Роль рекомбинантного циклофилина А человека в развитии противоопухолевого иммунного ответа

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Циклофилин А (ЦфА) - белок семейства пептидил пролилизомераз, существующий во внутриклеточ ной и секретируемой формах. Цитозольный ЦфА присутствует во всех тканях и выполняет множе ство функций [1]. ЦфА участвует в проведении сигнала через Т-клеточный рецептор [1] и служит лигандом для циклоспорина А, за счет чего и реа лизуется иммуносупрессорное действие последнего [1]. Секретируемый ЦфА является провоспалитель ным фактором, он привлекает клетки врожденного иммунитета (гранулоциты, макрофаги, дендритные клетки) в очаг воспаления и участвует в патогене зе различных заболеваний [1]. Будучи хемоаттрак тантом стволовых клеток, а также незрелых гра нулоцитов, предшественников дендритных клеток, Т- и В-лимфоцитов, и индуцируя их миграцию из костного мозга на периферию, секретируемый ЦфА осуществляет регенеративные функции [2]. ЦфА способен регулировать действие других хемо кинов и продукцию провоспалительных цитокинов [3]. ЦфА индуцирует дифференцировку и созре вание дендритных клеток, а также захват и пред ставление антигена этими клетками [4]. Таким об разом, ЦфА может быть фактором модуляции как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Накапливающиеся экспериментальные данные ука зывают на потенциальную возможность применения данного белка при таких заболеваниях, как ишемия конечностей, устранение побочных эффектов, вы званных действием циклоспорина А, вирусных за болеваний и др. Однако роль ЦфА в индукции и развитии проти воопухолевого иммунного ответа остается малоиз ученной. Цель нашей работы состояла в оценке вкла да ЦфА как фактора иммунитета, участвующего в начальных этапах развития противоопухолевого иммунного ответа. Определено влияние рекомби нантного ЦфА человека (рчЦфА) на отторжение лимфомы EL-4 мышами B10.D2(R101). Выявлено им муномодулирующее действие рчЦфА, направленное на стимуляцию врожденного и адаптивного звеньев иммунитета и, как следствие, на ускоренную эли минацию опухолевых клеток. Кроме того, в модели формирования противоопухолевого иммунного от вета у мышей трансгенной линии 1D1b [5] на клетки лимфомы EL-4 показана роль рчЦфА в стимуляции накопления опухольспецифичных цитотоксических Т-лимфоцитов. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Мыши Мышей линий C57BL/6 (KbI-AbDb) и B10.D2(R101) (KdI-AdI-EdDb) получали из экспериментально биологической лаборатории НИИ ЭДИТО НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Трансгенные мыши линии 1D1b, в Т-лимфоцитах ко торых экспрессируются β-цепи Т-клеточного рецеп тора (ТКР) клеток памяти, специфичного к молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) клас са I H-2Kb, выведены на генетической основе линии B10.D2(R101) в лаборатории механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина [5]. В исследованиях использовали самцов и самок массой 16-18 г. Экспериментальные группы включали 6-8 животных. Работу с живот ными проводили в соответствии с протоколом эти ческой комиссии НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Получение рчЦфА Белок выделяли из биомассы клеток Escherichia coli BL21(DE3)Gold, трансформированных рекомбинант ной плазмидой pETCYPopti, содержащей полнораз мерный ген ЦфА человека [6]. рчЦфА использовали в виде раствора в натрий-калий фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7.3) с чистотой более 95% по данным электрофореза. По результатам LAL-теста содержа ние эндотоксина в образцах рчЦфА не превышало 0.038 нг/мг белка. Иммунизация животных Мышей линии B10.D2(R101) и 1D1b иммунизирова ли внутрибрюшинно (i.p.) клетками лимфомы EL-4 (KbDb) в количестве 3.0 × 105 и 1.0 × 106 клеток/мышь соответственно в 500 мкл PBS. Схемы введения рчЦфА Мышам линии B10.D2(R101) вводили белок i.p. в дозе 5 мг/кг (100 мкг/мышь) в течение 3 дней после им мунизации лимфомой EL-4. Первую инъекцию бел ка проводили через 3 ч после имплантации клеток EL-4. Мышам линии 1D1b вводили 10 мг/кг рчЦфА подкожно в течение 10 дней после иммунизации. Контрольным животным вводили PBS в качестве плацебо. Подготовка суспензий клеток Через 6, 9 и 12 дней после иммунизации мышей ли нии B10.D2(R101) умерщвляли путем цервикальной дислокации. Для получения лаважа проводили смыв брюшной полости 2 мл PBS при помощи шприца. Для получения суспензии спленоцитов извлекали се лезенку и гомогенизировали в 3 мл PBS в гомогениза торе Поттера. Трансгенных мышей 1D1b умерщвля ли на 12 день после иммунизации и подготавливали суспензию спленоцитов аналогичным образом. Лизис эритроцитов проводили в лизирующем буфере (BD, США), затем отмывали клетки в PBS и осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин). Жизнеспособные клетки подсчитывали в камере Горяева в присут ствии трипанового синего и эозина. Антитела В работе использовали моноклональные антите ла: анти-CD3ε - eFluor450 (клон 17А2) (eBioscience, США); анти-CD8 - Pacific blue (клон 53-6.7) (BD Pharmingen, США); анти-CD44 - АРС (клон IM7) (eBioscience, США); анти-CD62L-АРС - Cy7 (клон MEL-14) (eBioscience, США); анти-Vb6 - PE (клон RR4-7) (eBioscience, США); анти-Gr1 - АРС (клон RB6-8C5) (BD Pharmingen, США); анти-CD11b-PE - Cy7 (клон М1/70) (BD Pharmingen, США). Цитофлуориметрический анализ Пробы клеток лаважа и селезенки (1.0-5.0 × 106) об рабатывали антителами Fc block (клон 2.4G2, BD Pharmingen, США) в течение 5 мин при 4°С и инку бировали с моноклональными антителами нужной специфичности в течение 40 мин при 4°С. Клетки отмывали PBS путем центрифугирования (200 g, 5 мин) и анализировали на проточном цитофлуориме тре FACS CantoII (BD, США) с использованием про граммы FACSDiva 6.0. Мертвые клетки исключали из анализа по окрашиванию йодидом пропидия (BD, США). Для характеристики популяций анализиро вали 0.5 - 1.0 × 106 событий. Обработку результатов проводили в программе FlowJo 7.6. (BD, США). Статистическая обработка данных Статистическую обработку данных проводили с ис пользованием t-критерия Стьюдента в программе Exel (Microsoft, США). Различия признавали значи мыми при p ≤ 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ В исследовании использовали аллогенную систему, в которой отторжение клеток лимфомы EL-4 (KbDb) в организме мышей линии B10.D2(R101) (KdI-AdIEdDb) происходило в силу различий по одной моле куле MHC класса I - H-2Kb. Показано, что введение рчЦфА приводит к полной элиминации EL-4 на 9 день после трансплантации опухолевых клеток, тог да как в норме отторжение лимфомы наблюдается к 12 дню (рис. 1). Развитие иммунного ответа на лимфому EL-4 со провождалось привлечением гранулоцитов в сайт локализации клеток-мишеней. К 6 дню после им мунизации рчЦфА индуцировал интенсивное на копление зрелых нейтрофилов в брюшной полости иммунизированных мышей, увеличивая относитель ное количество данных клеток в 3 раза по сравнению с контрольными иммунизированными животными (рис. 2А). К 9 дню после иммунизации под действием рчЦфА происходило увеличение незрелых грану лоцитов, а также промиелоцитов и миелоцитов в 2.5 и 4.5 раза соответственно по сравнению с контроль ными иммунизированными животными (рис. 2Б). На следующем этапе проведена оценка влияния рчЦфА на количественные и субпопуляционные из менения CD8+ Т-лимфоцитов у мышей-опухоленоси телей. Нам не удалось обнаружить влияния рчЦфА на динамику накопления CD8+ Т-лимфоцитов в локальном очаге опухоли (при оценке лаважа) или на системном уровне (при оценке спленоцитов, данные не приведены). Однако анализ субпопуляций наивных клеток (CD62L+CD44-), центральных кле ток памяти (CD62L+CD44+) и эффекторных клеток (CD62L-CD44+) в пуле CD8+ Т-лимфоцитов селезенки показал, что под влиянием рчЦфА значительно уве личивается (на 65% относительно контрольных жи вотных) количество эффекторных цитотоксических Т-клеток на 9 день поле введения опухоли (данные не представлены, рис. 3), что коррелирует с динами кой элиминации клеток лимфомы (рис. 1). Таким образом, показано, что рчЦфА при вну трибрюшинном введении стимулирует противо опухолевый иммунный ответ за счет раннего привлечения гранулоцитов в сайт локализации кле ток-мишеней и ускоренного накопления эффектор ных Т-киллерных клеток на системном уровне. Ранее в нашей лаборатории было показано, что у трансгенных мышей линии 1D1b в ходе иммун ного ответа на клетки EL-4 формируется значитель но меньший пул эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов по сравнению с мышами дикого типа, вследствие чего они не способны отторгать данную опухоль [5, 7]. В настоящей работе у мышей 1D1b оценено влия ние рчЦфА на относительное количество эффекторных Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности эндогенные или трансгенную β-цепь ТКР, которую идентифицировали с помощью коммерческих анти тел к Vb6. Показали, что рчЦфА не влиял на относительное количество эффекторных Т-лимфоцитов, экспрес сирующих эндогенные β-цепи ТКР, у мышей 1D1b, иммунизированных лимфомой EL-4 (рис. 4), но спо собствовал значительному (в 2 раза относительно контрольных животных) увеличению пула эффек торных Т-лимфоцитов, несущих трансгенную β-цепь ТКР (рис. 4). Полученные данные позволяют предполагать, что рчЦфА способен модулировать противоопу холевый иммунный ответ как у мышей с нормаль ным репертуаром Т-лимфоцитов (B10.D2(R101)), так и в условиях ограниченного репертуара ТКР Т-лимфоцитов у трансгенных мышей линии 1D1b путем увеличения пула эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов. ОБСУЖДЕНИЕ В данной работе мы изучали роль рчЦфА в разви тии противоопухолевого иммунного ответа на лим фому EL-4 у мышей линии B10.D2(R101) и показали, что этот белок стимулирует накопление гранулоци тов в сайте локализации опухолевых клеток и си стемное увеличение пула эффекторных цитоток сических Т-лимфоцитов, приводящее к ускоренной элиминации клеток опухоли. Известно, что инфиль трация тканей нейтрофилами является первой фазой иммунного ответа при инфицировании или воспале нии. Эти клетки способны захватывать антиген и ми грировать в дренирующие лимфоузлы и селезенку, где они взаимодействуют с антигенпредставляющими клетками (АПК) и лимфоцитами [8] или сами вы ступают в роли АПК [9], участвуя в формировании адаптивного иммунного ответа. Ранее мы показали, что нейтрофилы участвуют в развитии иммунного ответа на клетки аллогенной опухоли [10]. Роль дан ных клеток может заключаться в обеспечении кости муляторных сигналов (CD80 и CD86) и цитокинового окружения (интерлейкин 12), необходимых для диф ференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов [10, 11]. Показано, что процессы, происходящие в брюшной полости при внутрибрюшинном введении рчЦфА, коррелируют с иммунным ответом на уровне организма. У мышей 1D1b экспрессия трансгенной β-цепи ТКР приводит не только к сокращению репертуа ра ТКР, но и снижает количество активированных Т-лимфоцитов [5]. Иммунный ответ мышей 1D1b на лимфому EL-4 недостаточен для полного оттор жения опухоли, он приводит к иммуноредактиро ванию лимфомы посредством селекции наименее иммуногенных клонов, которые через 60 дней уби вают животных [7]. В данной экспериментальной си стеме установлено, что под действием рчЦфА про исходит статистически значимое увеличение пула специфических цитотоксических Т-лимфоцитов на начальных этапах иммунного ответа на лимфому EL-4. Полученные данные позволяют предполагать, что рчЦфА способен модулировать противоопухо левый иммунный ответ как у мышей с нормальным репертуаром Т-лимфоцитов, так и в условиях огра ниченного репертуара Т-клеток путем увеличения пула эффекторных Т-киллеров. Таким образом, нами показано, что рчЦфА облада ет иммуностимулирующим действием, способствуя ускоренному развитию противоопухолевого иммун ного ответа за счет стимуляции врожденного и адап тивного звеньев иммунитета.

Об авторах

А. А. Калинина

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина

Автор, ответственный за переписку.
Email: lkhromykh@list.ru
Россия

Ю. Ю. Силаева

Институт биологии гена РАН

Email: lkhromykh@list.ru
Россия

Д. Б. Казанский

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения России

Email: lkhromykh@list.ru
Россия

Л. М. Хромых

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения России

Email: lkhromykh@list.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы