Chemical Polysialylation and In Vivo Tetramerization Improve Pharmacokinetic Characteristics of Recombinant Human Butyrylcholinesterase-Based Bioscavengers

S. S. Terekhov; Терехов С. С.; I. V. Smirnov; Смирнов И. В.; O. G. Shamborant; Шамборант O. Г.; T. V. Bobik; Бобик T. В.; D. G. Ilyushin; Илюшин Д. Г.; A. N. Murashev; Мурашев A. Н.; I. A. Dyachenko; Дьяченко И. A.; V. A. Palikov; Паликов В. A.; V. D. Knorre; Кнорре В. Д.; A. A. Belogurov; Белогуров A. A.; N. A. Ponomarenko; Пономаренко Н. A.; E. S. Kuzina; Кузина E. С.; D. D. Genkin; Генкин Д. Д.; P. Masson; Masson P.; A. G. Gabibov; Габибов A. Г.

doi:10.32607/20758251-2015-7-4-136-141

Химическое полисиалирование и in vivo тетрамеризация улучшают фармакокинетические характеристики биологических антидотов на основе рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека

Авторы: Терехов С.С.¹, Смирнов И.В.¹^,2, Шамборант O.Г.¹, Бобик T.В.¹, Илюшин Д.Г.¹, Мурашев A.Н.³, Дьяченко И.A.³, Паликов В.A.³, Кнорре В.Д.¹, Белогуров A.A.¹^,2^,4, Пономаренко Н.A.¹, Кузина E.С.¹, Генкин Д.Д.⁵, Masson P.², Габибов A.Г.¹^,2^,4
Учреждения:
1. Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
2. Казанский федеральный университет
3. Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
4. Институт биологии гена РАН
5. ОАО «Фармсинтез»
Выпуск: Том 7, № 4 (2015)
Страницы: 136-141
Раздел: Экспериментальные статьи
Дата подачи: 17.01.2020
Дата публикации: 15.12.2015
URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10488
DOI: https://doi.org/10.32607/20758251-2015-7-4-136-141
ID: 10488

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Фосфорорганические токсины (ФОТ), благодаря их направленному действию на нервную систему, входят в число наиболее токсичных низкомолекулярных соединений. Бутирилхолинэстераза человека (чБуХЭ) является естественным биологическим антидотом широкого спектра ФОТ, что делает ее перспективной для разработки ДНК-кодируемых биологических антидотов. Высокие значения защитного индекса, полученные при использовании в терапии рекомбинантной чБуХЭ (рчБуХЭ), характерны для отравлений высокотоксичными боевыми ФОТ. В то же время широкомасштабное применение препаратов чБуХЭ ограничено из-за их высокой стоимости и экстремально быстрого выведения рчБуХЭ из кровотока. В представленной работе проанализированы два подхода к увеличению продолжительности циркуляции рчБуХЭ: I) химическое полисиалирование и II) in vivo тетрамеризация. При помощи обоих подходов удается значительно (более чем в 5 и 10 раз соответственно) повысить фармакокинетические характеристики рчБуХЭ, что позволяет использовать препараты на основе конъюгатов с полисиаловыми кислотами (рчБуХЭ-ПСА) и тетрамерной рчБуХЭ (4рчБуХЭ) в терапии отравлений ФОТ.

Ключевые слова

биологический антидот, биологический препарат, биораспределение, бутирилхолинэстераза, полисиалирование, фармакокинетика, in vivo тетрамеризация

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Фосфорорганические токсины (ФОТ), несмотря на их более чем 150-летнюю историю, остаются одними из наиболее актуальных объектов совре менной токсикологии. ФОТ являются представи телями нескольких классов фосфорорганических соединений, необратимо ингибирующих ацетилхо линэстеразу человека (чАцХЭ). Ингибирование аце тилхолинэстеразы, в свою очередь, приводит к раз витию синдрома SLUDGE(M) (Salivation Lacrimation Urination Diaphoresis Gastrointestinal upset Emesis (Miosis) - Слюноотделение Слезоточение Мочеиспускание Потоотделение Расстройство ки шечника Рвота (Миоз)). В случае тяжелых отравле ний развиваются судороги, наблюдается необратимое повреждение мозга, остановка дыхания и наступает смерть. В настоящее время жертвами ФОТ (порядка 260000 в год) становятся главным образом самоубий цы. Особенно это актуально для западной части тихо океанского региона, где составляет приблизительно 50% от общего числа попыток суицида [1]. Также слу чаи отравления фосфорорганическими пестицидами нередки среди фермеров. Кроме этого, существует потенциальная угроза военного применения боевых отравляющих веществ нервно-паралитического дей ствия или использование их в террористических ата ках. Общепринятая схема терапии отравлений ФОТ [2] включает комбинированную терапию антагони стами мускаринового рецептора (обычно атропином) и реактиваторами ацетилхолинэстеразы (пралидок симом или обидоксимом). К сожалению, данная тера пия не универсальна, она не приводит к увеличению выживаемости при отравлении фосфорорганически ми пестицидами [3], а также не позволяет избежать необратимого повреждения мозга. Альтернативным подходом в терапии отравле ний ФОТ является использование биологических антидотов - биомолекул, связывающих и инакти вирующих ФОТ [4-7]. Бутирилхолинэстераза че ловека - естественный биологический антидот (су ицидальный инактиватор) человека при отравлении ФОТ [8]. Благодаря уникальному сходству с чАцХЭ и большому объему полости активного центра чБуХЭ инактивирует широчайший спектр ФОТ зачастую эффективнее чАцХЭ [9]. Использование чБуХЭ в те рапии отравлений ФОТ позволяет не только повы сить выживаемость, но и избежать долговременных побочных эффектов отравления ФОТ, в том числе и необратимого повреждения мозга [10]. Несмотря на очевидные преимущества, применение чБуХЭ в терапии отравлений ФОТ крайне ограничено вы сокой стоимостью препаратов чБуХЭ и экстре мально быстрым выведением (τ1/2 ≈ 2 мин) мономер ной и димерной рекомбинантной чБуХЭ (рчБуХЭ) из кровотока [11]. Таким образом, основные усилия в разработке эффективного терапевтического пре парата были сосредоточены на повышении продук ции рчБуХЭ [12] и улучшении фармакокинетики препаратов на ее основе за счет химической конъ югации с полиэтиленгликолем [13-16], полисиало выми кислотами (ПСА) [17] или продукцией в виде рчБуХЭ, слитой с сывороточным альбумином че ловека [18]. Недавно мы показали [19], что высокого уровня продукции и одновременно более значитель ного увеличения фармакокинетических характери стик рчБуХЭ можно добиться за счет in vivo тетра меризации рчБуХЭ. Нами показано, что, имитируя естественный процесс тетрамеризации рчБуХЭ [20] в общепринятой экспрессионной системе клеток линии CHO, можно добиться эффективной биотех нологической продукции фармакологического пре парата на основе тетрамерной рчБуХЭ (4рчБуХЭ). 4рчБуХЭ, полученная в результате in vivo тетраме ризации, обладала фармакокинетическими харак теристиками (τ1/2 32 ± 1.2 ч, MRT 43 ± 2 ч), сходными с препаратом тетрамерной чБуХЭ из плазмы крови человека [21]. Цель данной работы состояла в изучении возмож ности дальнейшего увеличения фармакокинетиче ских характеристик препарата 4рчБуХЭ за счет хи мического полисиалирования, определении влияния полисиалирования на профиль биораспределения препаратов рчБуХЭ в мышиных моделях. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Биологические препараты рчБуХЭ, использованные в работе 4рчБуХЭ была получена в трансфицированных кон струкцией pFUSE PRAD-F2A-BChE клетках линии CHO-K1, в которых одновременно экспрессируется ген пептида тетрамеризации (PRAD-пептид) и бути рилхолинэстеразы человека [19]. рчБуХЭ получена в виде смеси олигомеров [17] с преимущественным содержанием димерной формы. БуХЭ последова тельно очищена методами аффинной хроматографии с использованием сорбента прокаинамид-сефарозы на колонке XK10/50 (GE Healthcare, США) и ионо обменной хроматографии на колонке MonoQ 5/50 (GE Healthcare, США). По данным электрофореза в поли акриламидном геле с окрашиванием Кумасси и окра шиванием на наличие специфической бутирилхолинэстеразной активности по методу Karnovsky и Roots [22] чистота белка превышала 95%. Химическое полисиалирование препаратов рчБуХЭ Препараты рчБуХЭ были химически конъюгиро ваны с окисленными полисиаловыми кислотами со средней молекулярной массой 24 кДа (Xenetic Biosciences) по реакции восстановительного амини рования согласно [17, 23]. Конъюгацию проводили в 0.1 M калий-фосфатном буфере pH 6.9, молярное соотношение рчБуХЭ : ПСА составляло 1 : 50 в рас чете на мономер рчБуХЭ. Конечная концентрация NaBH3CN - 3 мг/мл. Реакцию проводили в течение 48 ч при 25°С. Полученный в результате конъюгат рчБуХЭ-ПСА очищали от побочных продуктов реак ции многократным диализом с использованием кон центраторов Amicon Ultra-15 30K (Millipore, США). Эффективность модификации определяли с помо щью электрофореза в 8% полиакриламидном геле (с SDS, но без β-меркаптоэтанола). Концентрацию активной рчБуХЭ определяли по методу Эллмана [24] с использованием 1 мМ бутирилтиохолин йодида (Sigma) и 0.5 мМ 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) (Sigma) в 0.1 M калий-фосфатном буфе ре pH 7.0, при 25°С. Образование продукта реакции, 5-тио-2-нитробензойной кислоты, регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм, ис ходя из коэффициента молярного поглощения про дукта 13600 M-1см-1. Концентрацию БуХЭ оценивали исходя из удельной активности 720 единиц активно сти на 1 мг чистой БуХЭ. Определение фармакокинетических параметров препаратов рчБуХЭ и конъюгатов рчБуХЭ-ПСА Концентрацию препаратов рчБуХЭ, рчБуХЭ-ПСА, 4рчБуХЭ и 4рчБуХЭ-ПСА в плазме крови опреде ляли с использованием четырех групп мышей линии BALB/c по 18 животных в каждой. Каждая груп па состояла из трех подгрупп по шесть животных в каждой для временных интервалов 2 мин-3 ч (под группа I), 1 ч-3 дня (подгруппа II) и 1-8 дней (под группа III). Препараты БуХЭ вводили внутривенно в дозе 200 мкг/мышь (подгруппы I и II) и 500 мкг/ мышь (подгруппа III). Образцы крови были отобра ны из глазного синуса через 2, 5, 10, 15, 30 мин, 1, 2, 3, 6, 9, 24 ч, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 дней после введения. Концентрацию БуХЭ в сыворотке крови мышей определяли исходя из ее активности по методу Эллмана [24]. Фармакокинетические характеристики препаратов получены исходя из аппроксимации кривой выведения БуХЭ в рамках двухкамерной модели [17] с использованием программного обеспечения SigmaPlot 12.5 (Systat software). Определение профиля биораспределения препарата рчБуХЭ и конъюгата рчБуХЭ-ПСА Радиоактивную метку 125I в препараты рчБуХЭ и рчБуХЭ-ПСА вводили с использованием хлорами на Т в дозе 106 cpm/мг. Препараты меченой рчБуХЭ и рчБуХЭ-ПСА внутривенно вводили мышам линии BALB/c (три группы по шесть животных для каждо го препарата) в дозе 105 cpm/мышь. Мышей умерщ вляли спустя 0.5, 3 и 48 ч, образцы их крови и тканей отбирали и взвешивали. Отобранные образцы изме ряли с использованием автоматического гамма-счет чика WIZARD (PerkinElmer). Накопление в ткани определяли как отношение удельной радиоактивно сти органа (cpm/г) к удельной радиоактивности кро ви (cpm/мл) в данный момент времени. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Основные успехи, связанные с терапевтическим при менением препаратов рчБуХЭ, достигнуты при ис пользовании рчБуХЭ, химически модифицированной полиэтиленгликолем. Ранее нами было показано [17], что химическое полисиалирование можно использо вать в качестве альтернативной модификации, по зволяющей многократно улучшить фармакокинети ческие характеристики рчБуХЭ. Конъюгаты рчБуХЭ с полисиаловыми кислотами (рчБуХЭ-ПСА) по своим фармакокинетическим характеристикам уступают конъюгатам с полиэтиленгликолем [12, 13, 15], одна ко имеют значительное преимущество перед ними в биоразлагаемости. В данной работе мы сравнили фармакокинетические характеристики препаратов рчБуХЭ-ПСА и 4рчБуХЭ без химической модифи кации [19], а также оценили влияние химического полисиалирования на фармакокинетику конъюгата 4рчБуХЭ-ПСА. Полисиалирование рчБуХЭ и 4рчБуХЭ протекает с эффективностью более 95% и приводит к образо ванию высокомолекулярных продуктов со степенью модификации порядка шести молекул ПСА в расчете на мономер БуХЭ (рис. 1). Полученные в результате конъюгаты рчБуХЭ-ПСА и 4рчБуХЭ-ПСА обладали низкой токсичностью и не вызывали гибель подопыт ных животных после внутривенного введения вплоть до дозы 1500 мг/кг, что, в свою очередь, может сви детельствовать о потенциальной возможности уве личения защитного индекса более чем на порядок относительно данных, полученных ранее для боевого отравляющего вещества VR [17]. Для оценки фармакокинетических характеристик полученных препаратов БуХЭ использовали мы шиную модель внутривенного введения препаратов и определение остаточной бутирилхолинэстеразной активности в сыворотке крови. Уровень эндогенной активности БуХЭ в сыворотке крови мыши состав лял 2.0 ± 0.5 мкг/мл, что позволило с высокой точ ностью оценивать концентрацию введенных препа ратов. На рис. 2 представлены кривые выведения исследуемых препаратов. Очевидно, что практиче ское применение рчБуХЭ без модификации в зна чительной степени затруднено ввиду ее крайне быстрой элиминации из кровотока. Модификация полисиаловыми кислотами позволяет более чем в 5 раз повысить фармакокинетические характеристики рчБуХЭ (таблица), что значительно увеличивает об ласть ее терапевтического применения и позволяет использовать в качестве профилактики отравления ФОТ. В то же время 4рчБуХЭ обладает характери стиками более чем в 2 раза лучшими по сравнению с конъюгатом рчБуХЭ-ПСА, что делает ее лидером среди исследованных препаратов по продолжитель ности циркуляции. Биотехнологическое получение 4рчБуХЭ аналогично рчБуХЭ и значительно более целесообразно экономически, чем получение конъ югата рчБуХЭ-ПСА, поскольку отсутствуют стадии модификации (где используется 50-кратный из быток ПСА) и очистки. В то же время можно было ожидать, что полисиалирование 4рчБуХЭ приведет к еще большему увеличению фармакокинетических характеристик 4рчБуХЭ, однако этого не происхо дит. Фармакокинетика выведения 4рчБуХЭ-ПСА и 4рчБуХЭ в первые сутки практически идентична, в дальнейшем 4рчБуХЭ-ПСА выводится быстрее, чем немодифицированная 4рчБуХЭ. Таким образом, химическое полисиалирование позволяет много кратно повысить фармакокинетические характери стики мономерной и димерной рчБуХЭ, но не улуч шает фармакокинетику 4рчБуХЭ. Так как чБуХЭ присутствует в плазме крови человека исключи тельно в тетрамерной форме, что обеспечивает ее продолжительную циркуляцию, а химическое поли сиалирование 4рчБуХЭ не приводит к улучшению фармакокинетических характеристик 4рчБуХЭ-ПСА по сравнению с 4рчБуХЭ, мы можем предпо ложить, что увеличение продолжительности цир куляции препаратов 4рчБуХЭ связано, в первую очередь, не с увеличением гидродинамического ради уса 4рчБуХЭ. По-видимому, образование комплекса 4рчБуХЭ приводит к маскировке доменов белка, от ветственных за быструю элиминацию рчБуХЭ. С целью изучения влияния химического полиси алирования на профиль биораспределения и нако пления препаратов 4рчБуХЭ провели эксперименты с использованием препаратов, меченных радиоизо топом 125I. Препараты 4рчБуХЭ и 4рчБуХЭ-ПСА вводили внутривенно, и анализировали их накопление в различных компартментах через 0.5, 3 и 48 ч от носительно соответствующей радиоактивности об разцов крови (рис. 3). Показано, что в течение первых 3 ч не наблюдается специфического накопления пре паратов 4рчБуХЭ и 4рчБуХЭ-ПСА в органах, одна ко происходит ярко выраженное выведение с мочой, по-видимому, связанное с продуктами биодеграда ции препаратов. Накопление препаратов в почках и печени происходит спустя 48 ч и значительно бо лее выражено у 4рчБуХЭ. Как уже отмечено ранее, фармакокинетика выведения 4рчБуХЭ и 4рчБуХЭ-ПСА крайне сходна в течение первых 24 ч, что про является также сходством профилей биораспределе ния. В то же время спустя 48 ч фармакокинетические свойства 4рчБуХЭ лучше по сравнению с 4рчБуХЭ-ПСА. По-видимому, это связано с более ярко выра женным накоплением 4рчБуХЭ в почках, что при водит к уменьшению скорости ее выведения. Наряду с этим можно отметить крайне низкую концентра цию препаратов рчБуХЭ в мозге, а также в жировой и мышечной ткани. Остаточная радиоактивность в этих компартментах, по-видимому, связана с на личием кровеносных сосудов, что говорит об ограни ченной способности к проникновению, характерной для препаратов рчБуХЭ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Целью данной работы было изучение влияния аль тернативных подходов к увеличению продолжитель ности циркуляции рчБуХЭ на фармакокинетику препаратов на ее основе. Улучшение фармакоки нетических характеристик рчБуХЭ-ПСА по срав нению с рчБуХЭ, по-видимому, связано в первую очередь с увеличением гидродинамического ради уса рчБуХЭ-ПСА и маскировкой доменов рчБуХЭ (в частности, C-концевой домен чБуХЭ), ответ ственных за тетрамеризацию молекулами ПСА. Аналогичного эффекта можно добиться благодаря продукции 4рчБуХЭ. Использование 4рчБуХЭ пред ставляет экономически привлекательную альтер нативу препаратам на основе модифицированной рчБуХЭ, так как позволяет добиться более высоких фармакокинетических показателей, чем рчБуХЭ и рчБуХЭ-ПСA. Химическая модификация 4рчБуХЭ полисиаловыми кислотами в свою очередь не приво дит к дальнейшему улучшению фармакокинетики 4рчБуХЭ-ПСА, что может свидетельствовать о су ществовании дополнительных естественных меха низмов стабилизации 4рчБуХЭ. Вместе с тем, не обходимо признать, что дальнейшая оптимизация реакции полисиалирования, полная стандартизация процесса химической модификации, а также исполь зование предложенных недавно генетических кон струкций для экспрессии [19] может вновь вывести рчБуХЭ-ПСА в лидеры среди потенциальных анти дотов к ФОТ. Низкая токсичность препаратов на основе 4рчБуХЭ позволяет расширить возможности при менения биологических антидотов в терапии отравлений ФОТ. В то же время стоит отметить, что ис пользование препаратов 4рчБуХЭ ограничено необходимостью введения стехиометрических ко личеств фермента по отношению к ФОТ. Этот факт, в свою очередь, приводит к тому, что защитный ин декс терапии 4рчБуХЭ (отношение LD50 животных после терапии к LD50 без терапии) может быть вы соким лишь в случае боевых отравляющих веществ (т.е. высокотоксичных агентов с низкими значения ми LD50). Дальнейшее улучшение препаратов на ос нове 4рчБуХЭ, по-видимому, должно быть связано с созданием каталитических антидотов - фермен тов, каталитически инактивирующих ФОТ. Это по зволит многократно понизить терапевтическую дозу и расширить возможности данной терапии на слу чаи отравления пестицидами, так как в этом случае высокое значение LD50 приводит к необходимости введения чрезмерно высокого количества препарата 4рчБуХЭ. В то же время при переходе к каталитиче ским антидотам необходимо добиться быстрой и эф фективной (k2/Kм ≈ 107 M-1мин-1) элиминации ФОТ [13], что особенно актуально для терапии отравлений ФОТ [25, 26]. Немаловажное значение в случае раз работки каталитического антидота будет иметь во прос стандартизации клона с высокой продукцией, экономически оправданной для развертывания про изводства, а также его возможной сертификацией по требованиям FDA. В случае препаратов стехиоме трических антидотов на основе рчБуХЭ, рассматри ваемых в данной статье, последнее условие абсолют но выполнимо.

Список литературы

Gunnell D., Eddleston M., Phillips M.R., Konradsen F. // BMC Public Health. 2007, V.7, P.357
Eddleston M., Buckley N.A., Eyer P., Dawson A.H. // Lancet. 2008, V.371, P.597-607
Eddleston M., Eyer P., Worek F., Juszczak E., Alder N., Mohamed F., Senarathna L., Hittarage A., Azher S., Jeganathan K. // PLoS Med. 2009, V.6, e1000104
Nachon F., Brazzolotto X., Trovaslet M., Masson P. // Chem. Biol. Interact. 2013, V.206, P.536-544
Masson P., Lockridge O. // Arch. Biochem. Biophys. 2010, V.494, P.107-120
Masson P., Rochu D. // Acta Naturae. 2009, V.1, №1, P.68-79
Radic Z., Dale T., Kovarik Z., Berend S., Garcia E., Zhang L., Amitai G., Green C., Radic B., Duggan B.M. // Biochem. J. 2013, V.450, P.231-242
Wille T., Thiermann H., Worek F. // Arch. Toxicol. 2014, V.88, P.301-307
Shenouda J., Green P., Sultatos L. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009, V.241, P.135-142
Sun W., Doctor B.P., Lenz D.E., Saxena A. // Chem. Biol. Interact. 2008, V.175, P.428-430
Duysen E.G., Bartels C.F., Lockridge O. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002, V.302, P.751-758
Huang Y.J., Huang Y., Baldassarre H., Wang B., Lazaris A., Leduc M., Bilodeau A.S., Bellemare A., Cote M., Herskovits P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007, V.104, P.13603-13608
Geyer B.C., Kannan L., Garnaud P.-E., Broomfield C.A., Cadieux C.L., Cherni I., Hodgins S.M., Kasten S.A., Kelley K., Kilbourne J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, V.107, P.20251-20256
Rosenberg Y.J., Gearhart J., Mao L., Jiang X., Hernandez-Abanto S. // Chem. Biol. Interact. 2014, V.210, P.20-25
Sun W., Luo C., Tipparaju P., Doctor B.P., Saxena A. // Chem. Biol. Interact. 2013, V.203, P.172-176
Chilukuri N., Sun W., Naik R.S., Parikh K., Tang L., Doctor B.P., Saxena A. // Chem. Biol. Interact. 2008, V.175, P.255-260
Ilyushin D.G., Smirnov I.V., Belogurov A.A., Dyachenko I.A., Zharmukhamedova T., Novozhilova T.I., Bychikhin E.A., Serebryakova M.V., Kharybin O.N., Murashev A.N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013, V.110, P.1243-1248
Huang Y.J., Lundy P.M., Lazaris A., Huang Y., Baldassarre H., Wang B., Turcotte C., Cote M., Bellemare A., Bilodeau A.S. // BMC Biotechnol. 2008, V.8, P.50
Terekhov S., Smirnov I., Bobik T., Shamborant O., Zenkova M., Chernolovskaya E., Gladkikh D., Murashev A., Dyachenko I., Palikov V. // Biochimie. 2015, V.118, P.51-59
Li H., Schopfer L.M., Masson P., Lockridge O. // Biochem. J. 2008, V.411, P.425-432
Saxena A., Ashani Y., Raveh L., Stevenson D., Patel T., Doctor B.P. // Mol. Pharmacol. 1998, V.53, P.112-122
Karnovsky M.J., Roots L. // J. Histochem. Cytochem. 1964, V.12, P.219-221
Smirnov I.V., Vorobiev I.I., Belogurov A.A., Genkin D.D., Deyev S.M., Gabibov A.G. // Methods in Molecular Biology. 2015, V.1321, P.389-404
Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.Jr., Feather-Stone R.M. // Biochem. Pharmacol. 1961, V.7, P.88-95
Worek F., Seeger T., Reiter G., Goldsmith M., Ashani Y., Leader H., Sussman J.L., Aggarwal N., Thiermann H., Tawfik D.S. // Toxicol. Lett. 2014, V.231, P.45-54
Worek F., Seeger T., Goldsmith M., Ashani Y., Leader H., Sussman J.S., Tawfik D., Thiermann H., Wille T. // Arch. Toxicol. 2014, V.88, P.1257-1266

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

Имя пользователя
Пароль
Запомнить меня

Забыли пароль?	Регистрация

Имя пользователя
Пароль
Запомнить меня

Забыли пароль?	Регистрация

Полный текст

Аннотация

Ключевые слова

Полный текст

Об авторах

С. С. Терехов

И. В. Смирнов

O. Г. Шамборант

T. В. Бобик

Д. Г. Илюшин

A. Н. Мурашев

И. A. Дьяченко

В. A. Паликов

В. Д. Кнорре

A. A. Белогуров

Н. A. Пономаренко

E. С. Кузина

Д. Д. Генкин

P. Masson

A. Г. Габибов

Список литературы

Дополнительные файлы

Данный сайт использует cookie-файлы