Экспрессия генов при пролиферации и дифференцировке гемопоэтических клеток с Ph-хромосомой

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ. Хромосомные аномалии,транслокации, инверсии, делеции и многочисленные мутации приводят к развитию большинства лейкозов ([1-5] и ссылки там). В результате хромосомной транслокации t(9;22)-(q34;q11), возникшей в гемопоэтической (кроветворной) полипотентной стволовой клетке, образуется Филадельфийская хромосома (Ph), которая приво дит к хроническому миелолейкозу (ХМЛ), острому и хроническому лимфолейкозам. В клетках с Ph-хромосомой (P^-клетках) в результате реципрок-ной транслокации 5'-фрагмента гена bcr и 3'-фраг-мента гена abl образуется химерный онкоген bcr/abl, кодирующий активную тирозинкиназу р210/р185, которая участвует в патогенезе ХМЛ. Транслокация приводит к замещению нормальных гемопоэтических клеток Ph+-клетками. В клеточные и молекулярные механизмы патогенеза ХМЛ вовлечены многие гены: bcl2, ряд генов stat и гены, регулирующие клеточный цикл и апоптоз [1-57]. Способность онкогена bcr/abl определять туморогенные свойства, повышать жизнеспособность, активировать пролиферацию и блокировать апоп-тоз в линиях Ph+-клеток изучалась детально [9-7, 42-57]. Обнаружено, что тирозинкиназа р210 bcr/ abl может как подавлять апоптоз, так и не влиять на него. Данные о блокировании апоптоза при ХМЛ остаются противоречивыми [1-5, 42, 44, 45, 47 и наши неопубликованные данные]. Роль апоптоза при пролиферации и дифференцировке Ph+-клеток ранее не изучали. Наши последние исследования показывают, что апоптоз зависит от этапов пролиферации и созревания, а также от типа Ph+-клеток, выделяемых из костного мозга (КМ) и периферической крови (ПК) при ХМЛ [Гринева и др., неопубликованные данные]. Пролиферация и дифференцировка ex vivo трех основных типов Ph+-клеток регулируется при чередовании этапов пролиферации этих клеток (этап 1) и созревания нейтрофилов (этап 2). На этапе 1 скорость пролиферации превышает скорость созревания. На этапе 2, напротив, выше скорость созревания. Чередование этапов и их скоростей поддерживает эффективность пролиферации и дифференцировки Ph+-клеток на оптимальном уровне [1-4] и определяет волновой характер регуляции этих процессов. Цель нашей работы состояла в выяснении роли экспрессии генов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку, апоптоз и клеточный цикл нормальных гемопоэтических клеток, в регуляции этих процессов в Ph+-клетках. Мы изучали кинетику экспрессии генов p53, c-myc, bcr/abl, mdm2, p21, bcl2, bax, bcr, а также генов gapdh и actin в качестве контрольных, и сопоставляли ряды кинетических кривых и закономерности ex vivo пролиферации, диф-ференцировки, апоптоза и распределения в фазах клеточного цикла Ph+-клеток, полученных от больных ХМЛ. Ph+-клетки ХМЛ, состоящие на 90% из гранулоци-тов, примечательны способностью совершать полный цикл пролиферации и дифференцировки подобно нормальным миелоидным клеткам, которых в пуле кроветворных клеток на порядок меньше. Это облегчает изучение закономерностей регуляции пролиферации и дифференцировки и их экстраполяцию на нормальные гемопоэтические клетки. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Использованные материалы: гепарин («Flow», Англия); Limphoprep, среда α-МЕМ («MP Biomedical», США); DEPC, HEPES, Трис, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС), цитрат Na, лаурилсаркозил («ICN», США); краситель трипановый синий, L-глутамин и 2-меркаптоэтанол («Serva», Германия); Триреагент, гуанидинтиоцианат («Sigma», США); RQ1 ДНКаза, свободная от РНКаз, РНКазин, dNTP, бычий сывороточный альбумин (BSA), Taq-полимераза, буфер для обратной транскрипции, обратная транскрипта-за MuMLV («Promega», США); пенициллин и стрептомицин (ОАО «Биохимик», Саранск, Россия); PBS (10 мМ фосфатный буфер + 0.13 М NaCl + 2.7 мМ KCl, pH 7.4) таблетированный (НПO «Эко-сервис», Россия). Олигонуклеотидные праймеры (таблица) синтезированы и очищены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) или HPLC фирмой «Синтол» (Москва). Исследовали Ph+-мононуклеары, выделенные из ПК и КМ больных ХМЛ в хронической фазе до и в процессе лечения, в фазе акселерации и бласт-ного криза. При ХМЛ мононуклеары представлены в основном лейкоцитами и гранулоцитами, поэтому именно эти клетки здесь изучались. Характеристики Ph+-клеток и больных ХМЛ, из ПК и КМ которых выделены мононуклеары, приведены в [2-5]. Типы мРНК bcr/abl: b3a2, b2a2 или e1a2 в Ph+-клетках определены с помощью ОТ-ПЦР [2, 5]. Методы выделения мононуклеаров, анализа пролиферации и дифференцировки Ph+-клеток описаны ранее [1-6]. Суспензию (0.8—1.2) х 106 клеток/мл в среде α-МЕМ, содержащей 10-20% ЭТС, 2 мЫ L-глутамина, 10-4 М 2-меркаптоэтанола, 100 ед./мл пенициллина и 50 ед./мл стрептомицина, 25 hM HEPES-NaOH pH 7.2-7.4, культивировали в строго одинаковых условиях, и отбирали пробы для анализа. Степень апоптоза и распределение культивируемых Ph+-клеток по фазам клеточного цикла анализировали цитофлуориметрически [1-4] в гранулоци-тарном гейте с помощью проточного флуориметра EPICS-XL. Пробы Ph+-клеток (по 5000 клеток), выделенные из КМ и ПК в градиенте плотности фиколла, и пробы, отобранные в процессе культивирования, центрифугировали в течение 7 мин при 600 g и 4оС, промывали PBS и по каплям фиксировали охлажденным 70% этанолом в течение 30 мин при 4оС. Перед измерением взвесь клеток промывали PBS, центрифугировали и инкубировали осадок в 0.5 мл PBS, содержащего пропидий йодид (5 мкг/мл) и РНКазу А (50 мкг/мл), в течение 30 мин при комнатой температуре в темноте. Измерения проводили в проточном флуориметре EPICS-XL. Клетки гранулоцитарно-го гейта анализировали с помощью прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния, одновременно ре 102 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ гистрировали флуоресценцию пика FL2 по амплитуде и площади импульса (это позволяло «отсекать» слипшиеся клетки, конгломераты и обрывки клеток) в линейном и логарифмическом масштабе, определяли клетки, находящиеся в апоптозе. К клеткам, вошедшим в апоптоз, относили частицы FL2-H с ги-подиплоидным набором ДНК, которые формировали пик слева от пика клеток с диплоидным набором ДНК (уменьшение размера клеток не превышало двух порядков). Долю гранулоцитов, находящихся в апоптозе, анализировали в гранулоцитарном гейте, где отсутствуют обрывки клеток. Получали ДНК-гистограммы Ph+-клеток, в тех же пробах анализировали распределение по фазам клеточного цикла (S, G2/M) при помощи компьютерной программы (SFIT-метод) [7, 10]. Для выделения клеточной РНК использовали пробы, содержащие 106 клеток. Каждую пробу лизирова-ли гуанидинизоцианатом согласно [11] с небольшими модификациями [5]. Обработку проб ДНКазой проводили согласно [5]. РНК, выделенную из пробы (106 клеток), отжигали с 50 нг смеси гексамеров в 8 мкл воды (70оС, 10 мин). кДНК синтезировали в течение 1 ч при 37оС в 25 мкл буферного раствора для обратной транскрипции («Promega»), содержащего по 2.5 мкМ каждого из dNTP, 20 ед. акт. РНКазина («Promega»), 20 ед. акт. обратной транскриптазы MuMLV («Promega»). Раствор кДНК хранили при -70°С и быстро использовали для проведения ПЦР. Транскрипцию генов p53, c-myc, bcr/abl, mdm2, p21, bcl2, bax, bcr и контрольных генов gapdh и actin анализировали методом ОТ-ПЦР. ОТ-ПЦР проводили со специфическими праймерами на РНК, выделенной из каждой пробы (таблица), в один или два раунда. ПЦР проводили в 25 мкл раствора, содержащего буфер для ПЦР (50 мМ Трис-HCl pH 8.9, 16 мМ (NH ) SO , 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 мкМ EDTA, 0.14 мг/мл BSA), 2-5 мкл раствора кДНК, 200 мкM каждого из dNTP, 2.5 ед. акт. Taq-полимеразы («Promega») и 75 нг каждого праймера (таблица). ПЦР (30 циклов) проводили по следующей схеме: денатурация - 1 мин, 94°С; отжиг - 1 мин, 56оС для 1-го и 60^ для 2-го раунда; синтез - 3 мин, 72oC. Отжиг проб кДНК генов bcr, p53, mdm2 и bcr/abl проводили при 56oC для внешних праймеров и 60oC для внутренних (таблица). Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в 6% ПААГ. Гели окрашивали бромидом этидия (1 мкг/мл). Интенсивность флуоресценции амплифицированных фрагментов в данное время (Jt) определяли компьютерной денситометрией с помощью программы «Scion Image», учитывая объемы проб для ОТ-ПЦР и электрофореза. Об экспрессии генов судили по результатам ОТ-ПЦР, проведенной на суммарной РНК Ph+-клеток с праймерами, приведенными в таблице. Уровень экспрессии мРНК оценивали по интенсивности флуоресценции (Jt) полос, соответствующих продуктам амплификации кДНК. В качестве внутреннего стандарта использовали уровень экспрессии мРНК gapdh и/или actin в той же пробе. Экспрессию изоформ мРНК bax [9] анализировали с использованием праймеров для амплификации продуктов альтернативного сплайсинга РНК ин-трона 1 (таблица), накопление ПЦР-фрагмента которого коррелирует с ожидаемой экспрессией bax, bcl2 и других генов, а также с кинетикой апоптоза (рис. 1-9). Кинетические кривые экспрессии генов, пролиферации, дифференцировки, апоптоза и распределения P^-клеток по фазам клеточного цикла представляли в полиномиальной аппроксимации. По изменению интенсивности флуоресценции (Jt) судили о положении пиков экспрессии РНК и их максимумов, по Jt/Jgapdh оценивали относительные уровни экспрессии мРНК. Это предполагает возможность сопоставления с результатами точечных измерений уровней экспрессии, широко применяемых в других исследованиях. Для обработки кривых экспрессии генов, пролиферации и дифференцировки клеток применяли полиномиальную аппроксимацию шестой степени на том основании, что кривые имеют волнообразный характер с несколькими максимумами и минимумами и не подчиняются логарифмической и экспоненциальной зависимостям. При этом учитывали следующие возможности и ограничения полиномиальной аппроксимации. Оптимальное число обобщаемых данных равно степени аппроксимации минус единица. Аппроксимацию принимали достоверной на основании точности экспериментальных данных ± 10%, приведенной в работах [1-6] (R2 > 0.81-1). Превышение числа аппроксимируемых точек над показателем степени аппроксимации возможно на один-два пункта. Особое значение в характеристике кинетических кривых имеют точки первого периода роста (пять-восемь точек в наших опытах для отрезка времени 8-10 сут). Отбор проб через 1 сут при ПДК ex vivo соответствует ожидаемому времени развития клеточного цикла животных клеток in vivo, близкому к 1 сут. Пропуск одной-двух точек на вершине пика при известной кинетике (вычисляется и прогнозируется компьютерной программой по началу пика) позволяет построить кинетическую кривую в целом. Для построения кинетических кривых пролиферации и дифференцировки P^-гранулоцитов и их субпопуляций: миелоидных клеток (бластов, про ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 103 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Олигонуклеотидные праймеры для ОТ-ПЦР мРНК, мишень Праймеры, последовательность 5' ^ 3', GenBank Acc.no Фрагмент, п.н. Внешние, отжиг при 56оС, первый раунд Внутренние, отжиг при 60оС, второй раунд bcr/abl Ъ3о,2, b2a2 TGGATGAACTGGAGGCAG NM 005157 (342-361 bp, 20b) TCA CAG GCG TGA TGT AGT T NM 007313 (835-854 bp, 20b) NM_004327 (2896-2913 bp, 22b) (90% гомология) GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC NM 004327 (3227-3248 bp, 22b) GCTTCACACCATTCCCCATT NM 007313 (3477-3496 bp, 20b) NM_005157 (289-308 bp, 20b) 378 b3a2, 303 b2a2 bcr TGGATGAACTGGAGGCAG NM 004327 (2896-2913 bp, 22b) CAGTTTGGCTCAGCTGTGTCCC NM 004327 (3448-3469 bp, 22b) GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC. NM 004327 (3227-3248 bp, 22b) CAGTGGCTGAGTGGACGATGA NM 004327 (3340-3360 bp, 21b) 134 mdm2 ATGTGCAATACCAACATGTC NM 002392 (297-317 bp, 20b) TAGGGGAAATAAGTTAGCAC NM 002392 (1470-1492 bp, 20b) CAAGAACTCTCAGATGAAGATG NM 002392 (1092-1114 bp, 22b) TTGATGGCTGAGAATAGTCTTC NM 002392 (1470-1492 bp, 22b) 401 p53 ATTGGCAGCCAGACTGCCTT NM 000546 (219-238 bp, 20b) GGAACAAGAAGTGGAGAATG NM_000546 (1434-1453 bp, 20b) AGCTACTCCCCTGCCCTCAA NM 000546 (624-643 bp, 20b) GTCTTCCAGTGTGATGATGG NM_000546 (1009-1028 bp, 20b) 405 gapdh GCTTGTCATCAATGGAAATC NM 002046 (300-319bp, 20b) CACGATACCAAAGTTGTCATG NM_002046 (595-615 bp, 21b) 316 bcl2 TGTGGAACTGTACGGCCCCAGCATGC NM 000633 (1087-1113 bp, 27b) GCCTGCAGCTTTGTTTCATGGTACATC NM 000633 (1286-1312 bp, 27b) 226 bax CATCAGGGACTCAGTTGT NC 000019 (522-540 bp, 19b) CACTCCTCAAATCTGTGCCA NC_000019 (764-783 bp, 20b) 262 p21 GCCGGAGCTGGGCGCGGATT NM 07846(42-61 bp, 20b) GGCTTCCTCTTGGAGAAGAT NM 07846 (707-726 bp, 20b) 685 actin, beta (ACTB) GCGGGAAATCGTGCGTGACATT M10277complete CDS (2280-2301 bp, 22b) GATGGAGGTTGAAGGTAGTTTCGTG M10277 complete CDS (2583-2606 bp, 24b) 327 c-myc GAGGCTATTCTGCCCATTTG NM 002467 (440-459 bp, 20b) GGCAGCAGCTCGAATTTCTT NM 002467 (721-740 bp, 20b) 301 миелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов) использовали морфологический анализ. Состав клеток анализировали на мазках (в трех зонах каждого мазка по 100 клеток в каждой). Концентрацию субпопуляций клеток в пробах вычисляли по их содержанию на мазках в пересчете на 106 клеток/мл исходной суспензии [1-6]. Кинетические кривые индексов эффективности (P/D, соотношение скоростей пролиферации и созревания нейтрофилов) получали как соотношение накопления незрелых, пролиферирующих клеток, P (бласты, промиелоциты, миелоциты), и накопления созревающих без деления нейтрофилов, зрелых клеток, D (метамиелоциты, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы) согласно [1-4]. 104 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РЕЗУЛЬТАТЫ Кинетические кривые уровней экспрессии генов (УЭГ) p53, p21, c-myc, bcr/abl, mdm2, bcl2, bax, bcr, участвующих в регуляции клеточного цикла [14, 24, 28, 45-48, 52, 58, 59], апоптоза [3, 14, 16-22, 28, 42, 47, 49, 50, 56, 58, 60], пролиферации и дифференцировки получали при культивировании Ph+-клеток (моно-нуклеаров), состоящих на 95% из миелоидных Ph+-клеток, т.е. при миелопоэзе, изменяющемся при ХМЛ [1-3, 24, 26-28, 42, 43, 46, 48, 51-54, 57-68]. Кинетические кривые экспрессии генов c-myc, p53, bcr/abl, mdm2, p21, bcl2, bax, gapdh, actin, bcr сопоставили с кинетическими кривыми регуляции пролиферации и дифференцировки миелоидных Ph+-клеток трех основных типов, их апоптоза и распределения в фазах клеточного цикла. Кривые УЭГ и ПДК получены из одной пробы для каждой точки. Уровни экспрессии мРНК оценивали по интенсивности флуоресценции (Jt) соответствующих продуктов OT-ПЦР исследуемых генов. Гены gapdh и actin использовали в качестве контрольных. По величине Jt определяли изменения экспрессии генов и положение ее пиков. По величине Jt/Jgapdh судили о соотношении экспрессии генов, но положение пиков, их максимумов и минимумов заметно изменяются вследствие изменений в экспрессии gapdh. Ранее изменения в уровне экспрессии gapdh наблюдали и другие исследователи [55, 56]. Кинетические кривые экспрессии генов сопоставляли с закономерностями пролиферации и диффе-ренцировки субпопуляций гранулоцитов, апоптоза и распределения Ph+-клеток в фазах клеточного цикла при чередовании этапов пролиферации и созревания, регулирующих эффективность этих процессов (индекс Р/D) [1-4] и представленных в полиномиальной аппроксимации. Закономерности регуляции пролиферации и дифференцировки Ph+-клеток изучены ранее [1-6], но здесь они рассмотрены в полиномиальной аппроксимации, так как не подчиняются логарифмической и экспоненциальной зависимости, и кинетические кривые этих закономерностей имеют несколько максимумов и минимумов (рис. 1-9). Закономерности распределения клеток по фазам клеточного цикла, уровень апоптоза и индексы эффективности Р/D, согласно [1-4], различаются у Ph+-клеток трех типов, полученных от больных ХМЛ. Типы клеток, их пролиферация и дифференцировка различаются последовательностью чередования этих этапов, их числом и длительностью. Предположение, что экспрессия генов отражает особенности регуляции пролиферации и дифференцировки Ph+-клеток трех типов, их апоптоза и распределения в фазах клеточного цикла, находит подтверждение в данной работе. Экспрессия генов при пролиферации и дифференцировке P^-клеток типа 1 Ph+-клетки типа 1 характеризуются продолжительным этапом пролиферации (этап 1), скорость которого выше скорости созревания, концентрация незрелых клеток длительно превышает концентрацию зрелых клеток, а индекс P/D1 > 1-20. Эти клетки отличаются повышенным накоплением миелоцитов, промиелоцитов, бластов при низком накоплении созревающих без деления нейтрофилов и их активном апоптозе [1-3]. На рис. 1А-З представлены кинетические кривые экспрессии генов, пролиферации и дифференцировки Ph+-клеток типа 1 из КМ и ПК больных ХМЛ с умеренным пролиферативным потенциалом и индексом P/D = 1-5. Видно, что пики с максимальной и минимальной экспрессией генов в клетках КМ группируются в трех зонах. По величине пиков экспрессию генов в этих зонах можно подразделить на активную и умеренно активную. Активная экспрессия генов bcl2 и bax видна в первой зоне (на 1-2 сут). Во второй зоне в интервале 2-7 сут виден широкий пик сверхэкспрессии p53, mdm2 и p21 с максимумом на 3-5 сут (рис. 1А,Б, клетки КМ). Максимальная экспрессия генов p21, mdm2, p53, actin, gapdh, c-myc снижается в разной степени в том же ряду, достигая своего минимума на 8-9 сут. В 2-й зоне менее активно экспрессируются гены c-myc, bcr/abl, gapdh, actin, bcr. Все гены, кроме bcr/abl, имеют два минимума экспрессии - на 1-2 и 8-9 сут. В Ph+-клетках из ПК гены р53, р21, mdm2, c-myc, bax, bcl2 сверхэкспрес-сируются сходным образом, но пики экспрессии р21, mdm2, c-myc и gapdh заметно уже (рис. 1Д,Е). При пролиферации и дифференцировке клеток сверхэкспрессия генов р21, mdm2 и р53 достигает своего максимума в соответствии с распределением клеток в фазах S и G2/M, т.е. происходит в активно пролиферирующих миелоидных клетках-предшественниках. К концу цикла пролиферации и дифференцировки с гибелью клеток на 6-7 сут (рис. 1В,Ж) экспрессия этих генов несколько снижается, а затем вновь возрастает на 7-8 сут. Экспрессия генов c-myc, bcr/abl и gapdh при этом становится более умеренной. При этом концентрация пролиферирующих - незрелых - клеток значительно больше концентрации нейтрофилов (зрелых). На всем протяжении пролиферации и дифференцировки скорость накопления пролиферирующих клеток превышает скорость накопления созревающих нейтрофилов, и все клетки имеют общий максимум экспрессии генов при высоком содержании незрелых клеток и весьма низком - нейтрофилов. Активная экспрессия генов p53, mdm2, p21 (в меньшей степени c-myc) коррелирует с изменени ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 105 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ями концентрации клеток, регуляцией цикла, а также с изменениями апоптоза клеток на 3-4 и 7-10 сут (рис. 1А-З). Сверхэкспрессию p21, p53, mdm2, умеренную и низкую экспрессию остальных генов (ac-tin, c-myc, gapdh, bcr и bcr/abl) в Ph+-клетках из КМ следует отнести к экспрессии генов клеток проли-феративного пула, которые активно накапливаются в G1- и S-фазах клеточного цикла на 3-4 сут. За это время, по-видимому, протекает G1-фаза с синтезом циклинов и киназ, формированием их ансамблей и фосфорилированием белка Rb, что происходит с участием р21 и белков, отвечающих за прохождение контрольных точек G^S-перехода [23, 24, 58, 64, 67-71]. Наблюдаемая при этом сверхэкспрессия р53 означает, что р53 выполняет свои функции в полном объеме: регулирует транскрипцию, клеточный цикл и его контрольные точки, дифференцировку и апоп-тоз [10-16]. Максимальный апоптоз клеток из костного мозга наблюдается на 4 сут (~30%), а далее лишь немного уменьшается. Минимальный апоптоз выявляется на 1 сут после быстрого уменьшения его доли вначале. В клетках из периферической крови апоп-тоз более интенсивен - с двумя максимумами УЭГ на 1 и 5-6 сут и с минимумом на 2-3 сут (рис. 1,З), что не согласуется с УЭГ bcl2 и bax, отвечающих за апоптоз [13, 14, 16-22]. Экспрессия bcl2, bax в клетках КМ характеризуется двумя пиками с максимумами на 2 сут и минимумом на 4-5 сут, что не соответствует максимумам апоптоза в клетках из КМ и ПК (рис. 1Г,З). Стимулировать апоптоз, как известно, могут также активно экспрессирующиеся гены p21, p53, gapdh, c-myc [10-28, 32, 34, 49-51, 55, 56, 67-69]. Белок р21 является ингибитором циклин-зависимых киназ и медиатором ряда функций р53. Экспрессия р21 отвечает за задержку роста клеток в фазе G1, регуляцию клеточного цикла и апоптоз [23-28, 64, 67, 68, 71]. Если при сверхэкспрессии р21 рост клеток в фазе G1 не задерживается, то дополнительные молекулы р21 индуцируют апоптоз и/или терминацию дифференцировки [24, 64, 68]. Активация апоптоза в ответ на экспрессию р21 происходит здесь на 4 сут при отсутствии в это время экспрессии bcl2 и bax (рис. 1А-Г). Уровень апоптоза в Ph+-клетках ПК во втором пике с максимумом на 5-6 сут существенно выше, чем в клетках из КМ (рис. 1Г,З). Сравнивая УЭГ (рис. 1), можно отметить сходство в характере экспрессии генов р53, bcl2, bax в клетках КМ и ПК, и более узкий пик экспрессии в клетках ПК. Однако в клетках КМ активация экспрессии генов bax > bcl2 с максимумами на 5-6 сут отсутствует и не соответствует второму пику апоптоза, который наблюдается на 4 сут. Предполагается, что в регуляции этого пика в клетках КМ участвует р21 , который, согласно [28, 57, 60], регулирует апоптоз. В клетках ПК в это время сверхэкспрессируется также gapdh (максимум экспрессии на 4-6 сут). Экспрессия gapdh в Ph+-клетках КМ возрастает в несколько раз, как и апоп-тоз (рис. 1Г,З). Сверхэкспрессия mdm2 связана с функциями этого фактора транскрипции, модулирующего свойства многих генов и взаимодействующего с различными факторами роста и факторами транскрипции. Белки mdm2 и р53 взаимодействуют между собой и негативно регулируют экспрессию друг друга [29-36]. Сверхэкспрессия mdm2 модулирует, вероятно, функции р53 и р21, регулирует длительность S- и G2/M-фаз клеточного цикла и повышает пролиферативный потенциал Ph+-клеток при слабой экспрессии гена bcr/abl. Супрессор опухолевого роста р53, активируемый при генотоксическом и клеточном стрессе, защищает нестабильные клетки с помощью экспрессии генов, инициирующих клеточный цикл с торможением пролиферации, арестом апоптоза и репарацией ДНК. При этом р53 и mdm2 взаимно активируют друг друга, одновременно стабилизируются и подвергаются деградации. Активация стрессом по механизму обратной связи ведет к активации р53 и mdm2 [31-36] и защите клеток от гибели. О взаимодействии р53 и mdm2 можно судить по совпадению их кинетических кривых (рис. 1А,Б,Д) с максимумом накопления клеток в S- и G2/M-фазах. Сверхэкспрессию mdm2 можно связать с активацией отложенного перехода клеток в S- и G2 /M-фазы клеточного цикла на 4-6 сут (рис. 1Г,З). Известно, что mdm2 стимулирует неконтролируемый переход клеток в S-фазу [29]. Кроме того, сверхэкспрессия mdm2, непосредственно взаимодействующего с промоторами р53 и р21, приводит к неконтролируемому выходу клеток в S-фазу и к их трансформации [24, 29-31, 67, 68, 71]. Известно, что пролиферация Ph+-клеток активируется экспрессией bcr/abl [43-48]. В данной работе Ph+-клетки из КМ и ПК характеризовались очень низкой экспрессией bcr/abl, существенно меньшей, чем р53, mdm2, p21 и c-myc. Довольно низкие уровни экспрессии bcr/abl находятся в зоне максимальной экспрессии генов р53, mdm2, p21 и даже c-myc на 3-10 сут, что соответствует значениям эффективности пролиферации и дифференцировки, невысоким для Ph+-клеток типа 1 (индексы P/D = 1.2—1.8—0.8). Экспрессия bcr/abl в клетках ПК несколько выше, чем в клетках КМ. В клетках из ПК отмечается максимум - на 5 сут и два минимума - на 1 и 9 сут. В клетках из КМ экспрессия bcr/abl медленно увеличивается к 4-10 сут. Эти различия не отражаются в индексах P/D, которые указывают на сопоставимые скорости 106 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Экспрессия генов Jt, КМ Экспрессия генов Jt/Jgapdh, КМ Пролиферация и дифференцировка Апоптоз и распределение клеток в фазах Д -1Ш 2 4 '-'б 8 10 Время, сут Экспрессия Jt, ПК 2 4 ■ S 8 10 Время, сут Jt / Jgapdh, ПК 4 6 3 Время, сут ♦ mdm2 ♦ gapdh A bcl2 ■ c-myc - Полиномиальный (p21) * Полиномиальный (bax) -Полиномиальный (bcr/abl) · p53 p21 bcr - Полиномиальный (mdm2) - - Полиномиальный (gapdh) ■ ■ Полиномиальный (bcl2) · - Полиномиальный (actin) Ж !6 15 1.Ϊ 0.9 C£ 0.3 0 Пролиферация и дифференцировка P^-клеток, ПК Апоптоз и распределение клеток в фазах клеточного цикла, ПК actin bcr/abl bax ■ Полиномиальный (p53) ■ Полиномиальный (c-myc) ' Полиномиальный (bcr) 2 4 6 8 10 Время, сут Незрелые Миелоциты Зрелые Сегментоядерные P/D (н/з) • Полиномиальный (P/D (н/з)) Полиномиальный (незрелые) * Полиномиальный (миелоциты) Полиномиальный (зрелые) Полиномиальный (сегментоядерные) 2 4 6 Время, сут G2/M S+G2/M Апоптоз S - Полиномиальный (S+G2/M) >■ Полиномиальный (S) ► Полиномиальный (апоптоз) " Полиномиальный (G2/M) А Б В Г З Е Рис. 1. Экспрессия генов p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl, bcr, bcl2, bax, gapdh, actin (А, Б, Д, Е) в Ph+^летках с умеренными пролиферативным потенциалом (индексами P/D) и длительностью пролиферации. Сравнение уровней экспрессии этих генов с кинетическими кривыми пролиферации и дифференцировки Ph+^леток (В, Ж), уровнем апоптоза и распределением клеток в фазах клеточного цикла (Г, З). Измерения кинетических кривых выполнены в каждой пробе из 106 Ph+^леток, выделенных из костного мозга (КМ) (А—Г) и периферической крови (ПК) (Д—З). Уровни экспрессии генов (в условных единицах флуоресценции, Jt) (А, Д) определяли с использованием ОТ-ПЦР на суммарной РНК из 106 клеток и Jt/Jgapdh (Б, Е). Этап пролиферации, концентрация незрелых > зрелых ([нз] > [з]) и индекс P/D = 1.2—1.8 на 0-10 сут. Полиномиальная аппроксимация шестой степени. пролиферации и созревания в клетках из КМ и ПК. По-видимому, низкую экспрессию bcr/abl при высоком содержании клеток в S- и G2 /M-фазах можно объяснить подавлением bcr/abl при сверхэкспрессии генов p53, p21, mdm2, c-myc - основных регуляторов клеточного цикла [10-16, 23-28, 31-36, 51-54, 67, 68]. Экспрессия этих генов необходима также для пролиферации миелоидных клеток и терминации их диффе-ренцировки. Возможно, снижение уровня экспрессии согласуется с понижением концентрации незрелых делящихся клеток. Видно, что в Ph+-клетках из ПК гены экспрессируются более узким пиком, чем в Ph+-клетках из КМ (рис. 1Д-З). В клетках из ПК и КМ экспрессия р53, bcl2, bax начинается сразу и протекает сходным образом, достигая максимума на 2 и 9 сут (bcl2, bax) и на 5 сут (р53). В клетках из ПК гены p21, mdm2, c-myc экспрессируются с задержкой на 3 сут и с максимальным уровнем на 5-6 сут. Затем их экспрессия быстро снижается при более высоком пике апопто-за, чем в клетках из КМ (рис. 1Г,З). Видно, что максимум экспрессии генов p21, р53, mdm2 и c-myc ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 107 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Экспрессия генов клеток из ПК Экспрессия генов Jt/Jgapdh, ПК ПД клеток из ПК ► gapdh ■ bcr/abl " bcr/abl I p53 * bcr · p53 ■■ ■ mdm2 A bcl2 * bcr ■ Полиномиальный (gapdh) Полиномиальный (bcr) Полиномиальный (bcr) ■ Полиномиальный (bcr/abl) ■*““ Полиномиальный (p53) Полиномиальный (p53) Полиномиальный (mdm2) Полиномиальный (bcl2) Полиномиальный (bcr/abl) gapdh mdm2 bcl2 Время, сут *· Незрелые • Бласты ^ Зрелые - Полиномиальный (gapdh) _ ^ /ΓΝ, г '--Полиномиальный (P/D) ■ Полиномиальный (bcl2) π - , λ ' ' Полиномиальный (миелоциты) - Полиномиальный (mdm2) А Миелоциты в Промиелоциты 9 P/D —Полиномиальный (незрелые) •Полиномиальный (зрелые) Полиномиальный (промиелоциты) —Полиномиальный (бласты) А Б В Рис. 2. Экспрессия генов в Ph+-клетках ПК типа 1 с высоким пролиферативным потенциалом, длительной пролиферацией и индексом P/D = 5-12. Кинетические кривые уровней экспрессии генов (УЭГ) p53, mdm2, bcr/abl, bcr, bcl2, gapdh (А, Б), а также пролиферации и дифференцировки (В). Условия обработки проб как на рис. 1. Уровни экспрессии генов по ОТ-ПЦР Jt (А) и Jt/Jgapdh (Б). Продолжительность этапа пролиферации при [нз] > [з] равна 14 сут. Здесь и далее обозначения как на рис. 1. по отдельности соответствует максимальному числу клеток из КМ и ПК в S- и G2/M-фазах (рис. 1Г,З). По-видимому, клетки из ПК синхронизированы в большей степени, чем клетки из КМ. По еоотношению Jt/Jgapdh (рис. 1Б) можно предположить, что экспрессия генов, связанных с пролиферацией клеток из КМ, падает в ряду: mdm2 ~ p21 ~ p53 > actin ~ c-myc > gapdh ~ bcr/abl ~ bcr. На максимуме пиков УЭГ в клетках КМ уменьшаются в 4.5 раза по сравнению с gapdh. В клетках из ПК сверхэкспрессия gapdh сочетается с резким снижением уровней экспрессии других генов, поэтому сравнение в координатах Jt /Jgapdh оказывается здесь бессмысленным. На рис. 1 видно, что экспрессия ряда генов (в том числе bcr/abl) коррелирует с закономерностями пролиферации и дифференцировки, апоптоза и распределения P^-клеток по фазам клеточного цикла. Корреляция между максимальным накоплением пролиферирующих и дифференцирующихся клеток и экспрессией генов означает, что гены p21, mdm2, p53, c-myc, bcr, bcl2 и bax участвуют в регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза Ph+-клеток типа 1. Однако «привязать» экспрессию этих генов к различным видам клеток типа 1 нельзя - они продуцируются общим пиком с одновременным максимумом. На примере P^-клеток типа 1, выделенных из ПК больного ХМЛ во время бластного криза (рис. 2), можно видеть сверхэкспрессию генов bcr > gapdh > bcr/abl с двумя максимумами на 1 и 7-10 сут при минимуме на 4-5 сут. Эти клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом (индекс эффективности P/D = 2-12) и значительным содержанием клеток CD34+ [6]. Широкому пику пролиферации и дифференцировки с максимумом пика бластных клеток на 1-3 сут соответствует весьма умеренная экспрессия р53, mdm2, bcl2 с максимумами на 0.5, 6 и 9 сут и минимумами на 2-4 и 11 сут. При этом концентрация незрелых клеток значительно больше, чем миелоцитов. К 5-8 сут пик незрелых клеток возрастает, однако он уже состоит в основном из миелоцитов. При этом уровень экспрессии гена bcr увеличивается, а bcr/abl падает (рис. 2А-В). Высокие уровни экспрессии bcr/abl (рис. 2А,Б) с двумя максимумами соответствуют профилю индексов P/D, накоплению бластов и миелоцитов в процессе пролиферации и дифференцировки (рис. 2В). Они также отражают начало циклов 1 и 2 пролиферации и дифференцировки с экспрессией генов в ранних миелоидных клетках-предшественниках [6]. Таким образом, пик индекса P/D на 1 сут и распределение экспрессии генов в ряду 108 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ gapdh ~ bcr/abl > bcr >> p53 ~ mdm2 > bcl2 относятся в основном к бластным клеткам (миелоидные клетки-предшественники, примерно на 75% состоящие из бластов и промиелоцитов). Видно, что уровень экспрессии генов р53, mdm2 и bcl2 в 5 раз ниже, чем у генов bcr/abl и gapdh. Возможно, при сверхэкспрессии bcr/abl и gapdh ингибируются гены р53, mdm2 и bcl2, или же снижение экспрессии генов р53 и mdm2 ведет к бесконтрольному делению Р^-клеток. Пик пролиферации и дифференцировки незрелых пролиферирующих клеток на 7 сут состоит в основном из миелоцитов, и экспрессия генов в ряду bcr >> gapdh >> p53 > bcl2 ~ mdm2 > bcr/abl на 4-6 сут также определяется миелоцитами. Экспрессия генов в миелоцитах и нейтрофилах далее также уменьшается, что согласуется с низкой экспрессией многих белков и факторов роста в нейтрофилах [51, 57, 64, 65, 68, 69]. С другой стороны, известно, что белок BCR(64 , сверхэкспрессируемый в Ph+-клетках мышей с ХМЛ, фосфорилируется белком bcr/abl по остатку тирозина, вследствие чего киназная активность онкобелка bcr/abl снижается на 80% [37-40]. Сверхэкспрессия bcr (рис. 2) приводит к существенному, но не полному ингибированию bcr/abl. Максимум пика экспрессии bcr наблюдается на 2 сут раньше пика экспрессии bcr/abl и соответствует высоким индексам P/D = 6-12 и быстрому развитию бластного криза ХМЛ у этого больного [2]. Низкая экспрессия р53 отмечается также в других Р^-клетках в фазе акселерации и бластного криза ХМЛ с высоким пролиферативным потенциалом и индексом P/D = 3-23. Так, на 3 сут обнаруживается экспрессия генов р53, не превышающая 1/3 экспрессии gapdh. В этих клетках уровни экспрессии bcr/abl, mdm2 и bcl2 сопоставимы с gapdh, при том, что экспрессия bcr в 2 раза выше. Р^-клетки с высоким индексом P/D (от другого больного ХМЛ) имеют сходный профиль экспрессии этих генов. Возможно, данные клетки бластного криза ХМЛ несут дефектный р53, хотя мутации в этом гене не типичны для ХМЛ. Итак, Р^-клетки типа 1 при продолжительной пролиферации, концентрации незрелых клеток большей, чем зрелых, и индексе Р/D = 2-20 отличаются по составу и уровню экспрессии генов. Для клеток с индексом Р/D ~ 5-20 характерно повышенное содержание бластных клеток (от CD34+ до промиелоцитов), которым соответствует сверхэкспрессия bcr > gapdh > bcr/abl при пониженной экспрессии р53, bcl2 и mdm, р21< gapdh. Активация bcr/abl в миелоидных клетках-предшественниках сопровождается низкой экспрессией p53, p21, mdm2. В отсутствие контроля, осуществляемого генамирегуляторами пролиферации и клеточного цикла, создаются, по-видимому, благоприятные условия для активной пролиферации клеток bcr/abl+. Возможно, эти Р^-клетки содержат мутантный р53. В Р^-клетках типа 1 с невысоким пролифератив-ным потенциалом, Р/D ~ 1.2-4 и большим содержанием незрелых клеток, чем зрелых, наблюдается умеренная экспрессия bcr/abl при сверхэкспрессии p21, mdm2, p53, bcl2, bax, а также пролиферация и диф-ференцировка, благополучная для данного клона Р^-клеток. Эти гены участвуют в регуляции клеточного цикла, распределение клеток в S- и G2/M-фазах которого представлено широким пиком на 2-5 сут с максимумом на 3 сут. В этот период экспрессируются гены p21, p53 и mdm2 и взаимодействуют p53 и mdm2, контролирующие экспрессию друг друга. В Р^-клетках типа 1 происходит эффективная пролиферация с накоплением незрелых клеток и сверхэкспрессией p21, p53 и mdm2. Зрелые клетки (нейтрофилы), образующиеся в период с 3 по 7 сут, быстро выходят в апоптоз. При этом концентрация зрелых клеток падает почти на порядок, что служит дополнительной причиной уменьшения экспрессии генов в ряду p21> mdm2> p53. По совокупности приведенных данных можно сказать, что в зоне 1 пролиферации и дифференцировки (1-4 сут) клеток типа 1 (рис. 1 и 2) экспрессия генов p21 > mdm2> p53 в 4-4.5 раза выше, чем гена gapdh. Далее на 4-10 сут, когда число клеток в S- и G2/M-фазах падает, уровни экспрессии этих генов уменьшаются в 3, 2.5 и 1.5 раза по сравнению с gapdh соответственно. На 8-9 сут уровни экспрессии этих генов на кинетической кривой имеют близкие минимумы. Экспрессия генов при пролиферации и дифференцировке P^-клеток типа 2 Для Р^-клеток типа 2 на этапе созревания характерно значительное накопление нейтрофилов, особенно сегментоядерных, которые существенно блокируют апоптоз и ингибируют пролиферацию Р^-клеток. Пролиферация и дифференцировка происходят длительно с низкой эффективностью (Р/D2 < 1) и скоростью созревания большей, чем скорость пролиферации, и при большей концентрации зрелых клеток, чем незрелых [1-4]. В Р^-клетках типа 2 (рис. 3А-Г) наиболее активно экспрессируются гены mdm2 > p53, значительно слабее actin ~ gapdh> р21> bcr > с-myc ~ bcr/abl > bax > bcl2 (широкий пик с максимумом на 2 сут), что по длительности и положению максимумов соответствует повышенному (30-40%) накоплению клеток в S-и G2/M-фазах в течение 3-4 сут при низком уровне апоптоза (2-5%, рис. 3Г). Уровни экспрессии генов р21 > с-myc ~ bcr/abl > bax> bcl2 ниже, чем у гена ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 109 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Уровни экспрессии генов Jt, КМ Jt/Jgapdh, КМ mdm2 gapdh p53 bcr/abl ■ p21 •/О bcl2 actin bcr Апоптоз и распределение Ph+'-клеток КМ в о cl Время, сут Время, сут Рис. 3. Экспрессия генов в Ph+-клетках типа 2 из КМ при длительном этапе созревания с низкой эффективностью P/D < 1. Кинетические кривые уровней экспрессии генов (УЭГ) p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl, bcr, bcl2, bax, gapdh, actin (А, Б), а также пролиферации и диф-ференцировки (В), апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) Ph+^леток КМ при [з] > [нз]. Детали обработки проб как на рис. 1. Уровни экспрессии генов Jt (А) и Jt/Jgapdh (Б). А Б Г gapdh. Ко времени максимума продукции миелоцитов (4-5 сут) экспрессия генов mdm2 > p53 приближается к минимуму (4 сут). При этом в течение всего времени наблюдения (5 сут) концентрация нейтрофилов в ~ 2 раза выше, чем миелоцитов, что согласно [1, 3] заметно тормозит накопление незрелых клеток - ингибирует пролиферацию в течение 1-5 сут. Несмотря на большее накопление нейтрофилов, чем незрелых, при совпадении по времени их максимумов и высокого содержания клеток в G2/M + S-фазах (~ 40%) экспрессия mdm2 > p53 > gapdh остается значительной. В этих условиях уровни экспрессии gapdh, ac-tin, р21, bcr, с-myc, bax мало изменяются, а уровень bcl2 составляет не более половины от уровня gapdh; у остальных генов этот показатель еще ниже. Таким образом, нейтрофилы и миелоциты при высоком их содержании мало влияют на экспрессию этих генов. Уровни экспрессии генов р21, bcr, с-myc, bcl2, bax в клетках типа 2 в 2-5 раза ниже, чем в клетках типа 1. Это позволяет отнести сверхэкспрессию генов р53 и mdm2 в Р^-клетках типа 2 к пролиферирующим клеткам в S- и G2/M-фазах, а не к миелоцитам и нейтрофилам на этапе созревания. При этом уровни экспрессии mdm2 и р53 в S- и G2/M-фазах клеток обоих типов сходны и составляют 4.5 и 2-3 относительно gapdh. Максимальные уровни экспрессии bcr/abl и bcl2 соответствуют максимуму пика миелоцитов. В случае bcr/abl максимум отвечает максимальному накоплению миелоцитов, росту индексов Р/D на 4 сут и максимальной экспрессии bcr/abl > gapdh на 4-5 сут. Экспрессия bcr/abl снижается одновременно с накоплением нейтрофилов и возрастает примерно в 2 раза с продукцией миелоцитов. Низкие уровни bax и bcl2 соответствуют низкой доле апоп-тоза, особенно при bcl2 > bax, когда bcl2 блокирует апоптоз. Другими словами, миелоциты и нейтро-филы характеризуются низкой экспрессией генов gapdh ~ actin > bcr, р21, bax, mdm2, p53 и c-myc, тогда как уровень экспрессии гена bcr/abl достигает своего максимума в миелоцитах (рис. 3А-В). 110 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Рис. 4. Кинетические кривые уровней экспрессии генов (УЭГ) p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl, bcl2, bax, gapdh, actin (А, Б), а также ПДК (В), апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) для Ph+^леток типа 3 из ПК с чередованием этапов пролиферации и дифференцировки по схеме 1/2. Уровни экспрессии генов Jt (А) и Jt/Jgapdh (А, Б). Этап пролиферации на 0-3 сут с [нз] > [з], этап созревания с [з] > [нз] на 3-6 сут. Уровни экспрессии генов, Jt, ПК Jt/Jgapdh, ПК mdm2 ■ p53 щ bcr/abl Щ p21 A bcl2 <■ c-myc . bax • actin ♦ gapdh Полиномиальный (mdm2) Полиномиальный (p21) — Полиномиальный (bcl2) Полиномиальный (bax) —— Полиномиальный (bcr/abl) Полиномиальный (c-myc) —— Полиномиальный (actin) — Полиномиальный (gapdh) Полиномиальный (p53) Апоптоз и распределение Ph'''-клеток о cl Миелоциты Сегментоядерные P/D - Полиномиальный (зрелые) - Полиномиальный (миелоциты) - Полиномиальный (сегментоядерные) р Метамиелоциты « Бласты Полиномиальный (P/D) Полиномиальный (незрелые) — Полиномиальный (метамиелоциты) — Полиномиальный (бласты) ‘ Апоптоз G2/M - Полиномиальный (S+G2/M) - - Полиномиальный (G2/M) ■ S S+G2/M - Полиномиальный (S) - Полиномиальный (апоптоз) А Б Г Экспрессия генов при пролиферации и дифференцировке P^-клеток типа 3 Регуляция пролиферации и дифференцировки Р^ -клеток типа 3 зависит от последовательности этапов чередования и от схемы чередования: 1/2/1или 2/1/2, т.е. с какого этапа - пролиферации (1) или созревания (2) - начинается их чередование. Согласно [1-4] пролиферация и созревание протекают параллельно, однако с повышенной скоростью начинающего этапа чередования по сравнению с последующим. Максимуму скорости пролиферации соответствует минимум скорости созревания и наоборот. В точках пересечения кривых накопления незрелых клеток и нейтрофилов скорости этапов одинаковы и равны 1. Таким образом, чередование этапов определяет волновой процесс пролиферации и дифференцировки клеток. Чередование этапов по схемам 1/2/1 или 2/1/2 различается не только поочередным повышением скорости (либо пролиферации, либо созревания), но также ингибированием пролиферации высокими концентрациями нейтрофилов при [з] >> [нз] [1-4]. Характер экспрессии генов в Р^-клетках, так же как их пролиферация и дифференцировка, зависит от последовательности этапов чередования и от его начального этапа. Экспрессия генов при чередовании пролиферации и созревания по схеме 1/2/1 На рис. 4А-Г видно, что активная экспрессия генов совпадает с максимумами распределения клеток в фазах G2/M + S и индексов Р/D (максимум на 2-3 сут, рис. 4В,Г). На этапе 1 (0-3 сут) скорости пролиферации и созревания различаются незначительно (по накоплению незрелых и нейтрофилов) без выраженного максимума (рис. 4В). Примерно на 3 сут (после пересечения кривых накопления незрелых и зрелых клеток) этап пролиферации (Р/D = 1.4—1.1 и концентрация незрелых выше, чем зрелых) переходит в этап созревания (3-6 сут) с максимумом накопления нейтрофилов и их компонентов: метамиелоцитов, сегментоядерных, палочкоядерных, и снижением индексов эффективности (Р/D2 < 1). При этом на этапе 2 концентрация нейтрофилов существенно (в 4 раза) увеличивается, достигая максимума на 5 сут, а незрелых и миелоцитов возрастает всего на ~ 20% и также достигает максимума на 5 сут. ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 111 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ При этом зрелых клеток в 3 раза больше, чем незрелых (низкий уровень апоптоза - 3-7%, рис. 4В,Г). Видно, что накопление клеток в S-фазе на 5 сут сопровождается незначительным повышением их апоптоза, которое не приводит к увеличению содержания клеток в G2/M-фазе (рис. 4Г). Видно также, что 4-кратное увеличение содержания нейтрофилов заметно ингибирует пролиферацию на этапе созревания. На рис. 4А-Г можно видеть, что этапу пролиферации (1) на 2-3 сут соответствуют максимумы экспрессии mdm2 > p53 > bax > p21, минимумы bcl2 > c-myc >> bcr/abl, а также первый максимум S-фазы, максимумы G2/M, S+G2/M и индекса Р/D. На 0.5 сут видны первый максимум экспрессии bcr/abl, минимумы р53, mdm2, bax и максимумы bcl2, c-myc. Этапу созревания (2) на 3-6 сут (максимум зрелых >> незрелых > метамиелоцитов > сегментоядерных >> бластов и небольшой максимум апоптоза) соответствуют минимумы экспрессии p53 > p21 >> bax, mdm2 на 4-5 сут, минимумы клеток в G2/M-, G2+S-фазах и Р/D на 5-6 сут, а также максимумы экспрессии bcr/abl и bcl2. При этом пику 2 непроизводительной S-фазы (не ведущей к G2/M) на 4-6 сут соответствуют максимумы c-myc и G2+S и второй минимум Р/D на 5-6 сут, а также минимумы экспрессии p53 ~ p21>> bax и минимум G2/M на 4-5 сут. Уровни экспрессии генов (рис. 4А,Б) на первом этапе (2-3 сут) снижаются в ряду: mdm2 >> p53 > bax ~ gapdh ~ p21 ~ bcl2 > bcr/abl, а экспрессия генов bcl2, c-myc > bcr/abl достигает минимума. На этапе 2 (на 5 сут) видны максимумы экспрессии bcr/abl ~ bcl2 > gapdh и повышение уровней actin, p53 ~ p21, а также c-myc при минимальном уровне bax. Сверхэкспрессия mdm2 >> p53 >> bax > gapdh, максимум которой наблюдается на 2 сут, соответствует максимальному числу клеток в S- и G2/M-фазах. При этом с завершением пролиферации и переходом к созреванию экспрессия р53 и mdm2 резко падает, а bcr/ abl и bcl2 возрастает. На этапе созревания по уровню максимальной экспрессии (4-6 сут) гены располагаются в ряду: bcr/abl ~ bcl2 > gapdh ~ actin ~ p21 ~ c-myc. Максимальные уровни экспрессии bcr/abl и bcl2 наблюдаются при незначительном накоплении незрелых и миелоцитов на 5 сут. При экспрессии bcl2 >> bax апоптоз блокирован (он составляет 2-4% и на 5-6 сут не превышает 7%). Это подчеркивает роль сверхэкспрессии bcl2 по сравнению с низкой экспрессией bax в таком значительном подавлении апоптоза (рис. 4А,Г). В случае bcl2 > bax или асинхронности максимумов и минимумов их экспрессии также наблюдалось ингибирование апоптоза в Ph+-клетках типа 1 и 2. Повышение уровней экспрессии ряда генов к 5-6 сут можно считать предвестником этапа пролиферации, следующего за этапом созревания. На этапе пролиферации, когда содержание пролиферирующих клеток едва превосходит содержание нейтрофилов, сверхэкспрессия в ряду mdm2 >> р53> bax > gapdh соответствует максимуму пролиферирующих клеток в S- и G2/M-фазах, а на этапе созревания появляются небольшие максимумы экспрессии bcr/abl ~ bcl2 > gapdh. Уровни экспрессии остальных генов ниже, чем у gapdh на этапах и пролиферации, и созревания. Экспрессия генов mdm2 и р53 резко увеличивается на этапе пролиферации и быстро уменьшается на этапе созревания в соответствии с долей клеток в фазе G2/M. Это означает, что экспрессия гена mdm2 значительна в пролиферирующих клетках, но низка или отсутствует в ней-трофилах. Активная экспрессия mdm2, вероятно, может служить маркером этапа пролиферации и активации клеток в фазе G2/M клеточного цикла. Такой же характер изменения максимумов экспрессии mdm2, р53 и р21, совпадающих с максимумом клеток в фазе G2/M (рис. 5), отмечается и на этапе созревания с чередованием 2/1. Экспрессия bcr/abl имеет два максимума (рис. 4А,Б). На этапе пролиферации с незначительным превышением незрелых клеток над зрелыми, максимум bcr/abl1 < gapdh. Однако на этапе созревания, при высокой концентрации зрелых и их значительном превышении над незрелыми, экспрессия максимальна в ряду bcr/abl2 > gapdh и bcr/abl1 < bcr/abl2 (рис. 4А-В). Отметим, что и здесь при пролиферации и созревании Ph+-клеток с чередованием этапов 1/2 экспрессия bcr/abl возрастает при снижении УЭГ р53, mdm2 и p21. В Ph+-клетках типа 2 и 3 уровень экспрессии bcr/abl1 < bcr/abl2(рис. 3 и 4). В Ph+-клетках типа 1 можно встретить и bcr/abl1 < bcr/abl2, и bcr/abl1 > bcr/abl2. Таким образом, экспрессия генов коррелирует с регуляцией пролиферации и дифференцировки Ph+-клеток типа 3 с чередованием пролиферации и созревания по схеме 1/2. И в этом случае повышенная экспрессия р53, mdm2 и р21 совпадает с максимумом фаз S+G2/M и соответствует низкой экспрессии bcr/abl. Экспрессия генов P^-клеток c чередованием этапов по схеме 2/1/2 При чередовании пролиферации и созревания по схемам 2/1 — 2/1/2/1 концентрация Ph+-клеток типа 3 последовательно изменяется в ряду: [з] > [нз] ^ [нз] > [з] ^ [з] > [нз] (рис. 5-9). На рис. 5 и 6 видно, что уровни экспрессии генов при созревании и пролиферации соответствуют низкому содержанию пролиферирующих клеток в фазах клеточного цикла (10-20%) при значительной индук- 112 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Jt RT-ПЦР РНК клеток из ПК Jt/Jgapdh, ПК p53 actin bax - Полиномиальный (gapdh) — Полиномиальный (bcl2) Время, сут Á mdm2 bcr/abl Полиномиальный (p53) Полиномиальный (actin) Полиномиальный (bax) p21 c-myc - Полиномиальный (p21) - Полиномиальный (bcr/abl) gapdh bcl2 - Полиномиальный (mdm2) - Полиномиальный (c-myc) В Пролиферация и дифференцировка Ph+'-клеток ПК ϊ Í о Апоптоз и распределение Ph+'-клеток ПК о cl Время, сут Время, сут Рис. 5. Уровни экспрессии генов p53, р21, mdm2, c-myc, bcr/abl, bcl2, bax, gapdh, actin (А, Б), а также кинетические кривые ПДК (В), апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) Ph+^леток типа 3 из КМ с чередованием этапов по схеме 2/1/2. Детали на рис. 1. Уровни экспрессии генов Jt (А) и Jt/Jgapdh (Б). Этапы созревания при [з] > [нз] на 0-3 и 6 сут; этап пролиферации с [нз] > [з] на 3-6 сут. А Б Г ции апоптоза (40-80%). При этом высокое содержание неспособных к делению нейтрофилов на этапе созревания ведет к уменьшению пролиферативного пула клеток в фазах S+G2/M, особенно заметному на рис. 6, и этот пул не увеличивается при пролиферации на 2-6 сут. Возможно, максимум клеток в этих фазах не совпадает со значительным накоплением незрелых на этапе пролиферации. Однако созревающие без деления нейтрофилы, естественно, уменьшают накопление пролиферирующих клеток в фазах S и G2/M, при этом в них снижается экспрессия генов, активность которых существенно повышена в пролиферирующем пуле клеток в фазах S + G2/M. Здесь уровни экспрессии исследованных генов существенно ниже, чем в предыдущих примерах, в том числе относительно gapdh. При пролиферации и дифференцировке Ph+-клеток, начинающейся с этапа созревания, при значительном накоплении нейтрофилов с их ин гибированием пролиферации на 0-3 сут (рис. 5 и 6) максимум накопления нейтрофилов соответствует минимумам индекса эффективности Р/D и накопления незрелых и миелоцитов. При переходе к этапу пролиферации на 3-5 сут видны минимумы накопления зрелых, рост Р/D и минимумы накопления нейтрофилов. При этом концентрации зрелых и незрелых в их максимумах отличаются в 4-5 раз, что позволяет вполне корректно отнести экспрессию генов к нейтрофилам или соответственно к миелоцитам, уже не способным делиться. На этапе созревания (рис. 5А-Г) максимальная экспрессия р21, mdm2, p53 > bcl2 > bax на 2 сут принадлежит не нейтрофилам, а пролиферирующим клеткам в S- и G2/M-фазах (20%), поскольку при повышении накопления миелоцитов в 5 раз на этапе пролиферации на 5 сут экспрессия этих генов не только не увеличивается, но снижается до минимальных значений. ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 113 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Уровни экспрессии генов, Jt, ПК Jt/Jgapdh, ПК p53 bcr/abl — Полиномиальный (p53) - Полиномиальный (bax) actin bcl2 - Полиномиальный (p21) - Полиномиальный (bcl2) Время, сут gapdh - bax - Полиномиальный (gapdh) - Полиномиальный (bcr/abl) p21 - c-myc - Полиномиальный (c-myc) - Полиномиальный (actin) Апоптоз и распределение Ph+'-клеток Рис. 6. Экспрессия генов p53, p21, c-myc, bcr/abl, bcl2, bax, gapdh, actin (А, Б), а также кинетические кривые ПДК (В), апоп-тоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) Ph+^леток ПК типа 3 с чередованием по схеме 2/1. Детали на рис. 1. Уровни экспрессии генов Jt (а) и Jt/Jgapdh (Б) для ОТ-ПЦР (проба 106 клеток). Этап созревания с 0-3 сут при [з] > [нз], этап пролиферации с 3-6 сут при [нз] > [з]. А Б Г Максимальный уровень экспрессии генов bcr/abl, actin, gapdh, c-myc, наблюдаемый на 5 сут, относится уже к миелоцитам (Р/D2 = 2.5). Два пика экспрессии bcr/abl (относительно gapdh, рис. 5А,Б) при пролиферации миелоцитов в 2 раза больше, чем при созревании нейтрофилов (на 5 и 0.5 сут). На этапе созревания (на 2 сут) видны также минимумы экспрессии генов gapdh > actin > bcr/abl. Это означает, что экспрессия генов, регулирующих клеточный цикл в пролиферирующих незрелых клетках, активируется и на этапе созревания в соответствии с максимумом клеток в фазах S и G2/M, но уровень экспрессии в 2-3 раза ниже, чем в Р^-клетках типа 1 и 2. На рис. 5 уровни экспрессии генов р21 ~ mdm2 ~ p53 > gapdh выше, чем на рис. 6. Из рис. 6 видно, что на этапе созревания содержание клеток в фазах S + G2/M в 2 раза меньше, а нейтрофилов в 5 раз больше, чем незрелых, при значительно большем количестве сегментоядерных нейтрофилов. То есть, чем выше содержание нейтрофилов, тем меньше клеток накапливается в фазах S и G2/M и тем ниже относительные уровни экспрессии генов р21, mdm2, p53 и gapdh (рис. 5 и 6). На этапе пролиферации с максимумом пика миелоцитов (на 5 сут) только у генов bcr/abl и actin уровни экспрессии выше, чем у gapdh, а у p53 > c-myc > bax > mdm2 > p21 они ниже. Два максимума экспрессии gapdh коррелируют с максимумами апопто-за (рис. 5А,Б,Г). На рис. 6А,Б,Г видно, что на 2-4 сут только р53 и bcl2 экспрессируются активнее gapdh. Максимум экспрессии генов р53 > gapdh >> mdm2 > p21 на 2-4 сут соответствует также максимуму широкого пика апоптоза (на 2-5 сут). Это отличается от умеренной экспрессии gapdh в ранее обсуждаемых примерах пролиферации и дифференцировки без чередования этапов и, вероятно, связано с участием gapdh в индукции апоптоза с максимумом на 1 и 5 сут. Отметим, что экспрессия p53, c-myc и bcl2, 114 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ минимальная на этапе пролиферации на 3-6 сут, составляет 0.5-0.7 от максимального уровня экспрессии gapdh (рис. 6). На рис. 6 видно, что максимумы экспрессии генов р53 > mdm2 > p21 на 2-4 сут соответствуют также максимуму широкого пика апоптоза (на 2-5 сут). Известно, что экспрессия p21, p53, gapdh и c-myc может отвечать за индукцию апоптоза [13-16, 20, 21, 28, 55, 56]. На этапе пролиферации на 3-6 сут в отсутствие экспрессии bax и bcl2 апоптоз индуцируется, очевидно, с участием генов gapdh, p21 и p53 (рис. 5 и 6). Отметим, что уровень экспрессии bcr/abl на 0.5-1 сут соответствует максимальному кратковременному накоплению миелоцитов и незрелых клеток-предшественников миелоцитов. Экспрессия генов, достигающая максимума на 0.5 сут, изменяется в ряду р53 > gapdh > actin > bcr/abl. Уровень экспрессии гена bcr/abl на 0-1 сут в 2 раза ниже, чем на 5 сут, что также связано с ингибированием пролиферации Ph+-клеток при повышенной концентрации нейтро-филов (рис. 5 и 6). Таким образом, относительные изменения уровней экспрессии генов в Ph+-клетках соответствуют чередованию этапов по схеме 2/1 (от созревания к пролиферации). Экспрессия генов согласуется с ингибированием пролиферации незрелых клеток нейтрофилами, созревающими без деления. Экспрессия генов на этапе созревания с максимальным содержанием нейтрофилов (в виде сегментоядерных при небольшой доле пролиферирующих клеток в фазах S и G2/M) в несколько раз ниже, чем в Ph+-клетках типа 1-3 с максимумом пула про-лиферативных клеток. В этих случаях экспрессия генов однозначно повышена в активно пролиферирующих клетках в фазах S и G2/M. При этом ней-трофилы, как неделящиеся клетки, в этих фазах отсутствуют. Низкая экспрессия исследуемых генов в самих нейтрофилах видна на этапах созревания Ph+-клеток типа 2 и 3 (рис. 3-6), что согласуется с пониженной продукцией в нейтрофилах многих белков и факторов роста [51, 57, 64, 65, 68, 69]. Видно (рис. 6), что в клетках типа 3 с чередованием этапов 2/1 на этапе созревания при повышенном содержании нейтрофилов понижены уровни экспрессии всех генов. Уровни экспрессии генов p21 ~ mdm2 ~ p53 > gapdh > c-myc при созревании в 3-5 раз ниже, чем на этапе пролиферации (рис. 5 и 6). При этом изменяется характер экспрессии р21 и mdm2. Пики их экспрессии, достигающей максимума на 1 или 2 сут, сужаются, а затем снижаются до минимума в соответствии с завершением фаз S и G2/M клеточного цикла по времени. Отметим, что на этапе пролиферации с накоплением миелоцитов существенно повышается экспрессия bcr/abl. На этапе созревания нейтрофилов экспрессия bcr/abl в ~ 2 раза ниже, чем при накоплении миелоцитов. На этапе пролиферации экспрессия bcr/abl зависит от вида и концентрации пролиферирующих миелоидных клеток-предшественников (бластов), экспрессия bcr/abl в которых, возможно, подавляется активной экспрессией р53, mdm2 и p21. Дополнительно к ингибированию пролиферации в Ph+-клетках типа 3 с чередованием 2/1 на этапе созревания происходит ингибирование экспрессии bcr/abl до минимума - в 1.5-3 раза ниже gapdh (рис. 5-6). При этом в нейтрофилах в максимуме созревания (1-2 сут с сегментоядерными нейтрофилами, составляющими основное содержание) заметно экспрессируются только gapdh и actin. Минимальные уровни c-myc, bcr/abl, p53 > p21 > bcl2 > bax в 2-10 раз ниже, чем у gapdh (рис. 6А,Б), что согласуется с низким содержанием клеток в фазах S и G2/M (< 12%). При длительном чередовании этапов 2/1/2/1 Ph+-клеток с очень низким содержанием в фазах S и G2/M (от 5 до 2%) и активном апоптозе экспрессия генов также коррелирует с чередованием этапов созревания и пролиферации. При этом экспрессия генов bcr/abl > gapdh > c-myc повышена, а у генов mdm2, p53, bcl2 остается на низком уровне и при созревании, и при пролиферации (рис. 7А,Б). Экспрессия гена bcr/abl характеризуется двумя пиками, большими, чем у гена gapdh и bcr/abl1 > bcr/abl2 на этапах созревания и пролиферации соответственно (рис. 7). Этап созревания с высоким накоплением нейтрофилов сопровождается экспрессией bcr/abl > gapdh > c-myc > p53 > mdm2, которая к 5 сут стремится к минимуму. На этапе пролиферации (5-7 сут) уровни экспрессии снова возрастают до максимума (на 7-8 сут) и затем снижаются с четкой очередностью. Так максимумы и минимумы накопления Ph+-клеток при созревании и пролиферации чередуются так же, как максимумы и минимумы экспрессии генов в ряду c-myc, bcr/abl, gapdh, р53. При этом им соответствуют высокие уровни экспрессии генов bcr/abl и c-myc и очень низкие - bcl2 и mdm2. Быстро растущее накопление нейтрофилов приводит к подавлению пролиферации незрелых и экспрессии их генов и снижению содержания клеток в S- и G2-фазах до 3-5% (рис. 7В,Г). Последовательность этих событий отражается на уровне экспрессии генов в ряду: c-myc ~ gapdh ~ bcr/abl > р53 > mdm2 на 1-9 сут (рис. 7А-Г). В другом примере Ph+-клеток из КМ (рис. 8) с чередованием этапов 2/1/2/1 при повышенном содержании клеток в S- и G2-фазах (~ 30%, с двумя их максимумами на 2 и 6 сут) видны два максимума экспрессии ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 115 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Уровни экспрессии генов, Jt, клеток КМ Jt/Jgapdh, КМ ■ bcr/abl •/о actin — Полиномиальный (actin) Время, сут Р p53 ♦ gapdh - Полиномиальный (mdm2) - á bcl2 —— Полиномиальный (p53) -_ Полиномиальный (gapdh) 9 - mdm2 - Полиномиальный (bcr/abl) · ■ Полиномиальный (bcl2) 4 c-myc —— Полиномиальный (c-myc) ПД Ph+-клеток КМ Г Апоптоз и распределение Ph+-клеток КМ в S + Gl/M-фазах клеточного цикла о cl Рис. 7. Экспрессия генов p53, mdm2, c-myc, bcr/abl, bcl2, gapdh, actin (А, Б), а также кинетические кривые ПДК (В), апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) в Ph+^летках типа 3 из КМ с чередованием этапов по схеме 2/1/2/1. Детали на рис. 1. Уровни экспрессии генов Jt (А) и Jt/Jgapdh (Б). Этапы созревания 0-5 и 6-8 сут с [з] > [нз], этапы пролиферации на 5-6 и 8 сут при [нз] > [з]. А Б В генов: первый на этапе созревания: р21 > bax ~ c-myc ~ actin >> bcr/abl и gapdh ~ bcl2 ~ p53 > mdm2; второй на этапе пролиферации: с-myc ~ р21 >bax >> bcr/abl > actin и gapdh > mdm2 > p53 > bcl2. Второй максимум уровней экспрессии р21 > bax ~ c-myc на порядок выше первого. В Ph+-клетках из ПК (рис. 9) от того же больного ХМЛ экспрессия генов р21 > bax ~ c-myc была значительно ниже уровней экспрессии в клетках из КМ (рис. 8) и оставалась высокой на этапе пролиферации при трехкратном накоплении нейтрофилов ПК на этапе созревания. То есть при значительном накоплении нейтрофилов подавляется экспрессия генов на этапах созревания даже с повышенным содержанием клеток в фазах S + G2/M. Результаты, представленные на рис. 7-9, примечательны тем, что рис. 7 показывает влияние длительного избытка нейтрофилов над незрелыми на экспрессию генов и на полное подавление пула пролиферирующих клеток в S + G2/M-фазах при низком уровне апоптоза. А на рис. 8-9 видно подавление нейтрофилами экспрессии генов на этапе созревания при совпадении существенного максимума клеток в S + G2/M-фазах (30%). Однако при пере ходе к пролиферации со значительным накоплением незрелых пролиферирующих клеток в условиях 50-80% индукции апоптоза (до того 10-20%) образуется второй максимум накопления пролиферирующего пула в фазах S+G2/M. При этом экспрессия генов р21 > bax ~ c-myc > bcr/abl > mdm2 возрастает на порядок при минимумах p53 > bcl2. Другими словами, нейтрофилы способны подавлять и задерживать образование пула пролиферирующих клеток в фазах клеточного цикла и/или подавлять экспрессию соответствующих генов. В этих терминах можно также интерпретировать и результаты, представленные на рис. 4-6. Итак, при пролиферации и дифференцировке с чередованием этапов 2/1 - 2/1/2/1 экспрессия генов в нейтрофилах и миелоцитах согласуется с типами клеточной регуляции чередованием этапов, апоптоза и распределения Ph+-клеток ХМЛ в фазах клеточного цикла. Это также дополнительно свидетельствует о блокировании нейтрофилами апоптоза и ингибировании пролиферации Ph+-клеток. Уровни экспрессии генов на этапах созревания определяются максимальным накоплением клеток в S- и G2/M-фазах клеточ- 116 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Уровни экспрессии генов, Jt, в РІі+-клетках КМ Уровни экспрессии генов, Jt, в РІі+-клетках КМ Время, сут Jt/Jgapdh, КМ ♦ gapdh A bcl2 — Полиномиальный (gapdh) — Полиномиальный (p53) Д Время, сут Jt / actin, KM Время, сут mdm2 A bax ■ p53 r ■ bcr/abl Полиномиальный (bcl2) _ Полиномиальный (p21) Полиномиальный (mdm2) ~— Полиномиальный (bax) В Апоптоз и распределение Ph+^леток КМ в S + Gl/M-фазах клеточного цикла nP о4 * О О Время, сут c-myc - Полиномиальный (c-myc) - Полиномиальный (actin) - Полиномиальный (bcr/abl) 0 12 3 Время, сут *—незрелые —ώ—зр I- P/D (н/з) А Б Г Рис. 8. Кинетические кривые уровней экспрессии генов p21, c-myc, bcl2, p53, mdm2, bcr/abl, bax, gapdh, actin (А, Б, Г, Д), а также ПДК (E), апоптоза и распределения в фазах клеточного цикла (В) Ph+- клеток из КМ типа 3 с чередованием этапов по схеме 2/1. Детали на рис. 1. Jt (А, Б), Jt/Jgapdh (Г, Д). Этап созревания с [з] > [нз] на 0-3 сут, этап пролиферации с [нз] > [з] на 3-7 сут. ного цикла и ингибированием пролиферации нейтро-филами. Совпадение максимумов накопления клеток в S + G2/M-фазах и на этапе пролиферации указывает на их значение в повышании уровней экспрессии генов р21, mdm2, p53, bax, c-myc в 1.5-7 раз. В нейтрофилах на этапе созревания уровни экспрессии остальных генов в 2-10 раз ниже, чем у гена gapdh. Это сопоставимо с уровнями экспрессии в клетках 2-го типа и в 5-10 раз ниже, чем в незрелых клетках первого типа. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В полученных от больных ХМЛ гемопоэтических клетках, содержащих Р^хромосому и онкоген bcr/abl, определены кинетические кривые экспрессии 10 генов, регулирующих пролиферацию и диф-ференцировку, клеточный цикл и апоптоз. Экспрессия основных регуляторов клеточного цикла - р53, mdm2, p21, c-myc, bcr/abl, bax, bcl2 и gapdh, в диф ференцирующихся пролиферирующих миелоидных Ph+-клетках и нейтрофилах, созревающих без деления, коррелирует с регуляцией процессов пролиферации и дифференцировки, с индукцией апоптоза и распределением клеток в фазах клеточного цикла ex vivo. Сравнение кинетики экспрессии генов и закономерностей регуляции пролиферации и дифферен-цировки Р^-клеток ex vivo с функциями этих генов показало, что эти гены участвуют в регуляции пролиферации и дифференцировки ex vivo Ph+-клеток трех основных типов, а также в чередовании пролиферации (1) и созревания (2). Определенные нами уровни экспрессии генов можно считать оценочными, выявляющими тенденцию, поскольку данные ОТ-ПЦР сравнивали с уровнями экспрессии gapdh и actin, которые также изменяются (измеряли в тех же пробах) в ходе культивирования, а не применяли внутренние стандарты на каждый ген. ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 117 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ А Уровни экспрессии генов, Jt, в Ph+^летках ПК Время, сут Jt/Jgapdh, ПК Время, сут ♦ gapdh A bcl2 —— Полиномиальный (gapdh) -—— Полиномиальный (p53) ■ Уровни экспрессии генов, Jt, в РІі+-клетках ПК -mdm2 _ -p53 - Полиномиальный (mdm2) ■ Полиномиальный (bcl2) Время, сут - actin bax bcr/abl Время, сут * p21 Апоптоз и распределение РІі+-клеток ПК в S+Gl/M-фазах клеточного цикла Время, сут 4 Апоптоз 4 G2/M ■* S Я S+G2/М - Полиномиальный (апоптоз) - Полиномиальный (G2/M ) - Полиномиальный (S) — Полиномиальный (S+G2 /М) ПД РІі+-клеток ПК Время, сут c-myc - Полиномиальный (p21) - Полиномиальный (bcr/abl) — Полиномиальный (actin) ώ Зрелые 4 Миелоциты * Сегментоядерные 4 Незрелые ш P/D - Полиномиальный (P/D (н/з)) — Полиномиальный (зрелые) - Полиномиальный (незрелые) Полиномиальный (миелоциты) — Полиномиальный (сегментоядерные) В Б Г E Рис. 9. Экспрессия генов p21, c-myc, bcl2, p53, mdm2, bcr/abl, bax, gapdh, actin (А, Б, Г, Д) в сравнении с кинетикой апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (В), а также ПДК (E) для Ph+^леток из ПК типа 3 с чередованием этапов по схеме 2/1/2. Детали на рис. 1. Jt (А, Б), Jt/Jgapdh (Г, Д). Этап созревания с [з] > [нз] на 0-4 сут, этап пролиферации с [нз] > [з] на 4-7 сут. Обнаружено, что экспрессия генов изменяется синхронно с регуляцией пролиферации и диффе-ренцировки, фазами клеточного цикла и апоптозом. Это показывает, что рассмотренные гены участвуют в регуляции пролиферации и дифференцировки пролиферирующих миелоидных Ph+-клеток и ней-трофилов. Полученные результаты соответствуют опубликованным данным о закономерностях экспрессии этих генов в других клетках. Они также согласуются с закономерностями пролиферации и дифференцировки, клеточного цикла и апоптоза в других системах. Это свидетельствует о пригодности использованных методов и кинетических кривых, полученных с помощью ОТ-ПЦР, для изучения экспрессии генов. Низкая экспрессия генов в ней-трофилах согласуется с низкой продукцией белка р21, ряда специфичных белков и многих факторов в гемопоэтических нейтрофилах [51, 57, 64, 65, 68, 69]. Кинетический подход к изучению экспрессии генов методом ОТ-ПЦР при сравнении с кинетикой пролиферации и дифференцировки клеток в полиномиальной аппроксимации оказывается вполне информативным для исследования регуляции пролиферации и дифференцировки, клеточного цикла и апоптоза гемопоэтических клеток, пролиферирующих с дифференцировкой и созревающих без деления. Полученные результаты позволяют поставить новые вопросы, важные для понимания экспрессии генов и механизмов ХМЛ. Один из них - участвуют ли гены р53, mdm2, p21, c-myc в ингибировании экспрессии bcr/abl. Второй вопрос - является ли экспрессия bcr/abl генотоксическим или клеточным стрессом для гемопоэтических клеток, и как реагируют на это гены р53, mdm2, p21, c-myc. Результаты работы свидетельствуют, что повышению скорости пролиферации и агрессивности пролиферирующих Ph+-клеток с высокой экспрессией гена 118 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ bcr/abl способствует пониженная экспрессия генов p53, mdm2 и р21, создающая условия для неконтролируемой экспрессии bcr/abl. Сверхэкспрессия генов р53, p21, mdm2 и c-myc, основных регуляторов клеточного цикла, напротив, подавляет экспрессию bcr/abl в РЬ+-клетках и образование клеток bcr/abl+. ВЫВОДЫ 1. Экспрессия генов p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl, bcr, bcl2, bax, gapdh, actin участвует в общей программе регуляции ex vivo пролиферации и диффе-ренцировки РЬ+-клеток при ХМЛ. Экспрессия этих генов согласуется с пролиферацией и дифференцировкой РЬ+-клеток трех типов и с их регуляцией чередованием этапов пролиферации (1) и созревания (2) по схемам 1/2/1 и 2/1/2, а также с пролиферацией и дифференцировкой на этапах только пролиферации (тип 1) или только созревания (тип 2). 2. В активно пролиферирующих миелоидных клетках-предшественниках, накапливающихся в S-и G2/M-фазах клеточного цикла, сверхэкспресси-руются гены p53, p21, mdm2 >> gapdh. Сверхэкспрессия этих генов наблюдается в клетках типа 1 и при совпадении максимума клеток в S- и G2/M-фазах с этапом пролиферации в РЬ+-клетках типов 2 и 3. При созревании и повторных чередованиях этапов пролиферации и созревания, где накапливаются нейтрофилы и миелоциты, экспрессия генов существенно снижается, а при чередовании по схеме 2/1/2 уменьшается также доля клеток в S- и G2/M-фазах клеточного цикла. 3. В нейтрофилах на этапе созревания уровень экспрессии падает в ряду gapdh > actin > c-myc, bcr/abl, p21 > p53 > bcl2 > bax; в миелоцитах уровень экспрессии этих генов также не достигает уровня gapdh. 4. Экспрессия гена bcr/abl в РЬ+-клетках типов 2 и 3 имеет два пика - снижается на этапе созревания при блокировании апоптоза и накоплении нейтрофи-лов и усиливается в 2-3 раза на этапе пролиферации с накоплением миелоцитов. Минимуму экспрессии bcr/abl соответствует сверхэкспрессия генов p53, mdm2, p21, c-myc и максимум клеток в S- и G2/M-фазах клеточного цикла. 5. На этапе созревания ингибируется апоптоз, накапливаются нейтрофилы и уменьшается экспрессия генов p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl. Апоптоз в РЬ+-клетках индуцируется при экспрессии генов bax > bcl2, р53, p21, c-myc и gapdh. 6. В РЬ+-клетках типа 1, полученных при бласт-ном кризе и в фазе акселерации ХМЛ, с индексами эффективности Р/D ~ 5-20 и высоким содержанием клеток CD34+ и промиелоцитов, наблюдается сверхэкспрессия генов bcr > gapdh > bcr/abl при пониженной экспрессии р53, bcl2, mdm, р21 < gapdh. При этом сверхэкспрессия bcr/abl в миелоидных предшественниках сопровождается низкой экспрессией p53, p21, mdm2. Предполагается, что снижение/отсутствие контроля генов регуляторов пролиферации, дифференцировки и клеточного цикла способствует сверхэкспрессии гена bcr/abl и активной продукции клеток bcr/abl+. ·

Об авторах

Н. И. Гринева

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: nigrin27@mail.ru
Россия

E. A. Духовенская

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

A. M. Тимофеев

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

T. В. Ахлынина

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

Л. П. Герасимова

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

T. E. Манакова

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

T. В. Боровкова

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

Д. A. Шмаров

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

Н. Г. Сарычева

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

Н. M. Найденова

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

A. Р. Гавричкова

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

Л. Ю. Колосова

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

T. И. Колошейнова

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

Л. Г. Ковалева

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: nigrin27@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы