Изучение возможностей использования 2-галоген-замещенных ацетамидов в качестве ацильных доноров в реакциях, катализируемых пенициллинацилазами

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Бета-лактамные антибиотики являются наиболее широко используемыми антибактериальными пре паратами, к преимуществам которых можно отнести высокую клиническую эффективность и низкую ток сичность. Важное значение имеет также доступность антибиотиков этого класса, что обусловлено, в част ности, масштабным использованием биокаталитиче ских технологий для их получения. Однако проблемы, связанные с развитием резистентности патогенов, ограничивают срок использования разработанных препаратов и делают необходимым поиск новых про изводных. Одно из ключевых направлений создания более эффективных, так называемых полусинтетиче ских аналогов, - введение различных N-ацильных за местителей, ковалентно cвязанных с бета-лактамным ядром. Успешность этого процесса прямо связана с до ступностью, эффективностью и легкостью включения нового N-ацильного радикала в структуру целевого соединения. Важную роль в решении этого вопроса сыграла способность пенициллинацилаз катализиро вать эффективный перенос ацильных групп, в пер вую очередь, остатков D-фенилглицина и п-окси- D-фенилглицина, от их амидов и сложных эфиров на ядра пенициллинов и цефалоспоринов. Детальное исследование весьма сложной кинетики реакций ферментативного ацильного переноса в водной сре де на добавленные нуклеофилы позволило выявить основные факторы, от которых зависит эффектив ность процесса [1-3], и разработать методы биоката литического синтеза ампициллина, амоксициллина, цефалексина, цефаклора, цефоницида, цефпрозила в водной среде без применения экологически опас ных органических растворителей [4-11]. Дальнейшее развитие биокаталитических методов в значитель ной степени зависит от субстратной специфичности ферментов, способных катализировать перенос дру гих ацильных групп на ядра бета-лактамных соеди нений. В этой связи представляет интерес сочетание возможностей биокатализа и методов клик-химии, когда на первой стадии при помощи фермента синте зируется бета-лактамное соединение с N-ацильным радикалом, содержащим активированную группу, которая затем может служить основой для получе ния разнообразных новых производных. В качестве примера для иллюстрации подобного подхода можно привести синтез цефатиамидина - антибиотика, по пулярного на китайском фармацевтическом рынке. В данном случае активированная N-ацильная группа представляет собой остаток бромуксусной кислоты, после введения которой и последующего взаимодей ствия с N,N'-диизопропилтиомочевиной получается целевой антибиотик (рис. 1) [12, 13]. Варьируя структуру вводимого бокового радикала к ядру антибиотика, природу активированных групп и структуру химического соединения на завершаю щей стадии, можно разработать достаточно универ сальный путь получения широкого спектра потен циальных антибактериальных препаратов. Весьма вероятной проблемой при разработке такого подхо да могут быть следующие осложняющие факторы: модификация (инактивация) фермента при взаимо действии с активированными группами исходных субстратов и получаемых продуктов, спонтанное разрушение активированных групп в условиях про ведения биокаталитической стадии, поиск подходя щих ферментов, обладающих необходимой катали тической активностью в отношении синтетических неприродных субстратов. Цель данной работы состояла в изучении возмож ностей использования производных галоген-заме щенных уксусных кислот в качестве потенциальных ацильных доноров в реакциях, катализируемых пе нициллинацилазами из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis, характеристике их реакционной способности как субстратов в зависимости от природы активиру ющей группы, так и при инактивации ферментов. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Определение активности фермента по отношению к 2-галогенацетамидам Типичный эксперимент проводили следующим об разом: 2-галогенацетамид (200 мкмоль) растворя ли в 0.05 М фосфатном буфере, термостатировали при нужной температуре, доводили pH до 7.5 и начи нали реакцию добавлением аликвоты исходного кон центрированного раствора фермента, создавая кон центрацию активных центров пенициллинацилазы в реакционной смеси 25 мкМ. Общий объем реакцион ной смеси составлял 800 мкл, концентрация субстра та 0.25 М. Реакцию проводили в термостатируемой ячейке, поддерживая постоянные значения темпера туры и pH. Через определенные промежутки време ни отбирали пробы объемом 20 мкл и смешивали их с 980 мкл смеси ацетонитрила с дистиллированной водой (соотношение 2 : 1). Пробы центрифугировали в течение 5 мин при 13000 об/мин для удаления осад ка белка и анализировали с помощью обращенно фазовой ВЭЖХ. Условия анализа: скорость потока 0.7 мл/мин, элюент - ацетонитрил/вода (25 об.% аце тонитрила, 0.005 М фосфатный буфер pH 3), детек тирование 210 нм, колонка Kromasil Eternity 5-C18 4.6×250 мм, объем наносимой пробы 20 мкл. Степень разделения RS соответствующих амида и кислоты во всех случаях превышала 1.5. Времена удержания компонентов составляли: хлорацетамид 4.16 мин, хлоруксусная кислота 4.34 мин, бромацетамид 4.27 мин, бромуксусная кислота 4.73 мин, йодацетамид 4.31 мин, йодуксусная кислота 5.92 мин. Исследование зависимости скорости превращения хромогенного субстрата от концентрации 2-хлорацетамида Ингибирующее влияние хлорацетамида на катали тическую активность пенициллинацилазы изучали с использованием высокопроизводительного микро планшетного ридера CLARIOstar (BMG LABTECH). Типичный эксперимент выглядел следующим об разом: в 96-луночном планшете в ячейки по верти кальным столбцам добавляли аликвоты 1 мМ рас твора хромогенного субстрата NIPAB (семь столбцов различных концентраций NIPAB в диапазоне от 0.01 до 0.3 мМ; концентрация в рядах идентична), в ячей ки по горизонтальным рядам - аликвоты 700 мМ рас твора ингибитора (восемь рядов различных концен траций хлорацетамида в диапазоне от 0 до 400 мМ; концентрация в столбцах идентична), объем реак ционной смеси доводили до 216 мкл, добавляя не обходимый объем 0.1 М калий-фосфатного буфера pH 7.5. В этом же буфере были приготовлены раство ры всех реагентов. Реакцию начинали добавлением 20 мкл раствора фермента при помощи мультика нального дозатора, создавая концентрацию активных центров пенициллинацилазы в каждой ячейке 10 нМ. Значение температуры поддерживали на уровне 25°С. Активность определяли по накоплению хромо фора - п-нитро-м-карбоксианилина (λmax = 400 нм) в режиме работы прибора Absorbance/PlateMode при повышенной точности (количество вспышек на ячейку 30, время цикла 6 с, количество циклов 74) с периодическим перемешиванием (500 об/мин). Во избежание случайных ошибок, вызванных обра зованием локальных пузырьков воздуха, измерение оптической плотности проводили в режиме стати стического усреднения (функция well scan, усред нение по спирали). Потоковую регрессионную обра ботку данных проводили в программе MARS Data Analysis Software. Начальные скорости определяли по усредненному значению производной в пределах 10% конверсии NIPAB. Для определения константы ингибирования экспериментальные результаты ана лизировали в координатах Диксона. Изучение инактивации пенициллинацилазы под действием 2-галогенацетамидов Кинетику инактивации пенициллинацилазы из учали с использованием высокопроизводительно го микропланшетного ридера CLARIOstar (BMG LABTECH). Типичный эксперимент выглядел сле дующим образом: в 96-луночном планшете в ячейки по горизонтальным рядам добавляли аликвоты 1 М раствора галогенацетамида (восемь рядов различ ных концентраций в диапазоне от 0 до 470 мМ; кон центрация во всех 12 столбцах идентичная). Левую половину планшета использовали для изучения инактивации фермента под действием галогенаце тамида, правую - для изучения влияния на процесс инактивации фенилуксусной кислоты (ФУК) - вы сокоспецифичного ингибитора пенициллинацилазы; концентрация ФУК во всех ячейках правой поло вины планшета составляла 0.1 мМ. Объем реакци онной смеси в каждой ячейке доводили до 196 мкл, добавляя необходимый объем 0.1 М калий-фосфат ного буфера pH 7.5. При этом создавали по шесть идентичных по составу столбцов слева (без ФУК) и справа (с ФУК). Реакцию инактивации начинали одновременно в первом и седьмом столбцах добав лением 20 мкл исходного раствора фермента, что бы концентрация активных центров пенициллина цилазы в каждой ячейке составляла 10 нМ. Порции исходного раствора фермента последовательно до бавляли в каждый следующий столбец многоканаль ным дозатором через каждые 10 мин инкубирования. Значение температуры поддерживали на уровне 25°С. Для определения остаточной активности фер мента через 50 мин после начала первой инкубации во все ячейки одновременно добавляли 24 мкл 1 мМ раствора NIPAB, чтобы концентрация хромогенного субстрата в каждой ячейке составляла 0.1 мМ. Таким образом, время инкубации фермента с ингибитором в 1-м и 7-м столбцах составило 50 мин, в 6-м и 12-м столбцах - 1 мин. Остаточную активность сканиро вали как описано выше. Инактивация фермента про текала в соответствии с кинетикой реакции первого порядка, при анализе экспериментальных данных определяли константу инактивации фермента. Кинетику инактивации пенициллинацилазы при взаимодействии с 2-галогенацетамидами из учали также с использованием другой методики при разных температурах (4, 15 и 25°С) путем инку бирования раствора фермента (концентрация 3 нМ) в присутствии 100 мМ 2-галогенацетамида в 10 мМ калий-фосфатном буфере pH 7.5, содержащем 0.1 М KCl. Аликвоты реакционной смеси отбирали в опре деленные моменты времени и добавляли в термо статируемую кювету (25°С) с раствором NIPAB (кон центрация хромогенного субстрата 0.1 мМ в 10 мМ калий-фосфатном буфере pH 7.5, содержащем 0.1 М KCl). Остаточную активность измеряли на спектро фотометре Shimadzu UV 1800 при 400 нм. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выбор производных галоген-замещенных уксусных кислот в качестве потенциальных субстратов для исследования При выборе субстрата для ферментативной реак ции следует учитывать такие его свойства, как ста бильность, растворимость и удобство применения, что особенно важно при препаративном использо вании ацильных доноров. Решающими факторами при выборе амидов галоген-замещенных уксусных кислот для исследования в качестве потенциальных субстратов пенициллинацилаз были: более высокая растворимость и стабильность амидов по сравнению со сложными эфирами и, самое главное, лакриматор ное действие сложных эфиров. Так, например, пары этилового эфира бромуксусной кислоты чрезвычай но раздражающе действуют на слизистую оболоч ку глаз; препарат необходимо хранить в герметично закрытых сосудах и применять в открытой посуде только в хорошем вытяжном шкафу [14]. Изучение способности амида 2-галогенуксусной кислоты связываться в активном центре пенициллинацилаз Возможности потенциальных субстратов связывать ся в активном центре пенициллинацилазы изучали по их способности ингибировать активность фермен та по отношению к удобному хромогенному субстра ту. Типичный пример по влиянию 2-хлорацетамида на каталитическую активность пенициллинацилазы из E. coli показан на рис. 2. При исследовании зависи мости скорости превращения хромогенного субстра та NIPAB от концентрации ингибитора (2-хлорацета мида) было обнаружено конкурентное ингибирование и определено значение константы ингибирования 0.12±0.02 М (рис. 2). Показано, что амиды 2-галоген замещенных уксусных кислот обладают значитель но более низким (примерно на 4 порядка) сродством к активному центру пенициллинацилаз по сравне нию со специфическими субстратами этого фермен та. Тем не менее, благодаря хорошей растворимости этих субстратов можно использовать их высококон центрированные растворы и рассчитывать на про ведение реакции в условиях максимальной скорости ферментативной реакции. Изучение реакционной способности потенциальных ацильных доноров При исследовании взаимодействия амидов гало ген-замещенных уксусных кислот с пенициллинацилазами было обнаружено, что гидролиз этих суб стратов сопровождается инактивацией ферментов, наиболее ярко выраженной в случае йодацетамида и бромацетамида. Инактивация обоих ферментов была обусловлена связыванием галоген-замещенных ацетамидов в активном центре пенициллинацилаз и сопряжена с каталитической активностью, по скольку добавление фенилуксусной кислоты - из вестного конкурентного ингибитора пенициллинаци лаз, связывающегося в активном центре, подавляло инактивацию. Подобную инактивацию пенциллинацилазы из E. coli в ходе реакции ранее наблюдали при препаративном ферментативном синтезе пеп тидов D-фенилглицина [15]. Потеря активности фер мента в ходе превращения амидов галоген-замещен ных уксусных кислот протекала согласно кинетике реакции первого порядка, значения соответствую щих констант скоростей инактивации представлены в табл. 1. Инактивация фермента под действием йодацета мида в условиях рН-оптимума действия пеницил линацилазы из E. coli при 25°С протекала настолько быстро, что гидролиз субстрата успевал пройти все го на несколько процентов. В случае бромацетамида инактивация была медленнее, однако также дела ла практически невозможным использование такого ацильного донора в препаративном синтезе в этих условиях. Снизить скорость инактивации фермен та и негативное влияние этого процесса на каталитическое превращение ацильных доноров под дей ствием пенициллинацилаз удалось при понижении температуры (рис. 3). Так, при 4°C потеря активности фермента при превращении бромацетамида снижа ется более чем на порядок, что позволяет исполь зовать это соединение в качестве ацильного донора в реакциях, катализируемых пенициллинацилаза ми. При этом следует отметить, что каталитическая активность пенициллинацилазы из A. faecalis по от ношению к этой группе субстратов была существен но выше, чем у пенициллинацилазы из E. coli (см. табл. 2). ВЫВОДЫ Изучение возможностей использования амидов 2-галоген-замещенных уксусных кислот в качестве ацильных доноров в реакциях, катализируемых пе нициллинацилазами, выявило способность соедине ний этой группы инактивировать фермент в ходе ка талитического превращения. Наиболее эффективное инактивирующее действие проявляли йодацетамид и бромацетамид, однако негативное влияние побоч ной активности можно минимизировать при пониже нии температуры, когда каталитическая активность пенициллинацилаз к этим ацильным донорам оста ется достаточно высокой, а вклад инактивации фер мента в ходе реакции становится незначительным.

Об авторах

Н. В. Панин

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Автор, ответственный за переписку.
Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

М. В. Никулин

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

Е. С. Тюрин

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

В. В. Дробот

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

И. А. Морозова

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

В. К. Швядас

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы