Низкотемпературная плазма вызывает р53-зависимый апоптоз клеток карциномы кишечника

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ. Низкотемпературная плазма (НТП) представляет собой частично ионизированный газ, полученный при атмосферном давлении и имеющий макроскопическую температуру, близкую к температуре окружающей среды [1]. Интенсивное изучение возможностей применения НТП в медицине началось около 10 лет назад, хотя первые работы появились намного раньше, преимущественно в России [2-4]. В состав факела НТП входят заряженные частицы, нейтральные активные частицы, в том числе свободные радикалы и частицы в метастабильных состояниях, а также ультрафиолетовое излучение. Биологические эффекты НТП связаны с синергичным действием перечисленных факторов, подпороговая концентрация каждого из которых в большинстве случаев не вызывает изменений в биологическом объекте [5, 6]. В настоящее время активно изучают возможность использования НТП в качестве антибактериального агента, так как установлено, что НТП обладает неспецифической бактерицидной активностью, позволяющей применять НТП для стерилизации термочувствительных поверхностей и для санирования тканей, в том числе раневых поверхностей [7-9]. Другая потенциальная область применения НТП - терапия новообразований. Так, сообщается о селективности цитотоксического действия плазмы в отношении разных типов клеток человека, а также о возможности подбора условий, обеспечивающих избиратель- ную гибель опухолевых клеток определенного типа [10, 11]. Показано, что воздействие НТП на опухолевые клетки вызывает задержку клеточного цикла и переход этих клеток к апоптозу [12-14]. В отличие от конечных эффектов, вызванных обработкой клеток НТП, о молекулярных механизмах, лежащих в основе взаимодействия НТП с эукариотическими клетками, известно весьма немного. Такие данные необходимы для выяснения природы селективности действия НТП в отношении опухолевых клеток и определения границ применения НТП. В связи с этим цель нашей работы состояла в изучении молекулярных механизмов действия НТП на опухолевые клетки и определение типа гибели клеток, подвергнутых воздействию НТП. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Клеточные линии и условия выращивания клеток В работе использовали две сублинии клеток карциномы прямой кишки человека (HCT116): сублинию HCT116(р53+/+)-ConA-lacZ, содержащую активный ген р53, а также репортерный ген β-галактозидазы под контролем р53-зависимого промотора, и сублинию HCT116(р53-/-)-ConA-lacZ, в которой делетированы обе копии гена, кодирующего белок р53. Исходные линии клеток HCT116(р53+/+) и HCT116(р53-/-) любезно предоставлены А.В. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, США). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10 об.% сыворотки эмбрионов крупного скота («Hyclone», США), 1 мг/мл глутамина («ПанЭко», Россия), 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина («ПанЭко», Россия) при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2. Клетки рассевали в отношении 1 : 6 на вторые сутки при достижении монослоя. Определение количества живых клеток Выживаемость клеток определяли спектрофотометрическим методом через 24 ч после обработки холодной плазмой по интенсивности окраски живых клеток красителем метиленовым голубым. Оптическую плотность измеряли при 540 и 620 нм. Относительное количество выживших клеток определяли по формуле х = 0Е620 - Ое540. Определение активности р53-контролируемого промотора по экспрессии репортерного гена β-галактозидазы После удаления культуральной среды к клеткам добавляли лизирующий буфер, содержащий субстрат для β-галактозидазы (1 мМ MgCl2, 0.25 M Трис-HCl, pH 7.4, 0.02% NP40, 2 г/л о-нитрофенил-β-Ο-галактопиранозид). После инкубации при 37°С в те чение 30 мин уровень активности β-галактозидазы определяли спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность раствора при длине волны 414 нм. Источник НТП В работе использовали источник низкотемпературной аргоновой СВЧ плазмы MicroPlaSter β. Источник НТП содержал генератор тока с частотой 2.45 ГГц, горелку и систему подачи газа (аргон). Прибор может работать в двух режимах: режиме НТП и режиме продува неионизированного аргона. Горелка способна генерировать высокостабильный поток плазмы (факел) низкой мощности (60—150 Вт) с низкой скоростью газового потока (4-8 л/мин). Длина плазменного факела - примерно 5 см, диаметр - около 3.5 см. Температура факела на расстоянии 2 см от горелки, где помещались образцы, равнялась 36 ± 2°C. Облучение клеток НТП За один день до начала эксперимента клетки высевали на культуральные чашки диаметром 3 см по 2 X 105 клеток/чашка. На следующий день непосредственно перед облучением из культуральных чашек удаляли среду, оставляя 0.5 мл, располагали чашки на расстоянии 2 см от плазменной горелки и облучали НТП в течение времени, указанного далее. Сразу после облучения культуральную среду заменяли свежей и переносили чашки в СО2-инкубатор. Количество жизнеспособных клеток и активность ре-портерного гена β-галактозидазы определяли через 24 ч после облучения. Измерение уровня активности каспазы-3 Активность каспазы-3 измеряли, используя конъюгат антител, специфичных для активной формы белка, с флуоресцентным красителем флуоресцеи-низотиоцианатом (FITC, «BD Pharmingen», США). Через 18 ч после обработки плазмой клетки собирали и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при скорости 1200 об/мин. Для фиксации и пермеабилизации клеток использовали реагент BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeablization Kit («BD Pharmingen»). Внутриклеточное окрашивание активной формы каспазы-3 осуществляли согласно протоколу производителя («BD Pharmingen»). Флуоресценцию детектировали методом проточной цитофлуориметрии, используя цитометр Beckman-Coulter FC-500. Измерение уровня активности р53 Уровень р53 измеряли, используя конъюгат антител к белку р53 с флуоресцентным красителем фикоэритрином («BD Pharmingen», США). За 1 день до начала опыта на культуральные чашки 88 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ диаметром 3 см высевали по 2 X 105 клеток линии HCT116(р53 + / + )-ConA-lacZ и ^^16^53-/-)-ConA-lacZ. На следующий день при достижении клетками 60-80% конфлюентности из чашек отбирали культуральную среду, оставив 0.3 мл для предотвращения высыхания клеток. После обработки клеток плазмой в течение 2 мин клеточную среду заменяли свежей. После инкубации в течение 6 ч клетки собирали и осаждали центрифугированием (10 мин, 1200 об/мин). Для фиксации и пермеаби-лизации клеток использовали реагент BD Cytofix/ Cytoperm™ Fixation/Permeablization Kit («BD Pharmingen»). Внутриклеточное окрашивание белка р53 производили согласно протоколу производителя («BD Pharmingen»). В качестве изотипического контроля использовали IgG1 мыши. Флуоресценцию детектировали методом проточной цитофлуориме-трии, используя цитометр BeckmanCoulter FC-500. Статистика Каждый эксперимент был выполнен не менее 3 раз, измерения проводились в двух повторах. Среднее значение и стандартную ошибку определяли с использованием функций, включенных в программный пакет Excel 2007. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Обработка НТП вызывает дозозависимую гибель клеток HCT116 Одной из возможных причин гибели опухолевых клеток после обработки НТП, может быть способность плазмы активировать фактор транскрипции р53 и инициировать развитие р53-зависимых программ, ведущих к апоптотической гибели. Для проверки этого предположения мы выбрали линию клеток HCT116(р53+/+) карциномы прямой кишки человека, содержащих функциональный ген р53. На первом этапе определили способность НТП вызывать гибель этих клеток. С этой целью клетки HCT116(р53+/+) облучали НТП с различным временем экспозиции. Через 24 ч после облучения определяли количество живых клеток. Контролем служили необлученные клетки, а также клетки, обработанные потоком неионизированного аргона в течение соответствующего времени. Воздействие НТП в течение 2 мин не вызывало статистически значимого снижения числа живых клеток (рис. 1). После облучения в течение 5 мин число живых клеток снижалось в 2 раза (p < 0.01), а после 7 мин - в 14.5 раза по сравнению с интактными контрольными клетками (p < 0.005). Снижение числа живых клеток после облучения плазмой в течение 7 мин статистически значимо отличалось от эффекта неионизированно- "-s О4 * О н Ф Ц * .ű CŰ г * к Ц О П 120 100 80 60 40 20 2 мин 5 мин * * 7 мин Рис. 1. Определение выживаемости клеток линии HCT116(p53+/+), обработанных НТП (черные столбцы) и неионизированным аргоном (белые столбцы), в зависимости от времени экспозиции. Показан процент живых клеток по сравнению с интактным контролем, число клеток в котором принято за 100% (показано пунктиром). Приведены средние значения ± стандартное отклонение. *р < 0.05, **p < 0.005 по сравнению с интактными клетками. го аргона (p < 0.01). При облучении неионизирован-ным аргоном число живых клеток снижалось относительно контрольных, однако было статистически незначимым при всех временах экспозиции. Наблюдаемое снижение числа живых клеток могло быть обусловлено последствиями обдува клеток потоком газа, приводящего к испарению культуральной среды или другим неспецифическим эффектам. Таким образом, нами было показано, что обработка НТП приводит к уменьшению количества живых клеток, при этом выраженность цитотоксического эффекта зависит от времени воздействия плазменного потока. Снижение числа живых клеток при обработке потоком неионизированного аргона было меньше и не зависело от времени экспозиции. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что цитотоксичность НТП обеспечивается специфическим воздействием ионизированных частиц НТП на эукариотические клетки. В клетках НСТ116, обработанных НТП, активируется белок р53 и контролируемые им элементы Известно, что одним из основных активируемых стрессом регуляторов транскрипции является белок р53, активация которого способна инициировать развитие ряда программ, приводящих к клеточной гибели. Влияние НТП на активность белка р53 изучали с использованием сублиний клеток HCT116 0 ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 89 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ 180 Интактные клетки Аргон Плазма Рис. 2. Относительная транскрипционная активность белка p53 в клетках HCT116(p53+/+), обработанных НТП. Приведены средние значения ± стандартное отклонение. (HCT116(p53 + / + )-ConA-lacZ). В геном клеток HCT116(p53 + / + )-ConA-lacZ был введен репор-терный ген lacZ, кодирующий бактериальную β-галактозидазу. Экспрессия репортерного гена контролировалась р53-зависимым промотором. Использование данной репортерной системы позволяет определять транскрипционную активность белка р53 по уровню активности β-галактозидазы. Исходя из полученных ранее данных, определили субтокси-ческое время обработки клеток НТП, которое не приводит к выраженной гибели клеток (2 мин). Уровень экспрессии гена β-галактозидазы определяли спектрофотометрически через 24 ч после воздействия на клетки НТП. В качестве контроля использовали клетки, обработанные потоком неионизированно-го аргона. Обработка клеток НТП в течение 2 мин приводила к статистически значимому повышению уровня активности β-галактозидазы, что указывало на увеличение транскрипционной активности р53 в клетках линии HCT116 (рис. 2). Дополнительно методом проточной цитофлуори-метрии с использованием моноклональных антител к р53, конъюгированных с флуоресцентной меткой, определили количество самого белка р53. В качестве контрольной линии использовали клетки НСТ116(р53-/-) с делецией обеих копий гена р53. Показано, что обработка НТП в течение 2 мин приводит к статистически значимому увеличению количества белка р53 в клетках НСТ116(р53+/+) по сравнению с контрольными интактными клетками (рис. 3А). Неспецифический сигнал в клетках линии HCT116(p53-/-), как и следовало ожидать, не изменялся после воздействия НТП (рис. 3Б). Таким образом, установлено, что обработка эукариотических клеток НТП при субтоксических временах экспозиции приводит к статистически значимому (p < 0.05) увеличению количества белка р53 и повышению его транскрипционной активности. Воздействие НТП приводит к апоптотической гибели клеток НСТ116 На заключительном этапе работы необходимо было идентифицировать тип клеточной смерти индуцируемой обработкой НТП. Среди известных на сегодняшний день механизмов клеточной смерти одним из основных является инициация апоптоза путем программ с участием активированного белка р53 [15]. Один из ключевых ферментов, активизирующихся при апоптозе, - эффекторная каспаза-3 [16]. Активация этого белка является неотъемлемой чертой заключительных стадий апоптотической гибели клеток. Для выявления связей между активацией белка р53 и гибелью клеток HCT116 определили уровень активированной каспазы-3 в клетках сублиний HCT116(p53+/+) и HCT116(p53-/-), обработанных НТП. В популяции клеток HcT116(p53+/+), обработанных НТП в течение 2 мин, наблюдалось значительное (до 20%) увеличение доли клеток с активной каспа-зой-3 (рис. 4А), тогда как в клетках HCT116(p53-/-) такая обработка к подобному эффекту не приводила (рис. 4Б). Таким образом, можно заключить, что обработка клеток НТП приводит к р53-зависимой активации основной эффекторной проапоптотической каспазы-3. Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод, что обработка клеток человека НТП при- А Б HCT116(p53+/+) HCT116(p53-/-) Интенсивность флуоресценции Интенсивность флуоресценции — ■ Отрицательный контроль -Обработка плазмой 2 мин Рис. 3. Внутриклеточная концентрация белка р53 в клетках HCT116(p53+/+) и HCT116(p53-/-) (А и Б соответственно), контрольных или обработанных НТП в течение 2 мин. 90 | ACTA NATURAE | ТОМ 4 № 3 (14) 2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ водит к активации белка р53, основного регулятора ответа клетки на стресс, и индуцирует экспрессию р53-зависимых генов, в том числе эффекторной ка-спазы-3, запуская тем самым гибель клеток по апоп-тотическому пути. Впервые прямо показано, что апоп-тоз, вызванный НТП, развивается по р53-зависимому пути. Ранее на основании данных об усилении транскрипции гена р53 и гена р21, контролируемого белком р53, в клетках гепатокарциномы Hep2G человека предположили, что р53 участвует в ответе клеток на облучение НТП [17]. Однако прямых доказательств существования связи между выживаемостью клеток и наличием функционального белка р53 не было. Полученные нами результаты соответствуют индукции сигнального пути, регулируемого β-катенинами, в клетках рака кишечника человека, подвергнутых воздействию НТП, поскольку этот путь связан с основным сигнальным каскадом, контролируемым белком р53 [18]. Еще одна сигнальная система, вовлеченная в клеточный ответ на воздействие НТП, это генерация внутриклеточных активных форм кислорода (ROS, reactive oxygen species) [14]. Внутриклеточные ROS, прямо или опосредованно взаимодействующие с такими компонентами сигнальных путей, как протеин-киназы, фосфатазы, факторы транскрипции, служат вторичными сигнальными молекулами, которые участвуют в контроле клеточного цикла и влияют на окончательный исход событий, запущенных в результате активации белка р53 [19]. Однако последовательность сигнальных событий, развивающихся в клетке в ответ на воздействие НТП, до настоящего времени не установлена. Прежде всего, не полностью выяснен характер повреждений, приводящих к активации белка р53. Ряд исследований указывает на возможность повреждений ДНК как фактора, приводящего к апоптозу облученных клеток. Так, воздействие дибарьерного разряда как источника воздушной плазмы на клетки рака молочной железы MCF10A приводит к фосфорилирова-нию гистона Н2А, что является маркером возникновения двухцепочечных разрывов в ДНК [14]. Однако эти результаты противоречат многочисленным данным, полученным на прокариотах и очищенных препаратах ДНК, о минимальном количестве двухцепочечных разрывов, обусловленных воздействием НТП [20-23]. Для объяснения этого противоречия авторы предположили, что двухцепочечные разрывы в ДНК могут возникать, например, в результате образования внутриклеточных ROS под действием НТП [14]. Другим потенциальным сигналом развития апоптоза могут быть повреждения цитоплазматической мембраны. Например, активация кислой сфингомиели-назы при повреждении мембраны и увеличенная продукция церамидов могут приводить к развитию Интактные клетки Обработка плазмой 2 мин [B] FL1 Log - ADC GFP [B] FL1 Log - ADC \D О О "Ъ 1 " GFP Интактные клетки \о о о її GFP Обработка плазмой 2 мин "ί <5 ґ\ “j i/η,ί \ S . 0 /■'"'n un/ \ Уй 9 SS Lin 1 1 1 t 1 і 1 1 J>' j *L) ......V "Λ>· J"fr 1V GFP [B] FL1 Log - ADC GFP [B] FL1 Log - ADC \D О ,иЪ 1 1 "”"?í ,r GFP ю о о GFP Рис. 4. Количество активной каспазы-3 в клетках HCT116(p53+/+) и HCT116(p53-/-) (А и Б соответственно), контрольных или обработанных НТП в течение 2 мин. как р53-зависимого, так и независимого апоптоза [24]. В пользу этого механизма запуска апоптоза свидетельствуют многочисленные экспериментальные данные, показывающие, что именно поверхностные структуры клетки и, в частности, мембрана, служат основной мишенью для активных частиц НТП [20, 25-27]. Однако доказательств в пользу данного механизма инициации апоптоза не получено, и детали событий, происходящих в клетке сразу после воздействия НТП, не изучены. Вместе с тем, очевидно, что для успешного применения НТП в медицине необходимо понимать, какие сигнальные события НТР запускает в зависимости от дозы и типа плазменного облучения, поскольку именно эти знания позволяют оптимизировать параметры воздействия и получить необходимый эффект. А Б ТОМ 4 № 3 (14) 2012 | ACTA NATURAE | 91 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЫВОДЫ В результате проведенных исследований показано, что выживаемость клеток карциномы кишечника HCT116, обработанных НТП, зависит от наличия функционального белка р53. Воздействие НТП на клетки приводит к увеличению внутриклеточной концентрации р53 и индукции экспрессии контролируемых им генов, в частности основной проапоп-тотической каспазы-3. Таким образом, впервые показано, что обработка клеток карциномы кишечника аргоновой НТП приводит к р53-зависимому апопто-зу. Эти результаты важны для понимания возможностей применения НТП в качестве противоопухо левого средства. · Авторы благодарят ADTEC Plasma Technology Co. Ltd за вклад в создание источника НТП MicroPlaSter β.

Об авторах

A. И. Тухватулин

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

E. В. Сысолятина

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

Д. В. Щебляков

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

Д. Ю. Логунов

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

M. M. Васильев

Объединенный институт высоких температур РАН

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

M. A. Юрова

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

M. A. Данилова

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

O. Ф. Петров

Объединенный институт высоких температур РАН

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

Б. С. Народицкий

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

G. E. Morfill

Max Plank Institute for Extraterrestrial Physics

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Германия

A. И.I Григорьев

Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем РАН

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

В. E. Фортов

Объединенный институт высоких температур РАН

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

A. Л. Гинцбург

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития Российской Федерации

Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

С. A. Ермолаева

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: sveta@ermolaeva.msk.su
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы