Оценка степени проявления фенилкетонурии, обусловленной гомозиготной мутацией p.R155H, при помощи масс спектрометрического анализа метаболитов крови

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Мы сравнили проявления фенилкетонурии (ФКУ) у двух гомозиготных носителей редкой мутации p.R155H - брата и сестры, детей одних и тех же родителей, получавших различное лечение. Такие пациенты представляют собой уникальную модель, позволяющую оценить как степень фенотипического проявления мутации, так и эффективность терапии. ФКУ, обусловленная мутациями с достаточной оста точной активностью фенилаланингидроксилазы, зачастую не выявляется, если диагноз основан исключительно на концентрации фенилаланина в крови. Подобная ошибка была допущена в случае одного из наших пациентов. Для уменьшения вероятности ошибок мы предлагаем использовать для диагностики более точные методы, например, масс-спектрометрический анализ метаболитов крови, эффективность которого показана в данной работе.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Фенилкетонурия типа I (классическая) (ФКУ; MIM 261600) - аутосомное рецессивно наследуемое забо левание, обусловленное недостаточной активностью фенилаланингидроксилазы (ФАГ; [КФ 1.14.16.1]) [1, 2]. Недостаток ферментативной активности обычно обусловлен мутациями в гене фенилаланингидрок силазы [1]. Неполное превращение фенилалани на в тирозин из-за недостаточной активности ФАГ приводит к накоплению в тканях и биологических жидкостях фенилаланина и токсичных продук тов альтернативных путей его метаболизма, та ких, как фенилпируват, винилацетат, фениллактат и фенилацетилглутамин, что приводит к развитию симптомов заболевания, в частности слабоумия. Распространенными признаками фенилкетонурии также являются уменьшение концентрации тиро зина и изменение баланса аминокислот в биологиче ских жидкостях. Повсеместно используемая клас сификация степени проявления ФКУ, основанная на концентрации фенилаланина в крови, была пред ложена C.R. Scriver и S. Kaufman [3]. Согласно N. Blau и соавт. [4] ФКУ рассматривается как классическая (тяжелая) при концентрации фенилаланина в крови до лечения более 1200 мкМ; как ФКУ средней тяже сти - при концентрации фенилаланина в пределах 900-1200 мкМ; как легкая форма - при концентра ции 600-900 мкМ; концентрации менее 600 мкМ до лечения рассматриваются как гиперфенилалани немия. Неонатальный биохимический анализ является наиболее широко используемым в настоящее время методом ранней диагностики генетических заболе ваний и предотвращения их последствий. Всемирная организация здравоохранения определила социаль ные и экономические предпосылки для включения заболевания в национальные программы неона тальной диагностики [5]. В настоящее время неона тальная диагностика ФКУ, как одного из наиболее распространенных генетических заболеваний (ча стота от 1 : 10000 до 1 : 25000 среди европеоидов [6]), проводится в большинстве стран. В Российской Федерации такая диагностика предусматривает не сколько измерений уровня фенилаланина в плазме крови, первое из которых проводится на 4 или 5 день после рождения. Если обнаруживается повышенный уровень, то измерение проводится повторно. Однако диагностика, основанная только на уровне фенила ланина в крови, может быть недостоверной, особенно при пограничных уровнях. Для точной диагности ки требуются более совершенные методы, особенно в случае мутаций с относительно высокой остаточной активностью ФАГ, при которых уровень фенилала нина в крови повышается незначительно, оставаясь менее 500 мкМ, что недостаточно для однозначной диагностики. Масс-спектрометрический анализ ме таболитов крови может обеспечить постановку бо лее точного диагноза, основанного на оценке концен трации не только фенилаланина, но также тирозина и других аминокислот, что, в частности, позволяет определить соотношение фенилаланина и тирозина. Основанный на уровне метаболитов диагноз должен подтверждаться генетическим анализом с иденти фикацией мутаций гена ФАГ и характера их насле дования при помощи определения нуклеотидных по следовательностей соответствующих локусов. В настоящее время основным и наиболее широ ко используемым методом коррекции ФКУ являет ся диетотерапия [7, 8], направленная прежде все го на предотвращение повреждений центральной нервной системы (ЦНС), ведущих к деградации ум ственных способностей. Для достижения этой цели диетотерапия должна начинаться не позднее не скольких недель после рождения. Будучи в целом достаточно эффективной, такая диета ограничива ет потребление белков животного происхождения, что может привести к уменьшению концентраций свободного карнитина (C0) и ацилкарнитинов (C2- C18), и, как следствие, к нарушениям метаболизма и функционирования митохондрий у некоторых па циентов [9]. В данной работе мы определяли уровни метабо литов в крови при наличии и отсутствии диетоте рапии у двух родственных гомозиготных носителей ассоциированной с ФКУ мутации p.R155H гена ФАГ с использованием масс-спектрометрического анали за высушенных образцов крови. Близкородственных гомозиготных пациентов с различными историями использования диетотерапии можно рассматривать как уникальную модель для исследования как фено типического проявления мутации, так и эффектив ности терапии. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Оба пациента являются детьми одних и тех же ро дителей. У девочки (1), рожденной в июне 2009 года в России, ФКУ выявлена в процессе неонатальной биохимической диагностики, и она получала дие ту с ограниченным содержанием фенилаланина со второго месяца жизни. У мальчика (2), рожденно го в июле 2001 года в Узбекистане, неонатальная диагностика не выявила ФКУ, и к нему не при меняли диетотерапию. Образцы крови для масс спектрометрического анализа были взяты в 2010 году, примерно через год после начала диетотерапии у пациента 1. В это же время проведена оценка физи ческого развития и статуса ЦНС пациентов, которая не выявила каких-либо существенных отклонений. Исследование проводили в соответствии с требова ниями комитета по медицинской этике ИХБФМ СО РАН. В процессе неонатальной диагностики образ цы крови собирали, используя бумажные фильтры (Perkin Elmer, Финляндия), концентрацию фенила ланина в крови определяли с использованием ана лизатора Delfia/Victor и набора реактивов произ водителя (Wallac Oy, Финляндия). Геномную ДНК выделяли из крови как описано ранее [10]. Мутации в гене ФАГ идентифицировали, определяя методом Сэнгера по двум цепям ДНК нуклеотидные после довательности продуктов ПЦР-амплификации об ластей всех экзонов и прилежащих районов ин тронов гена ФАГ с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 и генного анализатора ABI 3130xl (Applied Biosystems, США) в ЦКП «Геномика» ИХБФМ СО РАН. Нуклеотидные последовательности ДНК обоих пациентов были идентичными и соответствовали известным после довательностям гена ФАГ за исключением мутации p.R155H. Нуклеотидные последовательности родите лей пациентов позволили подтвердить наследование мутации p.R155H. Масс-спектрометрический анализ содержания фенилаланина, тирозина и ацилкарни тинов проводили в ЦКП масс-спектрометрического анализа ИХБФМ СО РАН с использованием стан дартной процедуры [11]. Использовали реактивы для подготовки образцов и внутренние стандарты из набора для диагностики новорожденных Amino acids and acylcarnitines kit # 55000 (Chromsystems Instruments & Chemicals, Германия), образцы го товили согласно протоколу производителя набора. Анализ проводили с использованием системы тан демного масс-спектрометра Agilent 6410 QQQ с си стемой ионизации ESI, объединенного с системой жидкостной хроматографии Agilent 1200 (Agilent Technologies, США). Количественный анализ прово дили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) с общим временем анализа 2.5 мин. Сигнал регистрировали и анализировали с использованием программы MassHunter v.1.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Точечная мутация p.R155H является заменой G на A в структуре экзона 5 гена ФАГ, приводящей к замене аргинина в каталитическом домене ФАГ на гистидин. Остаточная активность фермента, содержащего му тацию, остается достаточно высокой, примерно 44% от исходной, согласно данным http://www.biopku.org [12]. Поэтому мутация p.R155H считается ассоцииро ванной с гиперфенилаланинемией с относительным коэффициентом корреляции генотипа и фенотипа 8 по шкале, предложенной Guldberg и соавт. [1]. Эта редкая мутация ранее была описана лишь в одном случае в сочетании с мутацией p.D143G у пациента с диагнозом гиперфенилаланинемия [13]. Нами из учены два рожденных от одних родителей гомози готных носителя мутации p.R155H, один из которых подвергался диетотерапии, в то время как другой - нет. Будучи гомозиготными носителями мутации, та кие пациенты дают уникальную возможность непо средственно изучить степень проявления мутации на уровне фенотипа, в то время как существенные различия в применявшейся терапии позволяют оце нить ее сравнительную эффективность. Первоначальное фенотипическое проявление му тации p.R155H у пациентов 1 и 2 несколько различа лось, несмотря на одинаковый генотип по локусу ФАГ и общую родословную. Концентрация фенилаланина в крови в момент неонатальной диагностики у паци ента 1 составила 1100 мкМ, на основании чего был поставлен диагноз ФКУ средней тяжести и пред писана диетотерапия. У пациента 2 ФКУ не была диагностирована в процессе неонатальной диагно стики, проводившейся в Республике Узбекистан, возможно, в силу разных сроков и стандартов диа гностики. В 2010 году уровень фенилаланина в кро ви этого пациента составил 497 ± 13 мкМ (таблица), что соответствует максимум гиперфенилаланине мии. Таким образом, при использовании в качестве критерия только уровня фенилаланина крови мож но заключить, что генотип p.R155H/p.R155H может проявляться достаточно широким спектром симпто мов - от слабо выраженной гиперфенилаланинемии до ФКУ средней тяжести, в зависимости от других биохимических особенностей пациента, ассоцииро ванных, например, с полом, составом питания в не онатальный период и т.п. При этом неонатальная диагностика, основанная на концентрации фенилаланина в крови, может не выявить заболевание, что и произошло с пациентом 2. Эффективное использование масс-спектрометрии для точной диагностики ФКУ, особенно при проме жуточных концентрациях фенилаланина в крови, описано в работах Chace и соавт. [15, 16]. В качестве более точного и селективного критерия диагности ки вместо концентрации фенилаланина они пред ложили использовать отношение концентрации фенилаланина и тирозина, поскольку при этом кор ректируются изменения общего уровня аминокислот. Отношение концентраций фенилаланина и тирозина в крови в норме находится в диапазоне от 0.49 до 0.93, повышаясь до значений от 1.3 до 14.3 у больных ФКУ [15, 16]. Мы зарегистрировали высокие значения это го параметра, явно и однозначно соответствующие ФКУ как у пациента 1 (6.9 ± 0.3), так и у пациента 2 (5.8 ± 0.1) (таблица). В то же время родители паци ентов - гетерозиготные носители мутации, имели от ношения, характерные для здоровых людей: 0.9 ± 0.1 (мать) и 0.7 ± 0.02 (отец). Мы также определили уровни карнитинов в кро ви пациентов (таблица) и сравнили их с данными 20 здоровых детей [17]. Ранее было показано, что уров ни карнитинов могут быть полезным критерием при идентификации врожденных сбоев метаболиз ма, и они существенно меняются при различных метаболических нарушениях [18]. Также отмечено, что концентрации карнитинов значительно понижа ются в крови пациентов с ФКУ после диетотерапии с пониженным содержанием фенилаланина, если она не дополняется карнитинами [19]. У наших па циентов выявлено незначительное снижение обще го уровня карнитинов (44.9 мкМ у пациента 1 и 55.2 мкМ у пациента 2) относительно нормальных уров ней, которые составляют 60-100 мкМ [20]. Общие уровни ацилкарнитинов (13.2 мкМ у пациента 1 и 13.9 мкМ у пациента 2) полностью соответствовали норме. Возможный дефицит карнитинов мы опреде ляли по отношению концентраций ацилкарнитинов и свободных карнитинов. Значения (0.42 у пациента 1 и 0.33 у пациента 2) были значительно ниже верх него предела нормы (0.6), что свидетельствует о до статочных уровнях свободного карнитина, а также о соответствующей норме доле связанных форм кар нитина. Таким образом, концентрации ацилкарнити нов у наших гомозиготных носителей p.R155H были в пределах нормы, несмотря на то, что ряд исследо ваний [21, 22] свидетельствуют о значительных от личиях концентраций ацилкарнитинов у пациентов с классической ФКУ от нормы. ВЫВОДЫ Мы обследовали двух близкородственных гомозигот ных носителей мутации p.R155H, ассоциированной с ФКУ, с различными историями терапии: один под вергался диетотерапии, а другой лечения не получал. В случае использования концентрации фенилалани на в крови в качестве единственного диагностическо го критерия ФКУ состояние одного пациента следу ет классифицировать как гиперфенилаланинемию, а другого - как ФКУ средней тяжести. В то же время использование отношения концентраций фенилала нина и тирозина в качестве критерия позволяет до стоверно диагностировать ФКУ у обоих пациентов. Таким образом, уровень фенилаланина в крови сам по себе не может служить достоверным критерием диагностики ФКУ во всех случаях и не должен ис пользоваться в качестве единственного диагности ческого критерия. Наши данные подтверждают воз можность использования соотношения концентраций фенилаланина и тирозина в качестве более точного и достоверного критерия при неонатальной диагно стике. Мы также показали возможность использо вания масс-спектрометрического анализа в качестве основного метода неонатальной диагностики ФКУ. Определенные нами концентрации свободной и связанных форм карнитинов в крови свидетель ствуют о том, что гомозиготные носители мутации p.R155H, вероятно, не испытывают существенных ограничений энергетического обмена в клетках, в от личие от пациентов с классической ФКУ или ФКУ средней тяжести.

×

Об авторах

О. А. Батурина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: mor@niboch.nsc.ru
Россия

А. А. Черноносов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: mor@niboch.nsc.ru
Россия

В. В. Коваль

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: mor@niboch.nsc.ru
Россия

И. В. Морозов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: mor@niboch.nsc.ru
Россия

Список литературы

  1. Guldberg P., Rey F., Zschocke J., Romano V., Francois B., Michiels L., Ullrich K., Hoffmann G.F., Burgard P., Schmidt H. // Am. J. Hum. Genet. 1998, V.63, P.71-79
  2. DiLella A.G., Kwok S.C., Ledley F.D., Marvit J., Woo S.L. // Biochemistry. 1986, V.25, P.743-749
  3. Scriver C.R., Kaufman S., Woo S.L. // Annu. Rev. Genet. 1988, V.22, P.301-321
  4. Blau N., van Spronsen F.J., Levy H.L. // Lancet. 2010, V.376, P.1417-1427
  5. // Order of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation of March 22, 2006 No. 185 On mandatory newborn screening for hereditary diseases.
  6. Williams R.A., Mamotte C.D., Burnett J.R. // Clin. Biochem. Rev. 2008, V.29, P.31-41
  7. Ahring K., Bélanger-Quintana A., Dokoupil K., Gokmen Ozel H., Lammardo A.M., MacDonald A. // Clin. Nutr. 2009, V.28, P.231-237
  8. Bushueva T.V. // Questions of Modern Pediatrics. 2010, V.9, P.157-162
  9. Mutze U., Beblo S., Kortz L., Matthies C., Koletzko B., Bruegel M., Rohde C., Thiery J., Kiess W., Ceglarek U. // PLoS One. 2012, V.7, P.1-9
  10. Baturina O.A., Tupikin A.E., Lukjanova T.V., Sosnitskaya S.V., Morozov I.V. // J. Med. Biochem. 2014, V.33, P.333-340
  11. Chace D.H., Kalas T., Naylor E.W. // Clin. Chem. 2003, V.49, P.1797-1817
  12. // Databases of Pediatric Neurotransmitter Disorders (PND), including the locus-specific database of PAH variants and BIOPKU genotypes database [Internet]. Division of Metabolism University Children’s Hospital Steinwiesstrasse 75 CH-8032 Zürich Switzerland [cited 2018 Sep 10]. url http:www.biopku.org
  13. Dobrowolski S.F., Pey A.L., Koch R., Levy H., Ellingson C.C., Naylor E.W., Martinez A. // J. Inherit. Metab. Dis. 2009, V.32, P.10-21
  14. Liu Q., Wu J., Shen W., Wei R., Jiang .J., Liang J., Chen M., Zhong M., Yin A. // J. Matern. Fetal Neonatal. Med. 2017. V. 30 (22). 2017, V.30(22), P.2697-2704
  15. Chace D.H., Mlllington D.S., Terada N., Kahier S.G., Roe C.R., Hofman L.F. // Clin. Chem. 1993, V.39, P.66-71
  16. Chace D.H., Sherwin J.E., Hillman S.L., Lorey F., Cunningham G.C. // Clin. Chem. 1998, V.44, P.2405-2409
  17. Leontieva I.V., Nikolaeva E.A., Alimina E.G., Zolkina I.V. // Practice Pediatrician. 2012, V.10, P.74-79
  18. Jones L.L., McDonald D.A., Borum P.R. // Prog. Lipid Res. 2010, V.49(1), P.61-75
  19. Vilaseca M.A., Briones P., Ferrer I., Campistol J., Riverola A., Castillo P., Ramon F. // J. Inherit. Metab. Dis. 1993, V.16(1), P.101-104
  20. Weigel C., Kiener C., Meier N., Schmid P., Rauh M., Rascher W., Knerr I. // Ann. Nutr. Metab. 2008, V.53, P.91-95
  21. Fischer G.M., Nemeti B., Farkas V., Debreceni B., Laszlo A., Schaffer Z., Somogyi C., Sandor A. // Biochim. Biophys. Acta. 2000, V.150, P.200-210
  22. Engel A.G., Rebouche C.J. // J. Inherit. Metab. Dis. 1984, V.7, S1, P.38-43

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Батурина О.А., Черноносов А.А., Коваль В.В., Морозов И.В., 2019

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах