«Зеленый» синтез серебряных наночастиц, обладающих цитотоксической активностью, на основе вторичных метаболитов лаванды узколистной

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Современные бионанотехнологии открывают широ кие перспективы в создании лекарств нового поколе ния для борьбы с социально значимыми заболевания ми. Средства и методы бионанотехнологий позволяют получать различного рода наноструктуры, служа щие эффективными инструментами терапии и диа гностики, а также тераностики различных заболева ний, особенно раковых. Для разработки методов тераностики необходи мо создание агентов, обладающих мультифункци ональностью: сочетающих в себе диагностические и терапевтические функции [1-5]. Такими агентами могут быть металлические наночастицы (НЧ), об ладающие свойством локализованного поверхност ного плазмонного резонанса (ЛППР) [6]. Высокая химическая активность поверхности таких нано частиц позволяет модифицировать их нацеливаю щими агентами для доставки к клеткам-мишеням, при этом наличие у данных наночастиц ЛППР де лает возможным их применение как для детекции, так и для селективного уничтожения клеток посред ством гипертермии [7, 8]. «Зеленый» синтез, подраз умевающий экологически чистый метод получения частиц без использования агрессивных токсичных и дорогостоящих веществ, является альтернатив ным, экономически более выгодным и экологиче ски безопасным способом получения наноструктур по сравнению с рядом традиционных физико-хими ческих методов синтеза НЧ, часто дорогих, трудо емких и неэкологичных [9]. В качестве восстанавливающих агентов в таком синтезе широко используются вторичные метаболи ты (ВМ), продуцируемые растениями [10-12]. Они особенно перспективны для «зеленого» синтеза бла годаря низкой стоимости продукции, короткой про должительности синтеза и биобезопасности. Также с помощью культивирования растений in vitro мож но масштабировать производство необходимых ве ществ, так как такие методы позволяют получать в короткие сроки большое количество стандартизи рованного растительного материала, а также выде лять необходимые ВМ круглый год. При создании успешного наноагента для эффек тивного воздействия на раковые клетки необходимо учитывать целый ряд параметров, таких, как раз мер, состав, покрытие, другие физико-химические свойства, параметры циркуляции в кровотоке и т.д. Биосовместимость - один из наиболее существен ных параметров, влияющих на принципиальную возможность использования препарата in vivo. НЧ, полученные методом «зеленого» синтеза, ча сто обладают большей биосовместимостью за счет использования природных веществ с необходимой биологической активностью (благородные металлы, ВМ, белки), что успешно используется для прове дения различных исследований как в условиях in vitro, так и in vivo. Такие частицы рассматриваются как перспективные для применения в тераностике [13, 14]. В данной работе методом «зеленого» синтеза с ис пользованием водных экстрактов лаванды узко листной (Lavandula angustifolia Mill.) получены НЧ серебра. Изучена динамика синтеза НЧ, а также их цитотоксические свойства до и после модификации поверхности в условиях in vitro. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Введение растительного материала в культуру in vitro Семена лаванды узколистной L. angustifolia Mill. сорт Munstead (семейство Яснотковые, Lamiaceae Mart.) стерилизовали 5% раствором гипохлорита натрия (экспозиция 10 мин). После стерилизации семена двукратно отмывали в стерильной дистиллирован ной воде и помещали в чашки Петри с безгормональ ной средой Мурасиге и Скуга (МС) [15]. Контрольные семена проращивали в нестерильных условиях на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллиро ванной водой. Всхожесть семян оценивали на 15-е сутки по ГОСТ 30556-98 [16]. Через 3 недели после посадки семян проростки пересаживали в контейне ры на среду МС для дальнейшего развития. Клональное микроразмножение Растения высотой 10 см (4-6 узлов) нарезали на че ренки (узел с сегментами междоузлия) и размножа ли в два этапа: посадка на среду МС с добавлением 0.5 мг/л тидиазурона (ТДЗ) для стимуляции роста надземной части, затем пересаживали на среду ¼ МС с добавлением 0.2 мг/л α-нафтилуксусной кислоты для индукции ризогенеза [17]. Индукция каллусогенеза Стеблевые экспланты помещали на среду МС с до бавлением 0.5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кис лоты (2,4-Д). Для индукции каллусогенеза использо вали ранее культивированные in vitro растения. Получение водных экстрактов Водные экстракты получали из надземной части асептических растений и каллуса. Растительный материал, замороженный в жидком азоте, растира ли в ступке. По достижении гомогенатом комнатной температуры к нему добавляли дистиллированную воду в соотношении 1 : 3. Смесь помещали на водя ную баню и кипятили в течение 30 мин [18], экстракт фильтровали, центрифугировали в течение 60 мин при 20000 g, отбирали супернатант и использовали его для синтеза наночастиц. Выделение преобладающих фракций растительного экстракта Водный экстракт растений лаванды исследова ли с помощью аналитической хроматографии. Анализировали хроматограммы образцов водно го экстракта растения и каллуса лаванды на трех длинах волн (214, 280 и 320 нм). Фракции, соответ ствующие максимальным пикам (обозначены циф рами на рис. 5А), где высушивали с использовани ем лиофилизатора, растворяли в среде RPMI-1640 c 10% фетальной бычьей сыворотки и использовали для оценки цитотоксичности. Синтез наночастиц Серебряные наночастицы получены методом «зеле ного» синтеза путем смешивания 50 мкл раствора нитрата серебра в воде (1 г/л) и 50 мкл экстрактов либо растений, либо каллусов лаванды в диапазоне концентраций от 30 до 0.5%. В процессе синтеза ча стиц измеряли спектры поглощения при 350-800 нм в четырех временных точках (30, 60, 150, 240 мин) с использованием планшетного анализатора Infinite M100 Pro (Tecan, Австрия). Эффективность син теза НЧ оценивали по интенсивности пика ЛППР. Наличие пика поверхностного плазмонного резонан са считается качественным критерием присутствия в системе металлических НЧ [19, 20]. Морфологию синтезированных наночастиц иссле довали методом сканирующей электронной микро скопии при ускоряющем напряжении 10 кВ на ми кроскопе MAIA3 Tescan (Чехия). Модификация наночастиц НЧ модифицировали бычьим сывороточным альбу мином (БСА) путем сорбции белка на поверхности частиц. Эффективность модификации НЧ косвенно подтверждена путем измерения их гидродинами ческого размера. Размер частиц определяли мето дом динамического рассеяния света на анализаторе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Ltd.). Изучение цитотоксических свойств Цитотоксические свойства растительного экстрак та, его преобладающих фракций и НЧ, полученных с помощью данного экстракта до и после стаби лизации БСА, изучали при помощи стандартного МТТ-теста. Исследование проводили на клеточных линиях различного происхождения: CHO (клетки яичника китайского хомячка), SK-BR-3 (аденокар цинома молочной железы человека), SKOV3-1ip (аденокарцинома яичника человека), а также на ли нии SKOV-kat, трансфицированной красным флу оресцентным белком Katushka, для прижизненного мониторинга развития злокачественных образова ний in vivo на модельных лабораторных животных [21]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Наночастицы серебра для биомедицинских при менений синтезированы с использованием водного экстракта лаванды узколистной - эфиромасличного растения, широко применяющегося в пищевой, кос метической и фармацевтической промышленности. Использование вторичных метаболитов (ВМ) лаван ды, способных восстанавливать ионы металлов из их солей, является перспективным экологически без опасным способом создания НЧ с антибактериальны ми и цитотоксическими свойствами. Ряд наночастиц, полученных путем восстановления ионов металлов, обладает свойством поверхностного плазмонного резонанса и, как следствие, возможностью нагрева, что может использоваться в онкотераностике для ги пертермии тканей. Культура клеток и тканей лаванды узколистной В процессе культивирования in vitro получены про ростки лаванды узколистной (рис. 1А). Всхожесть се мян при введении в культуру in vitro не отличалась достоверно от всхожести в контрольном образце и со ставляла 80.0 ± 19.6%, что свидетельствует об эффек тивности выбранного способа стерилизации. При размножении растений на среде МС с добав лением 0.5 мг/л ТДЗ получены проростки средней высотой 6.4 ± 2.1 см. Наблюдалось множественное побегообразование, что считается хорошим пока зателем эффективности увеличения вегетативной массы растений. Также у 4% черенков наблюдался спонтанный ризогенез, такие растения не нуждались в дальнейшей пересадке. Для укоренения оставшихся растений исполь зована среда, содержащая низкие концентра ции макроэлементов, ¼ МС с добавлением 0.2 мг/л α-нафтилуксусной кислоты, при этом частота ризо генеза составила 90.7-93.3%. Этот этап клонально го микроразмножения помог значительно повысить эффективность образования корней у полученных ранее растений. Частота каллусогенеза стеблевых эксплантов со ставила 95-99%. Каллус имел рыхлую консистенцию, а также светло-зеленый оттенок (рис. 1Б). Каллус с такими свойствами в дальнейшем можно исполь зовать для получения суспензии растительных кле ток, что позволит увеличить выход ВМ в культуре in vitro. Синтез наночастиц Частицы были получены посредством длительно го инкубирования раствора нитрата серебра и экс трактов из растений и каллуса лаванды как описано в разделе «Экспериментальная часть». Для количе ственной оценки эффективность синтеза наночастиц, обладающих пиком ЛППР, оценивали спектрофото метрическим методом, что позволяет выявить пик ЛППР и определить его интенсивность. Спектры сме сей раствора нитрата серебра и экстрактов из рас тений и каллуса лаванды, полученные в разных временных точках (рис. 2), позволяют сделать вы вод о монотонно возрастающей зависимости между поглощением образца НЧ на длине волны, соответ ствующей пику ЛППР, и концентрацией экстрактов, а также временем инкубации соли серебра с экс трактом. Наибольшее поглощение образцов, наблю даемое при синтезе с растительным экстрактом (30%) в течение 240 мин инкубации, составило 0.82 отн.ед., что превышает аналогичный показатель для кал лусного экстракта в 1.6 раза (рис. 2). В дальнейшем для синтеза НЧ использовали экстракт в концентра ции 7.5%, так как при этой концентрации наблюдался достаточно интенсивный пик плазмонного резонан са, подтверждающий формирование наноструктур, а также поддерживался избыток соли серебра в рас творе. Далее была изучена коллоидная стабильность НЧ. Частицы проявляли агрегационную и седиментаци онную стабильность в фосфатно-солевом растворе в течение длительного времени (3 месяца, дальней шие наблюдения не проводили) без какой-либо по верхностной модификации, что считается хорошим показателем выбранного метода синтеза. Стоит от метить, что в большинстве случаев металлические частицы требуют дополнительной обработки различ ными стабилизаторами (цитратом натрия, различны ми белками, ПЭГом и другими полимерами) для до стижения коллоидной стабильности в буферных растворах. Синтезированные НЧ могут быть использованы для последующей модификации биологиче ски активными молекулами, в том числе распознаю щими раковые клетки полипептидами (антителами, скаффолдами), требующими длительного хранения в солевых растворах. В результате обработки изображений, полученных методом электронной микроскопии, определен сред ний размер наночастиц - 35.4 ± 1.6 нм при синтезе с растительным экстрактом и 56.4 ± 2.4 нм при синте зе с каллусным экстрактом (рис. 3Б). НЧ в основном имели округлую форму, однако часть частиц, полу ченных с использованием каллусного экстракта, име ла форму тетраэдра или более сложных многогран ников (рис. 3А). Следует отметить, что размер НЧ, используемых in vivo, имеет большое значение, поскольку он опре деляет свойства наночастиц и влияет на прохожде ние ими гематоэнцефалического барьера [22-24]. Следовательно, при синтезе наночастиц необхо димо учитывать все параметры, влияющие на их размер, а также иметь возможность воздействовать на эти параметры для получения наночастиц опти мального размера для успешного проникновения в клетку. В дальнейших экспериментах использовали сере бряные НЧ, полученные с растительным экстрактом, так как они по всем параметрам превосходили НЧ, синтезированные с помощью каллусного экстракта - имели большую интенсивность пика ЛППР, мень ший размер и более стабильную форму. Поскольку применение наночастиц для задач онкотераностики подразумевает модификацию их поверхности раз личными соединениями (антитела, аффибоди и др.), которая значительно влияет на конечный гидродина мический размер, поэтому для работы выбраны на ночастицы с меньшим средним диаметром. Изучение цитотоксических свойств НЧ С целью изучения перспективности синтезирован ных НЧ для различных биомедицинских примене ний, в частности для онкотераностики, исследована биосовместимость данных НЧ в культуре in vitro. С использованием стандартного МТТ-теста иссле довано действие НЧ, полученных с помощью рас тительного экстракта, а также выделенных из него фракций, которые, вероятно, влияют на цитотоксич ность как самого экстракта, так и НЧ. По данным МТТ-теста (рис. 4А) синтезирован ные немодифицированные наночастицы обладали цитотоксическими свойствами по отношению к кле точным линиям CHO и SK-BR-3 в большей степе ни, SKOV3-1ip - в меньшей. На жизнеспособность клеток линии SKOV-kat, немодифицированные НЧ, не влияли. Действие растительного экстракта и его основных фракций, выделенных методом аналитической хро матографии, на клеточные линии CHO и SK-BR-3 оценили с использованием МТТ-теста. Были выделе ны фракции, соответствующие пикам с наибольшим поглощением при λ = 280 нм (рис. 5А). На основании данных, представленных на рис. 5А, предположили, что цитотоксичность полученных НЧ по отношению к этим клеточным линиям обусловлена наличием на поверхности НЧ биологически активных веществ, а именно, вторичных метаболитов из растительно го экстракта, используемого в процессе синтеза НЧ. Для подтверждения этой гипотезы проанализиро вано цитотоксическое действие как 1% экстракта, так и его фракций, высушенных и растворенных в ростовой среде. По данным МТТ-теста (рис. 5Б), фракции 2 и 6 проявляли значительно большую цитотоксичность по отношению к линии SK-BR-3, но не влияли на жизнеспособность линии CHO. Фракции 3, 9 и 12 вызывали противоположный эф фект. Наибольшее цитотоксическое действие на обе клеточные линии оказывал сам экстракт, а также фракции 5, 7, 10 и 11, причем воздействие на жиз неспособность клеточной линии SK-BR-3 было бо лее выражено. Таким образом, можно сделать вы вод, что цитотоксические свойства растительного экстракта и, вероятно, цитотоксические свойства НЧ определяют в основном фракции 5, 7, 10 и 11. Поскольку НЧ оказывали цитотоксическое дей ствие на некоторые клеточные линии, предположи ли, что блокирование поверхности частиц биосовме стимым белком может уменьшить данный эффект. В качестве блокирующего белка был выбран бы чий сывороточный альбумин (БСА), не влияющий на жизнеспособность клеток. Диаметр частиц БСА после стабилизации увели чился в среднем на 71.9 нм. Согласно результатам МТТ-теста, в культуре in vitro модифицированные таким образом наночастицы не оказывали цитоток сического воздействия на все изученные клеточные линии (рис. 4Б). Полученные данные свидетельству ют о том, что БСА экранирует поверхность НЧ, бло кируя таким образом их цитотоксичность. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Методом «зеленого» синтеза с использованием во дных экстрактов растений и каллуса лаванды узко листной получены коллоидно стабильные наночасти цы серебра. Отработаны условия синтеза стабильных в фосфатно-солевом буфере НЧ, имеющих опти мальный для применения в онкотераностике раз мер - 35.4 ± 1.6 нм. НЧ охарактеризованы методами спектрофотометрии, динамического светорассеяния и сканирующей электронной микроскопии. Изучены цитотоксические свойства частиц, полученных с ис пользованием растительного экстракта. Доказано, что блокировка поверхности НЧ белком БСА полно стью подавляет их цитотоксическое действие в условиях in vitro. Полученные НЧ обладают совокупно стью свойств, предопределяющих перспективность создания на их основе мультифункциональных аген тов, сочетающих в себе диагностические и терапев тические функции.

Об авторах

М. М. Белова

Российский государственный аграрный университет – МСXА им. К.А. Тимирязева

Автор, ответственный за переписку.
Email: viktoriya.shipunova@phystech.edu
Россия

В. О. Шипунова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский физико-технический институт (Национальный исследовательский университет)

Email: viktoriya.shipunova@phystech.edu
Россия

П. А. Котельникова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: viktoriya.shipunova@phystech.edu
Россия

А. В. Бабёнышев

Московский физико-технический институт (Национальный исследовательский университет)

Email: viktoriya.shipunova@phystech.edu
Россия

Е. А. Рогожин

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: viktoriya.shipunova@phystech.edu
Россия

М. Ю. Чередниченко

Российский государственный аграрный университет – МСXА им. К.А. Тимирязева

Email: viktoriya.shipunova@phystech.edu
Россия

С. М. Деев

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ»; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет)

Email: viktoriya.shipunova@phystech.edu
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы