Дифференциальный анти-ВИЧ-эффект нового препарата на основе гуминовых веществ в различных клетках-мишенях иммунной системы

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Клетки врожденного иммунитета, такие, как моно циты, макрофаги и дендритные клетки, представля ют собой первую линию защиты от патогенов [1-5], и они же являются клетками-мишенями для ВИЧ. Вирусной атаке подвергаются клетки, экспрессиру ющие мембранные молекулы CD4, CCR5 и CXCR4, находящиеся, в зависимости от пути проникновения инфекции, в слизистых оболочках, в крови или лим фоидных тканях. Эффективность инфицирования зависит как от уровня экспрессии поверхностных клеточных рецепторов, так и от штамма вируса [6, 7]. На высоком уровне вирус продуцируется главным образом в активированных во время острой инфек ции CD4+ Т-лимфоцитах [8]. Но и в покоящихся CD4+ клетках памяти обнаруживается и репликация ви руса, и провирусная ДНК в латентно интегрирован ном или преинтегрированном состоянии [9]. Клетки с интегрированным вирусным геномом представляют часть существующего длительное время резервуара инфекции в организме, где могут сохраняться до 4 лет [9]. Полагают, что покоящиеся CD4+ клетки памя ти подвергаются инфицированию в первую очередь и преимущественно R5-фенотипом вируса [10-12], что может быть связано с экспрессией интегрина LFA-1 [13]. Повышенная способность варианта R5 вируса к репликации может также объяснить их пре обладание во время острой или первичной инфекции [14]. В патогенетическом процессе ВИЧ-инфекции участвуют также антигенпрезентирующие клет ки - макрофаги и дендритные клетки [15-18], об ладающие ВИЧ-специфичными рецепторами, спо собные активно циркулировать в крови и проникать в различные лимфоидные и нелимфоидные ткани. Дендритные клетки - классические антигенпре зентирующие клетки с экстраординарной способ ностью распознавать и процессировать антиген [19]. Незрелые дендритные клетки обладают повышенной способностью к фагоцитозу, тогда как у зрелых кле ток увеличена способность продуцировать цитокины. При созревании в дендритных клетках экспрессия рецепторов CCR5 уменьшается, а CXCR4 увеличи вается, что может привести к инфицированию ви русами с обоими фенотипами [18]. Известно также, что клетки Лангерганса (дендритные клетки кожи) способны захватывать вирус с помощью лектина С-типа - лангерина, без продукции вируса. При со зревании дендритных клеток продукция вируса в них снижается в 10-100 раз по сравнению с про дукцией в незрелых клетках [17, 20]. Большинство исследователей считают, что дендритные клет ки не являются активными продуцентами вируса, но благодаря высокой способности к миграции их ос новная роль заключается в доставке вируса от сай тов проникновения к СD4+ Т-клеткам в лимфоидных тканях, что способствует быстрой диссеминации ви руса в организме. Макрофаги также проявляют чув ствительность к ВИЧ-инфекции [21, 22]. R5-вирусы, обладающие тропизмом к макрофагам, так же хоро шо реплицируются в макрофагах периферической крови, как и в СD4+ лимфоцитах [23]. Способность продуцировать вирус у макрофагов также различа ется. Часто при инфицировании макрофагов наблю дается низкая интенсивность продукции вируса, ко торый обнаруживается в секвестрированной форме во внутриклеточных вакуолях. Причина ограниче ния вирусной репликации может быть обусловлена внутриклеточными механизмами неспецифической защиты. Обычно R5-вирусы не проявляют цитопа тогенных свойств, но некоторые изоляты, особенно обнаруживаемые на поздних стадиях заболевания, размножаются в макрофагах до высоких титров и могут проявлять цитопатический эффект [24, 25]. Инфицированные макрофаги погибают преимуще ственно путем некроза. Весьма важно, что эти клет ки, участвующие в патогенетическом процессе, мо гут служить резервуаром для вируса, недоступного в виду отсутствия активной вирусной репродукции и синтеза вирусспецифических белков ни для анти ретровирусной терапии, ни для распознавания цито токсическими лимфоцитами иммунной системы. В целом, опубликованные данные свидетель ствуют о том, что пермиссивность иммунных клеток по отношению к ВИЧ во многом зависит от стадии созревания/дифференцировки и функ циональной поляризации. При этом может меняться и продукция цитокинов, и рецепторный репертуар. Индуцированное инфекцией истощение пула чув ствительных к вирусу иммунных клеток приводит в конечном итоге к негативному влиянию на форми рование дальнейшего иммунного ответа. Современный подход к оценке антивирусной ак тивности каждого нового препарата непременно включает исследования на основных клетках-мише нях, участниках патогенеза ВИЧ-инфекции, таких, как мононуклеары периферической крови, макрофа ги, дендритные клетки. Это позволяет получить ин формацию об эффективности исследуемого вещества в каждой популяции клеток и иметь представление о его возможности влиять на течение патогенетиче ского процесса, и, в конечном итоге, оптимизировать анти-ВИЧ-терапию. В настоящей работе исследована анти-ВИЧ активность нового препарата, представляющего собой солюбилизированную бутанольную фрак цию гуминовых веществ (СБФГ). Согласно масс спектрометрическим данным и элементному анали зу, содержание углерода и кислорода (% по массе) в данной фракции составляет порядка 52.7 и 37.1% соответственно при невысоком содержании азота и серы (4.3 и 2.1% соответственно) [26, 27]. Следует от метить, что элементный анализ гуминовых веществ, полученных из одного источника и с использовани ем одних и тех же методов выделения и фракциони рования, дает воспроизводимые значения. Данные ВЭЖХ показывают, что препарат характеризуется достаточно высоким содержанием гидрофобных аро матических фрагментов (74%), что также подтверж дено с помощью 13С-ЯМР. Атомное отношение Н/С составляет 0.8, О/С - 0.53 [28-30]. Известно, что гу миновые вещества образуются в результате распа да отмерших организмов и составляют один из са мых обширных резервуаров органического углерода. Препараты на основе гуминовых веществ, разра ботанные и изученные ранее, такие, как, например Олипифат, характеризуются как экологически чи стые и безопасные продукты, обладающие многими полезными свойствами. Они стимулируют гемопоэз, проявляют ранозаживляющую, иммуномодулиру ющую, антиоксидантную, а также противоопухоле вую, антибактериальную, противогрибковую и про тивовирусную активность [31-33]. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Получение препарата В качестве исходного сырья для получения гумино вых веществ использовали лигнинсодержащие ма териалы (твердые остатки переработки раститель ного сырья). Материалы подвергали окислительному щелочному гидролизу с последующим отделением жидкой фазы, ее подкислением, отделением получен ного осадка, его промывкой и сушкой. Полученный полупродукт подвергали экстракции этилацетатом. Далее проводили экстракцию полученного осадка н-бутанолом. Для выделения и солюбилизации биоло гически активных фракций, обладающих противови русной активностью, сухой остаток после испарения бутанола очищали многократным переосаждением из щелочного раствора добавлением концентриро ванной соляной кислоты. Стандартизацию фракций осуществляли по характерным полосам поглощения в инфракрасной области (наличие специфичных по лос поглощения в интервале от 2 до 10 мкм) и мо лекулярно-массовому распределению (максимум в области 7000 Да). Выход целевого продукта - со любилизированной бутанольной фракции гуминовых веществ (СБФГ) - составлял ~40%. Физико-химические методы исследования СБФГ Элементный состав. Образцы исследуемого соеди нения доводили до полного растворения при нагрева нии до 80-1000С в 2 мл азотной кислоты с добавлени ем нескольких капель пероксида водорода в течение 3 ч. Полученный раствор анализировали методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой на приборе ICAP-9000 (Thermo Jarrell Ash, США). ГХ-МС-анализ. Навеску СБФГ доводили до полного воздушно-сухого веса и обрабатывали 5 мл толуола в ультразвуковой бане. Экстракты отфильтровыва ли, сушили безводным сульфатом натрия и упари вали в токе азота. Часть проб подвергали метилиро ванию. Аликвотную часть образца анализировали с помощью ГХ-МС на комплексе, включающем га зовый хроматограф НР5890А, масс-спектрометр НР5988А и систему обработки данных НР59970С (Hewlett-Packard, США). Компоненты пробы иден тифицировали с помощью компьютерного поиска и библиотеки масс-спектров Wiley. ЯМР-спектроскопию выполняли с использованием прибора Bruker Avance 400 MHz NMR. Клеточные линии CEM-SS - перевиваемая иммортализованная линия, клонированная из Т4-лимфобластоидной клеточной линии человека путем адгезии с помощью поли-L лизина, обладающая повышенной способностью к вирус-индуцированному синцитиеобразованию и фузогенной активностью, широко использует ся для изучения ВИЧ и его ингибиторов (NIH AIDS Reagent Program № 776, США). Клетки культивиро вали в питательной среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 10% фетальной сыворотки (Sigma, США), 2 мM L-глутамина (Sigma, США). Мононуклеары периферической крови (МПК) вы деляли из обработанной антикоагулянтом (EDTA) цельной крови серонегативного донора путем седи ментационного разделения при центрифугирова нии в растворе фиколла (GE Healthcare Worldwide, США). Для заражения вирусом использовали сти мулированные митогеном МПК, полученные путем 3-4-дневного культивирования с 5 мкг/мл фито гемагглютинина (ФГА, Sigma, США). Зараженные клетки культивировали в среде RPMI-1640 c 10% фе тальной сыворотки, 100 мкг/мл гентамицина и 50 ЕД/ мл рекомбинантного интерлейкина-2 (IL-2, Sigma, США). Макрофаги (Мф) человека получали путем ад гезии моноцитов из пула МПК (концентрация 1-2 × 106 клеток/мл) после 2 ч инкубации при 370С с последующей дифференцировкой клеток в те чение 7-8 дней в присутствии 0.2 мкг/мл GM-CSF (Invitrogen, США) в ростовой среде указанного со става. Дендритные клетки (ДК) получали путем куль тивирования моноцитов человека в течение 7 дней в присутствии 20 нг/мл интерлейкина-4 (IL-4, Sigma, США) (фракция моноцитов выделена из МПК с по мощью MACS (magnetic cell separation system CD14+; Miltenyi Biotec., ФРГ)). Антигенпрезентирующая функция ДК и моноцитов протестирована путем оценки способности стимулировать аллогенную про лиферацию Т-клеток. TZM-bl - перевиваемая клеточная линия, полу ченная из клеток HeLa генно-инженерным путем, экспрессирующая CD4, CXCR4, CCR5 и содержа щая Tat-зависимый репортерный ген люциферазы под контролем длинных концевых повторов (LTR) ВИЧ-1 (NIH AIDS Reagent Program № 8129, США). 293T/17 - эпителиальные клетки почки челове ка, полученные из клеточной линии 293Т. Линия 293Т/17 характеризуется высокой способностью к трансфекции и используется для получения вы соких титров инфекционных ретровирусов (ATCC® CRL-11268). Вирусы. Клетки заражали следующими штаммами ВИЧ-1: ВИЧ-1/BRU - референсный штамм с фе нотипом X4 , активно реплицирующийся в Т-лимфобластоидных клеточных линиях, чувстви тельный к действию AZT (азидотимидин). ВИЧ-1/AR216 - выделенный от ВИЧ-инфицированного пациента клинический изолят X4 фенотипа, адаптированный к Т-клеточным линиям, обладающий высокой устойчивостью к AZT. ВИЧ-1/Ba-L - М-тропный штамм R5-фенотипа. ВИЧ-1/SF-162 - М-тропный штамм R5-фенотипа. ВИЧ-1/QH0 - М-тропный штамм R5-фенотипа, выделенный от пациента в Тринидад и Тобаго. Биологическую активность вирусных стоков оце нивали с помощью титрования по TCID50. Получение env-псевдовирусов ВИЧ-1 Псевдовирусы получали по описанной ранее мето дике [34]. Клетки 293Т/17 высевали в концентра ции 2 × 106 на флакон Т-75 в 20 мл среды DMEM. После инкубации в течение 24 ч клетки трансфи цировали 4 мкг плазмиды, экспрессирующей ген env, кодирующий белок оболочки соответствую щего подтипа ВИЧ-1, и 8 мкг плазмиды pSG3ΔEnv без гена env, несущей недостающие гены для сбор ки псевдовируса ВИЧ-1. Для трансфекции исполь зовали реагент Fugene 6 (Promega, США). После 4 ч инкубации среду для трансфекции заменяли свежей ростовой средой. Содержащие псевдови рус супернатанты собирали через 48 ч и хранили при -800С. Все плазмиды получены из международ ного репозитория по программе NIH AIDS Reagent Program. Антиретровирусный TZM-bl-анализ Анализ нейтрализации env-псевдовирусов прово дили с использованием клеток TZM-bl по методу Montefiori [35] - модифицированной версии Wei и соавт. [36]. Свежие трипсинизированные клетки засевали в 96-луночные планшеты в концентра ции 1 × 104 клеток/лунка в 100 мкл среды DMEM с 5 мкг/мл DEAE-декстрана. К клеткам добавляли различные разведения исследуемого соединения и инкубировали в течение 45-90 мин при 37°С. Далее клетки инокулировали 150000 RLU (относительные люминесцентные единицы) соответствующего псев довируса. После 48 ч инкубации клетки промывали средой и лизировали, а затем с помощью люминоме тра Victor X3 (Perkin Elmer) определяли количество люциферазы в сравнении с контролем. Значения 50% ингибирующей концентрации рассчитывали с помо щью GraphPad Prism 6 c использованием функции log (ингибитор) в сравнении с нормированным отве том. Оценка жизнеспособности клеток Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста, суть которого заключается в измерении способности живых клеток превращать хорошо рас творимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол- 2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в нераствори мые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана. Эффективность такого превращения отражает об щий уровень дегидрогеназной активности клеток и в известных пределах прямо пропорциональна концентрации живых клеток [37]. Согласно принятым критериям высокотоксичными считаются вещества, ТД50 которых составляет от 1 до 10 мкг/мл, токсичны ми - от 11 до 20 мкг/мл, от 21 до 50 мкг/мл умеренно токсичными, от 51 до 100 мкг/мл - слаботоксичными. Вещества с ТД50 более 100 мкг/мл относят к катего рии нетоксичных. Определение анти-ВИЧ-активности При исследовании антивирусной активности клет ки в течение 2 ч инкубировали при 37°С в 96-луноч ных планшетах (Corning, США) с СБФГ в различных концентрациях (10, 1, 0.1 и 0.01 мкг/мл) и затем за ражали вирусом с множественностью инфекции 100 TCID50 (Tissue Culture Infection Dose 50). После инку бации в течение 24 ч несвязавшийся вирус удаляли путем низкоскоростного центрифугирования план шета, а осадок клеток ресуспендировали в свежей ростовой среде. За развитием инфекции наблюдали в течение 5 сут, оценивая цитопатический эффект (цитолиз, образование синцития). Уровень ингиби рования инфекции оценивали методом иммунофер ментного анализа (ИФА) на основе моноклональных антител к коровому антигену р24 ВИЧ-1. Основной высококонсервативный коровый антиген р24 явля ется признанным маркером ВИЧ-инфекции. В рабо те мы использовали сертифицированные коммерче ские тест-системы Bio-Rad (США) и «Вектор-Бест» (Россия). Статистическая обработка результатов Экспериментальные данные получены в трех неза висимых повторностях, результаты рассчитывали как среднее значение ± стандартная ошибка средне го (SEM). Значимость различий между выборками оценивали с использованием теста Колмагорова- Смирнова, одностороннего теста ANOVA и по правки Бонферрони (Origin Pro 2016G, OriginLab Corporation) для экспериментов более чем с 2 под группами. Показатели полумаксимальной ингибиру ющей концентрации (ИД50) и 50% цитотоксической концентрации (ТД50) рассчитывали, исходя из кри вых доза-эффект c помощью программ Origin Pro 2016G Softwear и Sigma Plot 12.5 Softwear. Различия считали статистически значимыми при рассчитанной величине р < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика химического состава СБФГ Исследования элементного состава СБФГ выпол няли в двух параллельных повторах. Оказалось, что СБФГ - это полиэлементное вещество с повы шенным содержанием P и Na (6000 и 10 029 мкг/мл соответственно). Важно отметить практически пол ное отсутствие тяжелых металлов в исследуемом веществе. По данным ГХ-МС-анализа в составе СБФГ наи более представлены жирные и смоляные кислоты. Среди жирных кислот преобладают гексадекановая, октадеценовая и докозановая кислоты (по 1.2 мкг/г). В меньшей степени в СБФГ содержатся октадека новая, эйкозановая и тетракозановая кислоты (по 0.4 мкг/г). Среди смоляных кислот в анализируе мом образце обнаружены три компонента, относя щиеся к ряду C20H30O2 (1.6 мкг/г), из которых один компонент можно точно отнести к абиетиновой кис лоте (0.6 мкг/г). Остальные являются изомерными структурами в пределах данной брутто-формулы. Две другие смоляные кислоты имеют брутто-фор мулу: C20H28O2. Наиболее характерный пик на масс хроматограмме соответствовал дегидролевопимаро вой кислоте (18 мкг/г). С помощью ЯМР-спектроскопии фрагментный состав СБФГ был сопоставлен с составом гумино вых кислот угля (табл. 1). Содержания карбониль ных, карбоксильных и сложноэфирных фрагментов в СБФГ сходны с содержанием в гуминовых кисло тах угля. Содержание фенольных групп в СБФГ не много выше (11% против 7-9%). Традиционными яв ляются высокие показатели величины соотношений CCOO-H/CCOO-R и CAr-OH/CAr-OR, которые отображают сте пень гидролизованности структуры. Особенностью СБФГ является высокое содержание ароматических фрагментов, при этом ароматическая часть струк туры содержит большое количество незамещенных и О-замещенных фрагментов. Изучение цитотоксических свойств СБФГ Цитотоксические свойства СБФГ оценивали, куль тивируя клетки в присутствии различных концен траций этого вещества в течение 3-4 дней, с после дующим определением жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста. Исследование цитотоксичности в трех незави симых экспериментах показало, что СБФГ явля ется нетоксичным препаратом, причем как в от ношении перевиваемой Т-клеточной линии CEM-SS, так и в отношении первичных клеток (МПК) (табл. 2). ИД50 - 50% ингибирующая доза, при которой ин фекция подавляется на 50%; ТД50 - цитотоксическая доза, при которой 50% клеток утрачивают жизне способность; индекс селективности, рассчитывается как отношение ТД50 к ИД50. Значения R2 приведены для ИД50. Представлены средние данные, вычис ленные по результатам изучения цитотоксических свойств и антивирусной активности СБФГ в трех не зависимых экспериментах. Исследование антивирусной активности СБФГ на перевиваемых и первичных CD4+ Т-клетках, зараженных чувствительным и устойчивым штаммами ВИЧ-1 Результаты определения ингибирования экспе риментальной ВИЧ-инфекции свидетельствуют о том, что СБФГ способен эффективно подавлять инфекцию как AZT-чувствительного (HIV-1/BRU), так и AZT-резистентного штаммов вируса (HIV-1/ AR216) и в перевиваемых, и в первичных клетках (табл. 2). При этом для 50% подавления инфекции AZT-чувствительного штамма и в перевиваемых, и в первичных клетках требуется практически оди наковая концентрация препарата - менее 1 мкг/мл. Ингибирование инфекции AZT-резистентного штамма несколько отличается в разных клеточных культурах: эффективность СБФГ в большей сте пени проявляется в МПК, тогда как для снижения инфекции на 50% в клетках CEM-SS концентрация должна быть более высокой. Следует также отметить достаточно высокие значения индекса селективно сти (600-800), характеризующего перспективность исследуемого препарата, при использовании донор ских лимфоцитов (МПК). Эта клеточная модель бо лее предпочтительна, чем перевиваемые клеточные культуры. Ограниченное применение МПК в экспе риментальных исследованиях обусловлено рядом причин, основными из которых являются отсутствие стандартизации и вероятность индивидуальной устойчивости к ВИЧ-инфекции (во избежание по следней мы использовали для заражения смесь МПК от трех серонегативных доноров). Изучение антивирусных свойств СБФГ в МПК, макрофагах и дендритных клетках Дальнейшее исследование антивирусной активно сти СБФГ проводили на клетках МПК, макрофа гах (Мф) и дендритных клетках, которые заража ли М-тропными штаммами ВИЧ-1: ВИЧ-1/SF-162, ВИЧ-1/Ba-L и ВИЧ-1/QH0 (табл. 3). Проведенные исследования позволили оценить эффективность СБФГ в пулах разных иммунных клеток и получить данные, свидетельствующие о различной (дифференциальной) эффективности препарата в этих клетках. Наиболее чувствительной к действию СБФГ оказа лась инфекция в макрофагах, зараженных вариантом R5 ВИЧ-1/Ba-L: 90 и 50% ингибирование инфекции наблюдается при достаточно низких концентрациях препарата (табл. 3), тогда как для достижения того же уровня ингибирования инфекции в дендритных клет ках, зараженных тем же самым штаммом, требуются в 15-19 раз более высокие концентрации препарата. Как показали наши исследования, подавление ин фекции на 90% в МПК, зараженных штаммом SF-162 (фенотип R5), резистентным к нейтрализации анти телами, происходит в присутствии 6.0 мкг/мл СБФГ. Следует отметить, что почти такая же концентра ция препарата требовалась для 90% ингибирования штаммов ВИЧ-1 фенотипа X4 (табл. 2). Это наблюде ние подчеркивает универсальность СБФГ как анти- ВИЧ-агента в отношении вирусов обоих фенотипов (R5 и X4). Однако наши исследования показывают, что встречаются штаммы ВИЧ-1, проявляющие боль шую устойчивость к действию СБФГ. Так, для инги бирования штамма ВИЧ-1/QH0 требуется в 10 раз более высокая концентрация СБФГ в клетках МПК. Наиболее вероятным объяснением этого факта может быть наличие геномных различий у разных штаммов и предсуществующих мутаций, обусловленных есте ственным полиморфизмом ВИЧ-1. Несмотря на разницу в концентрациях, во всех вирус-клеточных системах при воздействии СБФГ достигается 90% подавление инфекции, что означает защиту существенной части клеток-мишеней, под вергающихся вирусной атаке. Обнаруженные раз личия в уровне ингибирования инфекции в разных пулах иммунных клеток, не зависящие от фенотипа вируса, говорят, вероятно, о различиях в биодоступ ности препарата. Неодинаковое проникновение ле карственных препаратов в различные клетки (тка ни) - давно известный факт. Следствием этого может быть концентрация препарата, недостаточная (су боптимальная) для ингибирования вируса. Неполное подавление репликации вируса приводит к возник новению условий, благоприятных для селективного отбора резистентных форм. Это необходимо учиты вать в доклинических исследованиях новых препа ратов и более детально изучать ингибиторы реплика ции вируса с использованием пулов индивидуальных иммунных клеток, участвующих в патогенезе ВИЧ. Известно, что при ВИЧ-инфекции наблюдается прогрессирующее уменьшение субпопуляций им мунных клеток, что неизбежно приводит к снижению функций иммунитета, среди которых можно выде лить наиболее существенные: антигенпрезентиру ющую, стимулирующую Т-клеточные пролифера тивные реакции, регулирующую выработку антител В-клетками. При этом снижается также скорость обновления клеточных популяций. Механизмы гибе ли иммунных клеток во время острой и хронической инфекции полностью не установлены, но известно, что они, скорее всего, включают прямое инфициро вание, апоптоз и действие ЦТЛ. Наши исследования показали возможность почти полного подавления ВИЧ-инфекции (более 90%) с помощью СБФГ, что оз начает возможность сохранения функциональности иммунной системы. Очень важным результатом дан ного исследования является также особенно высо кая эффективность СБФГ в ингибировании ВИЧ инфекции в макрофагах. Макрофаги, как и Т-клетки памяти, служат резервуарами вируса, наличие ко торых составляет главную причину невозможности полной эрадикации вируса и необходимости пожиз ненной анти-ВИЧ-терапии. Известно, что субпопуляция Т-хелперов фено типа 17 (Th17), продуцирующих интерлейкин-17, наиболее чувствительна к заражению ВИЧ и, как следствие, подвержена быстрому истощению [38]. Интерлейкин-17 играет ключевую роль в под держании непроницаемости слизистых кишечника [39]. Утрата IL-17 приводит к деструкции слизистого барьера и увеличению транслокации микробов, что, в свою очередь, приводит к ВИЧ-ассоциированной иммунной гиперактивации [40-43]. Новые знания об участии фенотипически различных, значимых для патогенеза ВИЧ-инфекции субпопуляций им мунных клеток, открывают новые возможности для оценки анти-ВИЧ-потенциала новых соедине ний. Исследование воспроизводимости анти-ВИЧ эффекта препарата СБФГ В исследовании эффективности СБФГ немаловаж но было понять, не изменяется ли эффективность препарата в сериях, полученных в разное время. Было проверено шесть серий и показано, что разные препараты действуют практически одинаково, до зозависимо ингибируя ВИЧ-инфекцию в сходных концентрациях с высоким индексом селективности в различных вирус-клеточных системах оценки и с различными вариантами ВИЧ-1: ВИЧ-1/BRU и TZM-bl-псевдовирус (табл. 4, 5 и рисунок). В трех независимых экспериментах по ингибиро ванию одноцикловой инфекции в клетках TZM-bl, за раженных псевдовирусами, env-последовательности которых соответствуют различным стадиям инфек ции/путям заражения и относятся к трем различ ным подтипам (A, B, C) и двум циркулирующим ре комбинантным формам ВИЧ-1, показано, что СБФГ активно ингибирует инфекцию. Экспрессионные векторы для получения псевдовирусов выбра ны из стандартной панели контрольных штаммов ВИЧ-1 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program; NIH ARRRP), которые используются в ка честве эталонных для оценки нейтрализующих ан тител и исследования анти-ВИЧ-активности соеди нений. При этом значения 50% ингибирующей дозы (ИД50) составляют: для Q769.d22 - 0.62-0.75 мкг/мл; для WITO4160.33 - 0.49-0.55 мкг/мл; для CE1176_ A3 - 0.95-1.13 мкг/мл; для 703357.c02 - 0.91-0.98 мкг/мл и для BJOX002000.03.2 - 0.99-1.19 мкг/мл (рисунок). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Обобщая полученные данные, можно сказать, что СБФГ эффективно ингибирует эксперименталь ную ВИЧ-инфекцию, обладает защитным эффек том против различных подтипов и циркулирующих рекомбинантных форм вируса. Надежность метода фракционирования, использованного для получения стандартизированных фракций гуминовых кислот, подтверждена экспериментами с шестью различны ми сериями препарата. На Международном съезде по гуминовым веще ствам в 1988 году ряд ученых предсказывали боль шое будущее соединениям гуминовой природы в ле чении разнообразных болезней [44]. К настоящему времени накоплено достаточно знаний об уникаль ных свойствах гуматов, обладающих противовос палительным и ранозаживляющим, противогрибко вым и бактерицидным, и даже противоопухолевым действием. Несмотря на такие уникальные свойства, нельзя сказать, что в последующие годы проводи лись масштабные научно-исследовательские иссле дования гуматов. В итоге лишь две компании (аме риканская и российская) создали лекарственные препараты на основе гуминовых веществ со всеми необходимыми доклиническими и клиническими ис пытаниями их безопасности и эффективности [30]. Данная работа дополняет имеющиеся знания тера певтических свойств таких уникальных природных соединений, как гуматы.

Об авторах

Г. В. Корнилаева

ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: andreysi93@yandex.ru
Россия

А. Э. Синявин

ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: andreysi93@yandex.ru
Россия

A. Schultz

Fraunhofer Institut fuer Biomedizinische Technik (IBMT)

Email: andreysi93@yandex.ru
Германия

A. Germann

Fraunhofer Institut fuer Biomedizinische Technik (IBMT)

Email: andreysi93@yandex.ru
Германия

C. Moog

INSERM U1109, Fédération Hospitalo-Universitaire (FHU) OMICARE

Email: andreysi93@yandex.ru
Франция

H. von Briesen

Fraunhofer Institut fuer Biomedizinische Technik (IBMT)

Email: andreysi93@yandex.ru
Германия

А. С. Тургиев

ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; ООО «Иммуномика»

Email: andreysi93@yandex.ru
Россия

Э. В. Карамов

ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: andreysi93@yandex.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы