Новый кластер микроРНК, ответственный за репрограммирование к плюрипотентному состоянию

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Плюрипотентные стволовые клетки - это клетки, способные дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков. Одним из способов полу чения плюрипотентных стволовых клеток являет ся репрограммирование соматических клеток путем сверхэкспрессии факторов плюрипотентности Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc [1]. В результате получают так на зываемые индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), которые широко применяются для изучения процессов раннего развития и дифференцировки, мо делирования наследственных заболеваний, а также в качестве перспективного источника клеточных про изводных, используемых в регенеративной медици не. Механизмы, отвечающие за процесс репрограм мирования, хорошо изучены, известны изменения в экспрессии генов, организации хроматина и метабо лизме. Кроме того, в данном процессе участвуют ми кроРНК (мкРНК) - класс малых некодирующих РНК длиной от 18 до 23 нуклеотидов, осуществляющих посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов. мкРНК играют важную роль в регуляции множества процессов, включая развитие организма и диффе ренцировку клеток. В настоящее время обнаружено множество мкРНК, экспрессирующихся в плюрипо тентных стволовых клетках человека, мыши и кры сы. Наиболее изученные мкРНК, участвующие в про цессе репрограммирования, относятся к кластерам miR-290-295, miR-302-367 и семейству miR-200 [2]. При этом участие многих других мкРНК в репро граммировании клеток, а также их функции оста ются неизвестными. Ранее нами был проведен ана лиз экспрессии мкРНК в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК), ИПСК и эмбриональных фибробла стах крысы. В результате на X-хромосоме выявлен кластер мкРНК (начиная с miR-743a и до miR-465) с повышенным уровнем экспрессии в плюрипотент ных клетках по сравнению с фибробластами [3]. Кроме того, экспрессия некоторых мкРНК данного кластера снижается в ходе спонтанной дифференци ровки плюрипотентных клеток. Полученные данные позволили нам предположить, что эти мкРНК могут участвовать в процессах самообновления и поддер жания плюрипотентного состояния стволовых кле ток, а также в их репрограммировании. Для проверки участия данных мкРНК в процессе репрограммиро вания мы получили фибробласты крысы, несущие делецию участка генома, кодирующего изучаемые мкРНК. Делеция данного участка нарушает процесс репрограммирования к плюрипотентному состоянию, что свидетельствует в пользу участия этого кластера мкРНК либо некоторых его представителей в регуля ции этого процесса. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Направляющие РНК, фланкирующие целевой уча сток с мкРНК, подбирали с использованием он лайн платформы Benchling (https://benchling. com/crispr). В итоге выбраны следующие прото спейсеры: 5’-CTTAGTTAACAGATTAGGAC-3’ (PAM-TGG), 5’-TTGCTAGAGTAATACCAACT-3’ (PAM-TGG). Олигонуклеотиды встраивали в век тор pX-458-2sgRNA по сайтам BbsI и BsaI. Вектор pX-458-2sgRNA получен путем гидролиза эндону клеазами рестрикции XbaI и KpnI вектора pX333 (Addgene Plasmid #64073), выделения и очистки фрагмента размером 444 п.н. и встройке данного фрагмента в вектор pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) (Addgene Plasmid #48138), гидролизованный XbaI и KpnI. Фибробласты крысы культивировали при 37˚С и 5% CO2 в смеси сред DMEM и F12 (1 : 1) (Lonza) с до бавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco, США), GlutaMAX (Gibco), смеси 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco). Для получения делеции фибробласты (4 × 105) сам цов крысы электропорировали плазмидой pX-458- 2sgRNA (5 мкг) с клонированными направляющими РНК с помощью прибора Neon Transfection System (Invitrogen, США). На следующий день клетки со ртировали на приборе S3e Cell Sorter (Bio-Rad, США) и субклонировали в 96-луночные планшеты. Через 7-14 дней лунки просматривали под микроскопом и отбраковывали содержащие несколько островков роста, чтобы исключить поликлональные линии. Моноклональные линии размножали, выделяли ДНК и анализировали с помощью ПЦР и секвенирования по Сэнгеру. Последовательности праймеров приве дены в табл. 1. Для репрограммирования фибробласты (5 × 104) трансдуцировали двумя препаратами лентиви русов, кодирующих факторы плюрипотентности Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc и тетрациклиновый транс активатор. За 1 ч до трансдукции в среду добав ляли 4 мкг/мл полибрена (Sigma-Aldrich, США). Препараты лентивирусов получали с использова нием векторов TetO-FUW-OSKM (Addgene Plasmid #20321) и FUdeltaGW-rtTA (Addgene Plasmid #19780) и векторов, кодирующих белки, необходимые для упаковки вирусных частиц, psPAX2 (Addgene Plasmid #12260) и pMD2.G (Addgene Plasmid #12259), по протоколу, описанному ранее [4]. На следую щие сутки после трансдукции в среду добавляли 2 мкг/мл доксициклина (Sigma-Aldrich), на чет вертые сутки фибробласты пересаживали на слой митотически неактивных эмбриональных фибро бластов мыши и культивировали в среде N2B27, состоящей из смеси N2 (DMEM/F12 с добавкой N2) (Gibco) и B27 (Neurobasal с добавкой B27) (Gibco), а также GlutaMAX, смеси 100 ед./мл пеницилли на и 100 мкг/мл стрептомицина, 0.1 мМ 2-меркап тоэтанола (Sigma-Aldrich), 1000 ед./мл LIF мыши (StemRD), 1 мкМ PD0325901 (StemRD) и 3 мкМ CHIR99021 (StemRD). Репрограммирование проводи ли в трех повторностях. На 10-14 день репрограмми рования некоторые колонии частично механически пересаживали на отдельные ячейки для размноже ния и дальнейшего анализа, на 20 день окрашивали на щелочную фосфатазу (ЩФ) по протоколу, описан ному ранее [4]. Иммунофлуоресцентное окрашивание осущест вляли как описано ранее [4]. Для анализа исполь зовали следующие первичные антитела: SSEA1 (sc-21702, 1:25), Oct4 (sc-5279, 1:200) и Sox2 (sc-20088, 1:200) (Santa Cruz Biotechnology, США). Для визуа лизации использовали вторичные антитела к имму ноглобулинам кролика или мыши, конъюгированные с флуоресцентными красителями Alexa 488 и Alexa 568 (Life Technologies, США). РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) по протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использова нием 500 нг РНК, обратной транскриптазы M-MLV (Invitrogen) и Random Hexamer primers (Thermo Scientific, США). Полученную кДНК анализирова ли на приборе LightCycler480 (Roche, Швейцария) с использованием набора БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue («Биолабмикс», Россия). Реакцию ам плификации проводили при следующих условиях: 95˚С, 5 мин; 40 циклов - 95˚С, 15 с и 60˚С, 1 мин. Последовательности праймеров приведены в табл. 2. Поиск потенциальных мишеней проводили с ис пользованием программ TargetSpy v1.1 [5], miRanda v3.3a [6] и TargetScan v7.0 [7]. Выбирали только ге ны-мишени, предсказанные всеми тремя програм мами и имеющие пониженный уровень экспрессии в ЭСК и ИПСК крысы по сравнению с фибробласта ми. Данные об экспрессии мРНК получены ранее [8]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследованный нами кластер мкРНК локализуется в участке 37 длинного плеча Х-хромосомы и состоит из 14 мкРНК: miR-743a, miR-743b, miR-742, miR-883, miR-471, miR-3551, miR-741, miR-463, miR-880, miR- 878, miR-881, miR-871, miR-3580, miR-465 (рис. 1А). Гипотезу об участии данного кластера мкРНК в про цессе репрограммирования к плюрипотентному со стоянию мы проверяли с использованием нокаута этих мкРНК путем делеции участка генома, их ко дирующего. Делецию получали с помощью системы CRISPR/Cas9 с двумя направляющими РНК, флан кирующими делетируемый участок. В результате получены 94 субклонированные линии фибробла стов самцов крысы, из которых семь несли делецию целевого участка ДНК (рис. 1Б). Наличие делеции в субклонированных линиях проверяли методом ПЦР с использованием фланкирующих праймеров. Кроме того, проверяли присутствие транслокации делетируемого участка с использованием вложенных праймеров (рис. 1В). В некоторых линиях наличие делеции подтверждали секвенированием по Сэнгеру (рис. 1Г). Экспрессию экзогенных факторов плюрипотент ности активировали параллельно в линиях фибро бластов с делецией кластера мкРНК и в контрольной линии клеток, которую, во-первых, использовали для получения линий с нокаутом, а, во-вторых, элек тропорировали плазмидой pX-458-2sgRNA, не ко дирующей направляющие РНК. Эффективность ре программирования фибробластов с нокаутом мкРНК оказалась значимо ниже по сравнению с контрольной линией (рис. 2А). В ходе репрограммирования неко торые колонии как из контрольных, так и из экспе риментальных лунок механически частично пере саживали для дальнейшего анализа. Морфология клеток, полученных в контрольном эксперимен те, соответствует морфологии ЭСК крысы. Данные ИПСК-подобные клетки успешно культивируются, сохраняют морфологию и положительно окрашиваются на ЩФ после отмены экспрессии экзогенных факторов плюрипотентности (рис. 2Б). Они экс прессируют маркеры плюрипотентного состояния, что подтверждается иммунофлуоресцентным окра шиванием и ОТ-ПЦР в реальном времени (рис. 2В,Г). Клетки, полученные при репрограммировании фибробластов с нокаутом кластера мкРНК miR- 743a-miR-465, имеют эпителиальную морфологию, что говорит о прохождении начального этапа репро граммирования - мезенхимально-эпителиального перехода. Однако эти клетки в отличие от контроль ной линии образуют неплотные колонии. Процесс репрограммирования происходит не полностью, клетки гибнут в отсутствие доксициклина, что сви детельствует о зависимости от экспрессии экзоген ных факторов плюрипотентности. Стоит отметить, что клетки с нокаутом кластера miR-743a-miR-465 положительно окрашиваются на ЩФ и SSEA1, под тверждая прохождение начальных этапов репро граммирования плюрипотентности (рис. 2Б,В). В этих клетках наблюдается также экспрессия маркеров плюрипотентности, но ее уровень значительно ниже, чем в контрольной группе клеток (рис. 2Г). В число мишеней исследуемых мкРНК вхо дят гены сигнального пути TGF-β, ингибирование которого способствует репрограммированию [9]. Значительную долю составляют гены сигнального пути Wnt, ингибирование которого на ранних стади ях необходимо для успешного репрограммирования клеток [10]. Присутствуют также известные ингиби торы процесса репрограммирования Cdkn1a и Zeb1 [11, 12]. мкРНК играют важную роль в регуляции множе ства процессов, в том числе и в репрограммировании клеток к плюрипотентному состоянию. В настоящее время изучена лишь малая часть мкРНК, экспресси рующихся в плюрипотентных клетках и вовлечен ных в процесс репрограммирования. Появление си стем редактирования генома значительно ускорило прогресс в изучении функций как белоккодирующих генов, так и некодирующих РНК. В отличие от ин гибиторов мкРНК, основанных, например, на LNA олигонуклеотидах, система CRISPR/Cas9 позволяет добиться более специфичного и постоянного нокаута мкРНК. Кроме того, использование CRISPR/Cas9 де лает возможным нокаут целого кластера мкРНК. Исследованный кластер мкРНК расположен вбли зи белоккодирующего гена Slitrk2. Схожие кластеры мкРНК обнаружены у других видов млекопитающих, в том числе у мыши и человека [13]. Предполагается, что у разных видов эти кластеры мкРНК имеют общего предка, но значительные различия в после довательностях пре-мкРНК и seed-регионов сви детельствуют о быстрой эволюции этих мкРНК [13, 14]. Высокий уровень экспрессии данных кластеров мкРНК выявлен в семенниках мыши и человека, а их участие в регуляции сперматогенеза у мышей показано путем делеции некоторых из них [13-15]. Функционально подтверждено существование общих генов-мишеней у данных мкРНК мыши и человека, несмотря на различия в их нуклеотидных последо вательностях [14]. Стоит также отметить, что мкРНК данного кластера способны функционально ком пенсировать взаимное отсутствие [13]. В отличие от мыши, уровень экспрессии некоторых мкРНК у крысы, в частности mir-741, сравним в семенниках и плюрипотентных клетках, что может свидетель ствовать о видоспецифичных особенностях плюрипо тентных клеток крысы [3, 15]. Тем не менее, в огром ном пуле потенциальных генов-мишеней могут быть представлены общие гены, участвующие в процессе репрограммирования у разных видов. Таким обра зом, этот кластер мкРНК может принимать участие в репрограммировании не только клеток крысы, но это требует дальнейшего изучения. Нарушение процесса репрограммирования при де леции участка ДНК, содержащего кластер из 14 мкРНК (с miR-743a по miR-465), позволяет предпо ложить вовлеченность всех или некоторых из них в данный процесс. Стоит отметить, что делеция такого значительного по размеру района могла за тронуть либо неизвестные регуляторные элементы, либо неаннотированные гены. Тем не менее, наше исследование можно рассматривать как первый шаг в изучении данного кластера мкРНК в процессе ре программирования клеток к плюрипотентному со стоянию.

Об авторах

В. В. Шерстюк

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Национальный медицинский исследовательский центр им. академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения РФ; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет; Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

Г. И. Давлетшина

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Национальный медицинский исследовательский центр им. академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения РФ

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

Ю. В. Вяткин

Новосибирский национальный исследовательский государственный университет; ООО «АкадемДжин»; Институт Сен-Лорана

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

Д. Н. Штокало

ООО «АкадемДжин»; Институт Сен-Лорана; Институт систем информатики им. А.П. Ершова СО РАН

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

В. В. Власов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

С. М. Закиян

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Национальный медицинский исследовательский центр им. академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения РФ; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет; Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы