Митохондриальный путь апоптоза в клетках эпидермоидной карциномы человека A431 при действии α-токоферилсукцината

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ. В настоящее время внимание многих исследователей направлено на поиск противоопухолевых средств, селективно действующих на злокачественные клетки, но нетоксичных для нормальных клеток и тканей. В число таких соединений входят производные витамина Е. Сегодня термин «витамин Е» применяют к целой группе как природных, так и синтетических соединений, называемых токоферолами и токотриенолами, а также к ацетиловым и сукциниловым производным токоферола. Проявления биологической активности витамина Е разнообразны и недостаточно изучены. Некоторые формы витамина Е можно рассматривать в качестве потенциальных противоопухолевых средств, поскольку они могут нейтрализовывать свободные радикалы, подавлять рост трансформированных клеток и индуцировать их дифференцировку, влиять на прохождение клеточного цикла, вызывать апоптоз, а также усиливать работу иммунной системы [1-3]. Показано, что сам α-токоферол практически не обладает противоопухолевой активностью, в то время как ряд его производных, в том числе и сукци-нат витамина Е (α-токоферилсукцинат, СВЕ), в той или иной степени проявляют такую активность. Негидролизованный СВЕ не обладает окислительновосстановительными свойствами, но, в отличие от свободного α-токоферола, имеет уникальные ан-типролиферативные и проапоптотические свойства [4]. СВЕ может действовать как на культивируемые опухолевые клетки [5, 6], так и на трансплантированные животным опухоли человека, и опухоли, индуцированные химическими канцерогенами [7-11]. СВЕ может вызывать гибель клеток, остановку клеточного цикла [12, 13], подавлять ангиогенез [14] и защищать организм от действия ионизирующего облучения [15]. Мишени СВЕ в клетках различного происхождения интенсивно изучаются. Показано, что СВЕ запускает апоптотическую гибель ряда опухолевых клеток (рак молочной железы, злокачественная мезотелиома, нейробластома) по митохондриальному пути [16-21]. Тем не менее механизмы СВЕ-индуцированного апоптоза изучены еще недостаточно. Действие СВЕ изучали на культивируемых опухолевых клетках разного происхождения. Опухоли кожи обладают высокой злокачественностью и относятся к числу плохо поддающихся лечению, однако работы, посвященные действию производных витамина Е на трансформированные кератиноциты, в настоящее время практически отсутствуют. Прогноз при злокачественных заболеваниях кожи часто оказывается неблагоприятным. В связи с этим в представленной работе изучено действие α-токоферилсукцината на культивируемые клетки эпидермоидной карциномы человека А431. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Культура клеток и постановка эксперимента Клетки культуры А431 (эпидермоидная карцинома человека) (Институт цитологии РАН, Россия) растили в среде DMEM («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота («PAA Laboratories», Австрия) и 80 мг/мл гентами-цина («ПанЭко») при 37°C и 5% CO2. В качестве растворителя для СВЕ («Sigma») использовали 96% этанол. Первым контролем служили клетки, среда культивирования которых не содержала добавок. В качестве второго контроля в среду культивирования добавляли этанол. Агент и спирт, используемый в качестве второго контроля, вносили на 2 сут после посадки клеток и инкубировали в течение 24, 48 и 72 ч. Оценка уровня гибели клеток Долю апоптотических клеток в популяции подсчитывали на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, по стандартной методике. Критериями для распознавания клеток, вступивших в апоптоз, служили такие морфологические признаки, как конденсация хроматина, уплотнение и блеббинг цитоплазмы. Оценивали действие СВЕ в концентрации 20, 40, 60 и 100 мкМ. Препараты анализировали на микроскопе Leica DM 1000 с использованием объектива N PLAN 100x/1.25 Oil. Результаты обрабатывали в программе Microsoft Office Excel 2007. Цитохимия и иммуноцитохимия Для иммуноцитохимических исследований клетки фиксировали 4% формальдегидом («MP Biochemicals», Франция), приготовленным на 0.1 М буфере PBS («Sigma») рН 7.2. Препараты окрашивали моноклональными антителами мыши к активной форме каспазы-3 («Sigma»), антителами овцы к цитохрому с («Sigma»). В качестве вторых антител использовали антитела к Ig мыши, конъюгированные с Alexa Fluor-488 («Sigma»), и антитела к Ig овцы, конъюгированные с Alexa Fluor-488 («Invitrogen», США) соответственно. Ядра клеток докрашивали DAPI (100 нМ, «Sigma»). Препараты заключали в PBS-глицерин (1 : 1) и анализировали на люминесцентном микроскопе Axiovert 200M («Carl Zeiss Inc.», Германия) с использованием объектива Plan-NEOFLUAR 100x/1.30. Снимки обрабатывали с помощью программ Adobe Photoshop и ImageJ. Митохондрии выявляли при помощи потенциалзависимого красителя Mitotracker Orange CMTMRos (100 нМ, «Invitrogen Molecular Probes»). Клетки фиксировали 4% формальдегидом («MP Biochemicals», Франция), приготовленным на 0.1 M буфере PBS рН 7.2, и заключали в смесь PBS-глицерин (1 : 1). Прижизненные наблюдения Для выявления АФК в среду добавляли 2',4'-ди-хлорфлуоресцеиндиацетат (DCFH-DA, «BioChemika», США) в концентрации 10 мкМ и выдерживали в течение 20 мин. В присутствии АФК (пероксид водорода, пероксид-анион, пероксид-радикал) в клетке образуется флуоресцентный продукт окисления -дихлорфлуоресцеин. DCFH-DA вносили через 48 ч после внесения СВЕ в среду культивирования. Фотосъемку проводили на люминесцентном микроскопе Axiovert 200M («Carl Zeiss Inc.») с использованием объектива Plan-NEOFLUAR 20x/0.50. Подсчитывали долю АФК-положительных клеток на снимках. Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Excel. Фотографии обрабатывали при помощи программы Adobe Photoshop CS3. Трансмиссионная электронная микроскопия Для электронно-микроскопического исследования клетки фиксировали 2.5% глутаровым альдегидом («Sigma») с 2% формалином в 0.1 М PBS рН 7.2 («Sigma»). Постфиксацию проводили 1% раствором OsO4 («Sigma») в PBS в течение 1 ч в темноте. Далее использовали стандартные процедуры приготовления препаратов для трансмиссионной электронной микроскопии. Ультратонкие срезы (60-80 нм) изготавливали на ультрамикротоме Ultratom-5 («LKB», Швеция). Срезы окрашивали 1.5% водным раствором уранилацетата («Serva», США) и цитратом свинца («Serva») по Рейнольдсу. Препараты анализировали при помощи трансмиссионного электронного микроскопа JEM-1011 («JEOL») с цифровой фотокамерой 94 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Рис. 1. Апоптоз в культуре клеток А431. А - Окраска гематоксилином и эозином; Б -фазовый контраст; В - иммуноцитохи-мическое выявление каспазы-3 в клетке, показанной на «Б». GATAN ES500W, работающей под управлением программы Digital Micrograph фирмы «GATAN» и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100B («JEOL»). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СВЕ вызывает апоптотическую гибель клеток А431 и его эффект зависит от концентрации и продолжительности воздействия На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаружен только один тип гибели клеток - апоптоз. Апоптотические клетки можно было выявить по ряду критериев, таких, как ошаривание, уплотнение цитоплазмы, конденсация хроматина, блеббинг и распад на апоптотические тельца. Некротические клетки не выявлены (рис. 1А). Присутствие активной формы каспазы-3 (рис. 1Б,В) также указывает на апоптотический путь гибели клеток. Величина АИ в контрольных образцах культуры клеток A431 составляет 0.4-0.9%, а добавление 96% этанола практически не влияет на величину АИ. На 2-е сут инкубации клеток с СВЕ в концентрации 40 мкМ АИ значительно повышается (9.67%) и остается на том же уровне на 3-и сут. При добавлении 60 мкМ СВЕ на 1-е сут АИ практически не меняется, на 2-е резко повышается (более 60%), а на 3-и клетки на стеклах не обнаруживаются. Подобный эффект наблюдается и при действии 100 мкМ СВЕ (63.5%), но величины АИ в этом случае наиболее высокие (рис. 2). Таким образом, статистический анализ показал, что под действием СВЕ увеличивается уровень гибели клеток линии А431, причем эффект зависит от концентрации и продолжительности воздействия. При концентрации СВЕ, равной 40 мкМ, и инкубации в течение 48 ч величина АИ заметно повышается, но массовая гибель клеток еще не происходит, поэтому данная доза была выбрана для изучения механизма индукции апоптоза. СВЕ вызывает изменение структуры митохондрий и выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль Согласно опубликованным данным, во многих линиях клеток СВЕ запускает апоптоз по митохондриальному механизму. С целью изучения роли митохондриального механизма в запуске апоптоза анализировали общую структуру хондриома, ультраструктуру митохондрий, локализацию цитохрома c и уровень индукции АФК. Для анализа состояния хондриома в контроле и при воздействии СВЕ клетки окрашивали потенциал-зависимым красителем Mitotracker Orange CMTMRos, способным накапливаться только в работающих митохондриях. На рис. 3А,Б представлены клетки А431, у которых хондриом образован многочисленными митохондриями, среди которых встречаются небольшие овальные, округлые и нитевидные митохондрии, изогнутые, с перетяжками и т.д. Как правило, митохондрии распределены равномерно по всей цитоплазме, очень редко они образуют скопления вокруг ядра, иногда располагаются в периферической цитоплазме. В отдельных случа- 80 70 60 50 40 30 20 10 0L- -10 ■ Контроль • Контроль + спирт О 20 мкМ СВЕ ■ 40 мкМ СВЕ о 60 мкМ СВЕ ■ 100 мкМ СВЕ 24 ч 48 ч Время воздействия 72 ч Рис. 2. Зависимость апоптотического индекса клеток в культуре А431 от концентрации СВЕ и времени инкубации. ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 95 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ 5 мкм ях могут встречаться крупные овальные и округлые митохондрии (рис. 3А). При добавлении спирта распределение митохондрий и их форма не изменяются (рис. 3Б). Под действием СВЕ изменяется форма митохондрий, появляются многочисленные крупные округлые и овальные митохондрии, значительно превосходящие по размеру митохондрии в контрольных клетках. Число таких митохондрий в клетке может различаться, но в целом их, как правило, заметно меньше, чем в контрольных клетках. Локализацию цитохрома с определяли иммуноцитохимически. Выход цитохрома c из митохондрий в цитозоль является ключевым процессом в апопто-зе, протекающем по митохондриальному («внутреннему») пути. В контроле и в контроле с добавлением спирта антитела к цитохрому c выявляют данный белок в составе митохондрий. Как видно из рис. 4А,Б митохондрии небольшие, многочисленные, часто имеют нитевидную форму. Иногда встречаются небольшие овальные и округлые митохондрии. В клетках, которые культивировали в присутствии СВЕ (рис. 4В-Е), можно проследить различную степень окрашивания цитоплазмы и разное количество окрашенных митохондрий, что свидетельствует о выходе цитохрома c из некоторых митохондрий в цитозоль. Так, на рис. 4Г видна клет- Рис. 3. Митохондрии в клетках А431, окрашенные Mitotracker Orange. А - контроль; Б - контроль с добавлением спирта; В, Г - 40 мкМ СВЕ, 48 ч. Рис. 4. Иммуно-цитохимическое выявление цитохрома с в клетках А431. А, Б - контроль; В-Е - 40 мкМ СВЕ, 48 ч. 96 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ о >&· «о ° £ ° -'1 ,ι'’Λ 0 о V £ .г Λ /» га° о' ъг о.» о. .Гб ° о fyft. л*' ■ fi? О о в <? í s Яй •А 50 мкм Рис. 5. Ультраструктура митохондрий в клетках А431. A - Контроль; Б - контроль с добавлением спирта; В-Д - 40 мкМ СВЕ, 48 ч. ка, митохондрии в которой увеличены в размерах и приобрели округлую и овальную форму. При этом цитоплазма остается практически неокрашенной. На рис. 4Д представлена клетка, митохондрии в которой сходны по размеру с митохондриями контрольных клеток. Однако, в отличие от последних, они имеют вид коротких овальных телец. На рис. 4Е виден выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль. Следует отметить, что отдельные митохондрии содержат цитохром с. При ультраструктурном исследовании клеток эпидермоидной карциномы обнаруживаются небольшие митохондрии со светлым матриксом и сравнительно немногочисленными тонкими кристами (рис. 5А,Б). При воздействии СВЕ митохондрии претерпевают значительные изменения (рис. 5В-Д). На срезах могут встречаться гигантские митохондрии с большим количеством крист, митохондрии с инвагинациями, отдельные участки которых заполнены многочисленными кристами (рис. 5Г). В некоторых митохондриях матрикс уплотнен, а кристы расширены (рис. 5Д). Встречаются также митохондрии, ультраструктура которых практически такая же, как у митохондрий контрольных клеток. Интересно отметить, что митохондрии с различной Рис. 6. Прижизненное выявление пероксида водорода в клетках А431. А, В - Контроль; Б, Г - 40 мкМ СВЕ, 48 ч. 10 -I Контроль Контроль 40 мкМ + спирт СВЕ Рис. 7. Прижизненное выявление пероксида водорода в клетках А431. Доля окрашенных клеток в контроле и при воздействии 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч. ультраструктурой могут встречаться в цитоплазме одной и той же клетки. Возможно, гетерогенность популяции митохондрий отражает различные стадии изменений, происходящих с ними при воздействии СВЕ. СВЕ повышает уровень АФК в клетках линии А431 Гибель клеток может опосредоваться увеличением продукции АФК. В связи с этим проведено прижизненное окрашивание клеток красителем DCFH-DA, ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 97 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ что позволяет выявлять пероксид водорода. В контроле окрашивание выявляет одиночные флуоресцирующие клетки (рис. 6А,В), а добавление спирта видимых изменений не вызывает. Воздействие 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч приводит к значительному усилению продукции АФК в клетках. Доля окрашенных клеток (рис. 7) как в контроле, так и при добавлении 96% этанола относительно невысока и составляет 0.08 и 0.49% соответственно. При этом под действием СВЕ доля клеток с избыточным содержанием АФК значительно повышается и составляет 8.18%. Таким образом, в ходе данной работы показано, что СВЕ дозозависимо индуцирует апоптоти-ческую гибель клеток в культуре эпидермоидной карциномы человека A431. Морфологически выявляются такие характерные для апоптоза признаки, как блеббинг, конденсация хроматина, фрагментация ядер и распад клетки на апоптотические тельца. Кроме того, апоптотический путь гибели подтверждается тем, что клетки окрашиваются антителами к активной форме каспазы-3. При этом таких признаков некроза, как набухание клетки, не обнаружено. Имеются данные о том, что СВЕ вызывает апоптотическую гибель злокачественных клеток желудка [22], толстого кишечника [10], молочной железы [23, 16], предстательной железы [17], легкого [24], шейки матки, яичника [25], клеток гепатомы [26], остеосаркомы [12, 13], мезоте-лиомы [27, 28], T-клеточной лимфомы Jurkat [8, 18, 29] и других злокачественных линий кроветворных клеток [8, 19], меланомы и глиомы мыши и нейробластомы крысы и человека [30, 31]. Показано, что апоптоз вызывается микромолярны-ми концентрациями СВЕ, причем эффект зависит от концентрации и продолжительности инкубации [8, 18, 32-35]. Нами показано, что индукция апопто-за в клетках эпидермоидной карциномы человека также является дозозависимой. В отличие от α-токоферола, известного своими ан-тиоксидантными свойствами, СВЕ является редокс-неактивным соединением и не обладает антиокси-дантными свойствами [35]. Напротив, как показано нами и другими авторами [21], в опухолевых клетках СВЕ способен действовать как прооксидант, усиливая генерацию кислородных радикалов. Большое количество исследований указывает на то, что главной мишенью действия СВЕ на опухолевые клетки служат митохондрии [18, 19, 35-38]. Нами выявлено значительное изменение ультраструктуры митохондрий, а также выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль клеток линии А431. Можно предположить, что усиление продукции АФК и выход цитохрома с представляют собой связанные процессы. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что СВЕ способен значительно повышать генерацию АФК в различных линиях клеток, таких, как клетки опухолей молочной железы человека и мыши, T-клеточной лимфомы Jurkat, фибробласты легкого китайского хомячка, клетки злокачественной мезотелиомы, рака головы и шеи человека [27, 36-40]. В большинстве работ указывается, что ведущая роль в апоптозе, следующем за гиперпродукцией АФК, принадлежит супероксидному анион-радикалу, но Gu et al. [40] показали, что в клетках эпидермо-идной карциномы преобладает пероксид водорода, а количество супероксида незначительно. В данной работе выявлено также значительное увеличение доли клеток, в которых наблюдается гипергенерация АФК. Краситель DcFH-DA способен взаимодействовать с пероксидом водорода, следовательно, в нашей работе выявлено образование пероксида водорода. Поскольку в клетках пероксид образуется из супе-роксидного анион-радикала, по всей вероятности, первичной формой кислородных радикалов служит именно O2-. Основное место образования АФК внутри клетки - митохондрии, где свободные радикалы генерируются благодаря работе цепи переноса электронов. Показано, что СВЕ способен подавлять активность комплексов I [41] и II дыхательной цепи митохондрий. Ингибирование комплекса II под действием СВЕ наблюдали в клетках рака молочной железы, клетках Jurkat, тимоцитах крысы [36, 42, 43]. Есть данные о том, что активность комплекса II снижается благодаря тому, что СВЕ служит псевдосубстратом для СДГ, связываясь с Qp- и QD-сайтами ферментного комплекса. Таким образом, ингибирование носит конкурентный характер. При замещении убихинона на СВЕ в сайте связывания убихинона электроны не транспортируются по гидрофильной части СДГ на FAD, [Fe- S]-центры, гем и убихинон. Вместо этого они рекомбинируют с молекулярным кислородом, образуя супероксидный анион-радикал, накопление которого, в конечном счете, может приводить к апопто-зу опухолевых клеток [38]. Известно, что усиление генерации АФК может запускать развитие апоптоза по митохондриальному пути. АФК способны опосредовать формирование дисульфидных мостиков между мономерами Bax в цитозоле, что приводит к образованию каналов во внешней митохондриальной мембране [42], а также разрушать связь цитохрома с с кардиолипином, мембранным фосфолипидом митохондрий, вызывая его гидропероксидацию [43, 44]. АФК, образующиеся при культивировании клеток в присутствии СВЕ, могут вызывать диссоциацию цитохрома с от кардио- 98 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ липина и выход белка в цитозоль, где цитохром с запускает активацию каспаз. Отметим, что цитохром с выходит не одновременно из всех митохондрий. Даже в тех клетках, где цитоплазма достаточно сильно окрашена антителами к цитохрому с, сохраняется несколько митохондрий, содержащих цитохром с. При этом такие митохондрии, как правило, сильно увеличены в размерах и имеют овальную или округлую форму. Такие же крупные митохондрии выявляются при окрашивании клеток потенциал-зависимым красителем Mitotracker Orange. Поскольку для выхода цитохрома с необходимо нарушение проницаемости митохондриальной мембраны, выход должен сопровождаться потерей мембранного потенциала. Таким образом, нами показано, что при воздействии СВЕ в клетках могут сохраняться митохондрии, содержащие цитохром с и обладающие мембранным потенциалом, т.е. митохондрии, участвующие в синтезе АТР, продукция которого необходима даже на поздних этапах апоптоза, являющегося энергозависимым процессом. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нами показано, что митохондрии являются важной мишенью действия СВЕ на культуру клеток эпидер-моидной карциномы A431. Обнаружено, что под действием СВЕ изменяется форма митохондрий и их ультраструктура, усиливается продукция АФК и выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль, что приводит к запуску каспазозависимого апопто-за. Полученные результаты позволяют предложить следующий механизм индукции клеточной гибели под действием СВЕ. α-Токоферилсукцинат ингибирует действие комплекса II дыхательной цепи, в результате чего транспорт электронов нарушается, и усиливается образование АФК. АФК, в свою очередь, накапливаются в клетке и повреждают митохондрии, что приводит к выходу цитохрома с в цитозоль и запуску программы апоптотической каспазозависимой гибели клетки. ·

Об авторах

M. A. Савицкая

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: nakomis@mail.ru
Россия

M. С. Вильданова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nakomis@mail.ru
Россия

O. П. Кисурина-Евгеньева

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nakomis@mail.ru
Россия

E. A. Смирнова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nakomis@mail.ru
Россия

Г. E. Онищенко

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nakomis@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы