Рекомбинантный человеческий циклофилин A тормозит образование фибринового сгустка

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ. Циклофилин А - белок с молекулярной массой около 20 кДа, который проявляет цис-транс-изомеразную активность и имеет широкий спектр разнообразных функций. Циклофилин А продуцируется клетками тимуса и обладает хемотаксическим действием, регулируя миграцию стволовых клеток из костного мозга на периферию [1]. Активированные макрофаги также секретируют ЦфА, который привлекает зрелые моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и активированные Т-клетки к очагу воспаления [2]. Однако участие этого белка в функционировании системы гемостаза изучено недостаточно. Известно, что гладкомышечные клетки сосудистой стенки секретируют ЦфА при гипоксии и окислительном стрессе, а при повреждении сосудистой стенки активированные тромбоциты способны выделять ЦфА [3], который, в свою очередь, стимулирует пролиферацию эндотелиоцитов [4] и таким образом способствует развитию регенеративных процессов. В представленной работе изучено влияние in vitro рекомбинантного человеческого циклофилина А на рост фибринового сгустка. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Рекомбинантный человеческий ЦфА получали, используя клетки Escherichia coli BL21, трансформированные плазмидой pCyPAwt/pGEX-2TK, кодирующей слитый белок GST-CyPA. Генетическая конструкция использована с любезного разрешения М. Bukrinsky (Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University, США). Синтез GST-CyPA индуцировали, добавляя 0.2 мМ изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 100 мкМ. Клетки осаждали центрифугированием, суспендировали в Na-K-фосфатном буфере (pH 7.3) и разрушали ультразвуком. Лизат клеток центрифугировали, надосадок наносили на колонку GSTrap FF («GE Healthcare»). Слитый белок GST-CyPA элюировали 50 мМ Трис-НО-буфером, pH 8.0, содержащим 10 мМ восстановленного глутатиона. Фракции, содержащие GST-CyPA, объединяли, переводили в раствор 10 мМ Трис-HCl (pH 8.0) на колонке HiTrap Desalting («GE Healthcare») и наносили на колонку MonoQ 5 х 50 («GE Healthcare»). Элюцию проводили градиентом 1 М хлорида натрия (0-1 М) в 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0. Фракции, содержащие GST-CyPA, переводили диа- Влияние инкубации в течение 30 мин и 3 ч богатой тромбоцитами плазмы с рекомбинантным человеческим циклофилином А на параметры пространственной динамики роста сгустка Проба ЗРС, мин НСР, мин ССР, мин РС-30, мкм ПС, усл. ед. Инкубация в течение 30 мин Контроль 3.0 ± 1.6 53.3 ± 16.7 32.8 ± 13.1 868.0 ± 180.1 13679.0 ± 2395.0 Опыт 14.8 ± 5.7* 14.3 ± 6.2* 16.8 ± 7.2* 341.1 ± 114.3* 9116.0 ± 2086.0* Инкубация в течение 3 ч Контроль 1.0 ± 0.3 59.7 ± 4.8 37.0 ± 9.0 1329.0 ± 244.7 16182.0 ± 2797.0 Опыт 1.4 ± 0.6 61.8 ± 6.7 33.5 ± 5.2 1258.0 ± 189.8 13971.5 ± 3294.5 Примечание. ЗРС - задержка роста сгустка, НСР - начальная скорость роста, ССР - стационарная скорость роста, РС-30 - размер сгустка на 30-й мин роста, ПС - плотность сгустка. *Значимость различий (р < 0.05) по сравнению с контролем. лизом в Na-K-фосфатный буфер (pH 7.3) и добавляли раствор тромбина («Sigma-Aldrich») из расчета 1 ед. акт. на 1 мг слитого белка. Расщепление вели в течение 10 ч при 4°С. Смесь белков CyPA и GST разделяли на колонке GSTrap FF. Раствор CyPA освобождали от тромбина на колонке HiTrap Benzamidine FF («GE Healthcare»). Полноту реакции контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-ПААГ). Чистота используемого белка составила ~98%. Влияние ЦфА in vitro на пространственную динамику роста сгустка изучали с использованием венозной крови здоровых доноров, полученную самотеком из периферической вены и стабилизированную 3.7% раствором цитрата натрия в соотношении цитрат : кровь = 1 : 9. Пробы крови центрифугировали при 1500 об/мин в течение 7 мин. Плазму, богатую тромбоцитами, делили на две части. Первая часть служила контролем (К), во вторую часть (опыт - О) добавляли ЦфА в конечной концентрации 10 или 50 мкг/мл и инкубировали при 37оС в течение 30 мин и 3 ч при постоянном перемешивании для предотвращения оседания тромбоцитов. В качестве вещества сравнения использовали гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ) в конечной концентрации 20 мкг/мл. По прошествии времени инкубации богатую тромбоцитами плазму центрифугировали при 13700 об/мин в течение 10 мин. Плазму без тромбоцитов использовали для изучения пространственной динамики роста сгустка в соответствии с инструкцией к прибору «Тромбоимиджер-2» (ООО «ГемаКор», Россия). Регистрировали задержку роста сгустка, или lag-фазу (мин), начальную (мин) и стационарную (мин) скорости роста сгустка, размер сгустка на 30-й мин роста (мкм), плотность сгустка (усл. ед.), спонтанное тромбообразование в объеме камеры. Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с использованием критерия Манна-Уитни. Значимыми считали различия при р < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ Параметры пространственной динамики роста сгустка при инкубации богатой тромбоцитами плазмы с ЦфА в течение 30 мин и 3 ч представлены в таблице. Как видно из таблицы, 30-минутная инкубация богатой тромбоцитами плазмы с ЦфА в конечной концентрации 10 мкг/мл статистически значимо тормозила пространственную динамику роста сгустка, т.е. ЦфА обнаруживал свойства вещества с гипокоа-гуляционной активностью. При этом в двух образцах контрольной группы зарегистрировано спонтанное тромбообразование в объеме измерительной камеры. Инкубация с ЦфА предотвращала развитие спонтанного тромбообразования в системе. Однако этот эффект был кратковременным, и через 3 ч различия в параметрах пространственной динамики роста сгустка исчезали (таблица). Не выявлено дозозависимого влияния препарата на рост сгустка при инкубации проб богатой тромбоцитами плазмы с ЦфА в конечной концентрации 50 мкг/ мл. Параметры пространственной динамики образования сгустка были такими же, как при инкубации с ЦфА в конечной концентрации 10 мкг/мл. После 3 ч инкубации не наблюдали замедления роста сгустка. ГКСФ не оказывал какого-либо влияния на величины определенных нами показателей, которые были сравнимы с величинами в контрольной группе. ТОМ 4 № 2 (13) 2012 | ACTA NATURAE | 103 КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ ОБСУЖДЕНИЕ В организме сгусток образуется не во всем объеме крови, а строго локально - только в небольшой зоне повреждения стенки кровеносного сосуда. При повреждении стенки сосуда в кровь экспонируется тканевой фактор - белок, иммобилизованный на мембране клеток сосудистой стенки, которые до повреждения закрыты слоем эндотелия. При этом диффузия факторов свертывания играет важную роль в процессе пространственного роста сгустка и его локализации. Отдельные патологии специфически влияют на активность компонентов системы свертывания, приводя к выраженным изменениям в различных фазах процесса. Нарушения в механизмах гемокоагуляции клинически проявляются либо кровотечением, либо тромбозом, либо их сочетанием. Однако в значительной степени процесс тромбо-образования происходит в организме в пространственно неоднородных условиях. Поэтому роль отдельных реакций свертывания может проявляться по-разному в in vitro-экспериментах при перемешивании и in vivo [5]. Метод регистрации пространственной динамики роста сгустка основан на контакте крови с тканевым фактором в измерительной кювете с иммобилизованным тромбопластином [6]. Появление и пространственный рост сгустка от активатора регистрируется по светорассеянию методом темного поля. При этом можно измерять такие важные характеристики процесса, как скорость роста, размер сгустка, образование спонтанных сгустков - информацию, которая недоступна гомогенным методам [7]. Это позволяет одновременно и независимо регистрировать нарушения на всех стадиях процесса. Нами установлено также (неопубликованные данные), что in vitro ЦфА в дозе 10 мкг не влияет на внешний и внутренний пути свертывания крови. Однако уже через 10 мин инкубации с ЦфА наблюдалось увеличение уровня анти-Ха-активности плазмы в 8 раз относительно контрольных значений. После инкубации в течение 30 и 60 мин с белком уровень анти-Ха-активности хотя и снижался, но в 3 раза превышал уровень в контроле. Аналогичные данные получены в модельных опытах на животных. Введение ЦфА в дозе 100 мкг интактным мышам Р815 сопровождалось статистически значимым повышением (в 3 раза) уровня ингибирования фактора Ха, а доза 200 мкг приводила к ингибированию фактора Ха, соответствующему 0.6 анти-Ха-Ед/мл. Представленные в данной статье результаты свидетельствуют о том, что ЦфА препятствует росту сгустка, замедляя скорость его образования через ингибирование фактора Ха, а поскольку сгусток начинает расти не сразу и неравномерно, то возникновение тромба менее вероятно, поскольку в организме такой сгусток будет смываться током крови [8]. Система свертывания крови обладает пороговыми и автокаталитическими свойствами, поэтому ее поведение в пространстве может иметь много общего с активными средами. Атауллаханов и Гурия в 1994 г. выдвинули гипотезу, согласно которой пространственное (но не гомогенное) формирование сгустка происходит автоволновым образом [9]. Автоволно-вая фаза роста может быть нарушена при дефиците или ингибировании факторов внутреннего пути свертывания. Автоволновое распространение тромбина не может тормозиться естественными ингибиторами, так как они не способны остановить автоволну в силу их однородного распределения в пространстве. Чтобы это произошло, нужно погасить автокаталитическое производство факторов свертывания. Гипотеза об ав-товолновом распространении процесса свертывания предполагает существование «двухавтоволнового» механизма остановки волны тромбина [10]. Считается, что в среде может запускаться вторая волна вещества, возникающего после появления тромбина и прекращающего его синтез. Если эта волна будет распространяться с большей скоростью, чем первая, то она сможет остановить движение первой волны. К настоящему времени неизвестен ингибитор тромбина, который мог бы распространяться авто-каталитическим образом. Предполагается, что тромбин может существовать в про- и антикоагулянтной формах [11]. В прокоагулянтном состоянии тромбин высокоактивен по отношению к фибриногену и слабо - к белку С; а в антикоагулянтной форме (вследствие изменения конформации тромбина в комплексе с некоторыми веществами) наоборот, высокоактивен в отношении белка С и малоактивен в отношении фибриногена [12]. Наши данные о влиянии ЦфА на пространственную динамику роста сгустка позволяют выдвинуть гипотезу о возможном воздействии ЦфА на механизм автоволнового процесса свертывания крови. ВЫВОДЫ Рекомбинантный человеческий циклофилин А обладает выраженным дозонезависимым антикоагулянт-ным эффектом. Рекомбинантный человеческий циклофилин А способен предотвращать спонтанное тромбообразование. Антикоагулянтный эффект рекомбинантного человеческого циклофилина А сохраняется не более 2 ч.

Об авторах

Ю. A. Морозов

Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН

Автор, ответственный за переписку.
Email: moroz_111@rambler.ru
Россия

Л. M. Хромых

Научно-исследовательский институт канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН

Email: moroz_111@rambler.ru
Россия

И. И. Дементьева

Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН

Email: moroz_111@rambler.ru
Россия

M. A. Чарная

Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН

Email: moroz_111@rambler.ru
Россия

Н. Л. Куликова

ОАО «Институт инженерной иммунологии»

Email: moroz_111@rambler.ru
Россия

Д. Б. Казанский

Научно-исследовательский институт канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН

Email: moroz_111@rambler.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы