресценции (длины волн возбуждения - 340 нм, эмиссии - 465 нм, спектрофлуориметр UV-1900, Shimadzu, Япония) натриевой соли 1,3,6,8-пирентетрасульфоновой кислоты (BOC Sciences APP, США) ионами Tl+. По калибровочной кривой зависимости степени тушения флуоресцен ции 1,3,6,8-пирентетрасульфоновой кислоты от [Tl+] рассчитывали количество Tl+ в препарате фага. Количество Tl+ в буферном растворе после диализа определяли без предварительной денатурации. Цитотоксическое действие iRGD-MS2-Tl+ на клет ках в культуре исследовали на линиях MCF-7 (гормонзависимый рак молочной железы (РМЖ)) и МDA-MB-231 (гормоннезависимый РМЖ). Клетки культивировали в бессывороточной среде (MSC1 Pan BioTech) и в той же среде с 5% фетальной сы воротки телят. Препарат iRGD-MS2-Tl+ вносили в 10-кратных разведениях, начиная с концентрации 108 БОЕ/мл. В качестве контроля использовали пре парат iRGD-MS2 (фаг, конъюгированный с пептидом, без Tl+). Погибшие клетки подсчитывали после окра шивания Эвансом синим. Противоопухолевое действие препарата iRGDMS2- Tl+ тестировали на мышах nude c MCF-7- или МDA-MB-231-ксенографтами. Мышам внутрикож но вводили 105-106 клеток MCF-7 или МDA-MB-231, а через 14 дней мышам опытных групп в течение 10 дней 1 раз в день вводили внутрибрюшинно по 200 мкл суспензии, содержавшей iRGD-MS2-Tl+ в количе стве, соответствующем 108 БОЕ/кг, контрольным - iRGD-MS2, MS2-Tl+ или MS2-Tl+ + iRGD (в растворе, 2 мкг/кг) в таком же количестве и объеме раствора. В каждой опытной и контрольной группах было по 11 животных. Некротическую активность препарата определяли как отношение площади некротизирован ной ткани к общей площади опухоли через 12 дней по сле окончания введения препаратов фага по результа там анализа цифровых изображений гистологических срезов, сканированных на ScanScope CS2. Предварительное исследование острой токсич ности препарата iRGD-MS2-Tl+ проводили на 10 крысах (самках) WKY (Wistar-Kyoto) весом 200- 250 г. Крыс содержали в условиях 12-часового светового дня на стандартном лабораторном корме и воде ad libitum. Однократно внутрикожно вводили 108 БОЕ/животное в объеме 500 мкл. Регистрировали состояние животных в течение 3 недель с момента введения препарата. Эксперименты на животных проводили в со ответствии с Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных жи вотных, используемых при экспериментальных ис следованиях, и правилами надлежащей лаборатор ной практики (GLP) в РФ, утвержденных приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В результате инкубации бактериофага MS2 (как мо дифицированного, так и не модифицированного пеп тидом iRGD) в среде с TlNO3 получены препараты MS2, содержавшие Tl+ в количестве 2.0 × 10-9 г-экв таллия в расчете на 108 БОЕ. Количество Tl+ на 1 БОЕ составило 2.0 × 10-17 г-экв (≈4 фг на 1 БОЕ, т.е. 400 нг в 108 БОЕ). В буферном растворе, против которого диализовали наполненный таллием бактериофаг, Tl+ не обнаружен, что свидетельствует о его прочном связывании с РНК фага внутри частиц MS2. Как видно из рис. 1, в бессывороточной среде пре парат iRGD-MS2-Tl+ проявлял цитотоксическое действие на клетки и гормонзависимого, и гормон независимого РМЖ. В случае гормонзависимого РМЖ (клетки MCF-7) ED50 препарата iRGD-MS2-Tl+ составляла чуть менее 105 БОЕ/мл культуральной жидкости, а статистически значимое превышение цитотоксического эффекта препарата по сравнению с контролем наблюдалось вплоть до концентрации 10 БОЕ/мл. Клетки гормоннезависимого РМЖ МDAMB- 231 были более устойчивыми к действию препа рата: ЕD50 для этих клеток в бессывороточной среде составляла 106-107 БОЕ/мл, а статистически значи мое превышение цитотоксического эффекта препа рата над контролем наблюдалось до концентрации 104 БОЕ/мл. В среде с сывороткой цитотоксическое действие iRGD-MS2-Tl+ проявлялось намного слабее, что может свидетельствовать о конкуренции между компонентами сыворотки и частицами iRGD-MS2-Tl+ за проникновение в клетки. У мышей с ксенографтами MCF-7 и МDA-MB-231 через 12 дней после введения препарата iRGDMS2-Tl+ наблюдалось уменьшение объема опухоли по сравнению с контрольными группами животных (рис. 2). Гистохимически показано некротизирующее действие iRGD-MS2-Tl+ на соответствующие опухо ли. Из рис. 3 видно, что препарат iRGD-MS2-Tl+ вы зывал некроз ткани опухоли (р < 0.05) более эффек тивно, чем препараты фага с пептидом, но без Tl+, фага с Tl+, но без пептида, фага с Tl+ и с неконъюги рованным пептидом в растворе. Исследование острой токсичности препара та iRGD-MS2-Tl+ на крысах WKY (Wistar-Kyoto) показало, что однократное введение препара та iRGD-MS2-Tl+ в дозе 108 БОЕ/животное, т.е. 1.6-2.0 мкг Tl/кг, не привело к гибели ни одного жи вотного за 3 недели наблюдения. Не выявлено замет ных изменений в поведении животных. Суммарная доза Tl+, обеспечивающая достижение терапевтиче ского эффекта (4 мкг/кг), была меньше его LD50 (20 мг/кг) в 5000 раз. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Направленная доставка токсичного иона металла с помощью фагового дисплея на основе частиц iRGDMS2- Tl+ в сосудистую сеть опухолевой ткани вы зывает эффективный распад всей массы опухоли при значительном снижении вероятности токсиче ского воздействия на организм в целом. Это позволя ет рекомендовать iRGD-MS2-Tl+ к доклиническим исследованиям с целью создания лечебного препа рата для терапии рака молочной железы. Поскольку пептидный лиганд iRGD взаимодействует с интегри нами aνb3 и aνb5 на поверхности эндотелиоцитов пато логической сосудистой сети [8], этот препарат может быть эффективен и в отношении других солидных опухолей, в которых идет интенсивный патологиче ский неоангиогенез.

Об авторах

Е. Ф. Колесанова

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича

Автор, ответственный за переписку.
Email: ekaterina.kolesanova@ibmc.msk.ru
Россия

М. В. Мельникова

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича

Email: ekaterina.kolesanova@ibmc.msk.ru
Россия

Т. Н. Большакова

Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ekaterina.kolesanova@ibmc.msk.ru
Россия

Е. Ю. Рыбалкина

НИИ канцерогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ekaterina.kolesanova@ibmc.msk.ru
Россия

И. Г. Сивов

ООО «Биотехнология»

Email: ekaterina.kolesanova@ibmc.msk.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы