Сульфоксиды - аналоги L-метионина и L-цистеина как пролекарства против грамположительных и грамотрицательных бактерий

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Проблема поиска новых антимикробных препаратов с минимальным риском индукции быстрой устой чивости к антибиотикам весьма остро стоит в на стоящее время. Многие потенциально эффективные антимикробные средства достаточно быстро дегра дируют в организме человека и обладают повышен ной токсичностью, что затрудняет их применение в концентрации, нужной для терапии. Эту проблему можно решить с помощью концепции пролекарств - препаратов, которые должны подвергнуться метабо лизму в организме пациента. Эту концепцию успеш но применили в противоопухолевой терапии [1]. В представленной работе предложено использо вать этот подход для создания эффективной анти микробной терапии с помощью фармакологической пары: пролекарство и биокатализатор, его метаболи зирующий. Недавно мы показали, что метионин-γ лиаза (МГЛ) [КФ 4.4.1.11] из Citrobacter freundii ка тализирует реакцию β-элиминирования небелковой аминокислоты, (±)-сульфоксида S-(2-пропенил)-L цистеина ((±)-аллиина), с образованием 2-пропентиосульфината (аллицина) - природного антибиотика [2]. МГЛ катализирует реакцию γ-элиминирования L-метионина с образованием метилмеркаптана, α-кетомасляной кислоты и аммиака. Фермент ката лизирует реакцию β-элиминирования L-цистеина и его S-замещенных производных с образованием соответствующих меркаптанов, пировиноградной кислоты и аммиака и реакции замещения у Сβ- и Сγ атомов L-цистеина и L-метионина и их аналогов [3, 4] МГЛ содержится в грибах [5], Arabidopsis thaliana [6], в различных видах бактерий, в том числе в пато генных Aeromonas spp. [7], Clostridium sporogenes [8], Porphyromonas gingivalis [9] и в патогенных простей ших Entamoeba histolytica [10] и Trichomonas vaginalis [11]. Фермент отсутствует у млекопитающих, поэтому может рассматриваться как мишень в пато генах. Такой подход применили с использованием су ицидального субстрата фермента. Катализ реакции γ-элиминирования трифторметионина приводил к об разованию трифтормеркаптана, спонтанно разлагаю щегося до дифторида тиоугольной кислоты, который обладает антимикробной активностью в отношении содержащих МГЛ T. vaginalis [12], P. gingivalis [13], E. histolytica [14]. Однако высокая токсичность дифтори да тиоугольной кислоты не позволяет использовать трифторметионин как антимикробное средство. Аллицин, наиболее известный антимикробный и противоопухолевый компонент чеснока, состав ляет около 70% от общего количества тиосульфи натов [15], образующихся в результате реакции β-элиминирования аллиина, катализируемой ПЛФ зависимой аллииназой [КФ 4.4.1.4] [16] при разру шении чеснока. Антимикробное действие аллицина и других тиосульфинатов, образующихся фермента тивно при разрушении клеток растений рода Allium, во многом объясняется тем, что они окисляют суль фгидрильные группы белков/ферментов бактери альных клеток, в то время как клетки животных частично защищены присутствующим в них глута тионом [17]. Противомикробные, противовоспали тельные, антиоксидантные и антиканцерогенные эффекты органических сульфосоединений, экстрак тов клеток чеснока и лука [18, 19] известны с древ нейших времен. Однако отдельные тиосульфинаты не используются в медицине из-за их высокой ре акционной способности и, как следствие, неустойчи вости. Как индивидуальное биологически активное соединение, наиболее подробно изучен только алли цин, обнаружены его противоопухолевые, антиок сидантные, антибактериальные и противогрибковые свойства [20-22]. Способность МГЛ катализировать реакции γ и β-элиминирования сульфоксида метионина [23] и аллиина [2] с образованием тиосульфинатов позво ляет применить концепцию пролекарств для разра ботки нового антимикробного препарата, используя в качестве пролекарств аллиин и другие субстраты сульфоксиды как источники тиосульфинатов in situ. Ранее мы клонировали ген (megL) C. sporogenes, кодирующий МГЛ с полигистидиновым фрагмен том (His-tag) на N-конце полипептидной цепи, определили некоторые кинетические характери стики рекомбинантного фермента (His-tag МГЛ). МГЛ C. sporogenes катализировала реакцию γ-элиминирования L-метионина с большей скоро стью, чем фермент из C. freundii [24], и обладала луч шей цитостатической активностью в отношении ряда опухолевых клеток [25]. Скорость расщепления физиологического суб страта C. sporogenes МГЛ возрастала в 1.5 раза по сле отщепления His-tag тромбином. В данной работе мы клонировали ген МГЛ C. sporogenes без His-tag. Определены стационарные кинетические параметры реакций γ- и β-элиминирования ряда известных суб стратов и сульфоксидов - аналогов цистеина и мети онина и спектральные характеристики C. sporogenes МГЛ. На твердой среде показана антибактериаль ная активность смесей, содержащих МГЛ из C. sporogenes и C. freundii и сульфоксиды аминокислот. Установлено, что кинетические параметры рекомби нантной ПЛФ-зависимой МГЛ делают принципиаль но возможным использование фермента в конверсии пролекарств - сульфоксидов аминокислот - в тио сульфинаты. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Реактивы, ферменты В работе использовали: пиридоксаль-5’-фосфат, L-метионин, L-цистеин, L-гомоцистеин, L-норвалин, L-норлейцин, L-α-аминомасляную кислоту, ал лиин, S-этил-L-цистеин, S-этил-L-гомоцистеин, L-аланин, О-ацетил-L-серин, лактатдегидрогена зу из мышцы кролика, ДTT, NADH, периодат на трия, этилбромид (Sigma, США); EDТА, протамин сульфат (Serva, США); лактозу (Panreac, Испания); глюкозу, глицерин, сульфат магния, сульфат аммо ния, калий фосфорнокислый однозамещенный, на трий фосфорнокислый двузамещенный («Реахим», Россия); дрожжевой экстракт, триптон (Difco, США); DEAE-сефарозу (GE Healthcare, Швеция); О-ацетил-L-гомосерин получен ацетилировани ем L-гомосерина по описанному ранее методу [26]. 2-Нитро-5-тиобензойная кислота получена согласно [27]. (±)-Сульфоксид L-метионина получали по стан дартной методике [28]. Синтез (±)-сульфоксидов S-этил-L-цистеина и S-этил-L-гомоцистеина прово дили согласно [29-31]. Реакции рестрикции и лигирования проводи ли с использованием ферментов фирмы Promega (США). В работе использовали «рабочий буфер», рН 8.0, содержащий 100 мМ калий-фосфат, 0.1 мМ ПЛФ, 1 мМ ДТТ и 1 мМ EDТА. Штамм Escherichia coli BL21(DE3) F- ompT hsdSB gal dcm (DE3) (Novagen) был использован для экс прессии гена C. sporogenes МГЛ. Штамм E. coli K12 AB2463 - recA- производное штамма E. coli K12, имеет генотип: F-, thr-1 leu-6 proA2 his-4 thi-1 argE3 lacY1 galK2 ara-14 xyl-5 mtl-1 tsx-33 rpsL31 supE44, recA13. Его использовали для клонирования, на работки и хранения плазмиды. Штамм C. freundii ATCC 21434 из American Type Culture Collection (США) любезно предоставлен Р.С. Филлипсом. Штамм 015 Staphylococcus aureus любезно пре доставлен Ю.Ф. Белым. Плазмида с геном D-2 гидроксиизокапроатдегидрогеназы любезно предо ставлена K. Мураторе. Клонирование гена МГЛ из C. sporogenes Плазмида pET28a-megL_sporog сконструирована на основе плазмиды pET28a, содержащей ген megL C. sporogenes с полигистидиновым фрагментом (Histag) и обозначена как pET-28a::megL_s_HT [24]. Методом ПЦР получен ампликон (megL_sporog), со держащий ген megL без His-tag. В качестве матрицы использовали плазмиду pET28a, содержащую ген megL с His-tag. В праймерах был предусмотрен сайт рестрикции NcoI (подчеркнут): megL_sporog:5’-CGCGCGGCAGCCCCATGGAGAA-3’ (прямой), megL_ sporog: 5’-CCGGATCTCAGTGGTGGTGGTG-3’ (об ратный). Ампликон megL_sporog клонировали в векторе pET28a по сайтам NcoI и EcoRI в recA- штамме E. coli AB2463. Контроль клонирования осуществляли пу тем секвенирования вставки. Трансформацию прово дили, используя штамм E. coli BL21(DE3). Выращивание биомассы и выделение фермента Клетки E. coli BL21(DE3), содержащие ген МГЛ без His-tag в плазмиде pET28a megL_sporog, выра щивали на «индуцирующей» среде [32] при 37°C с пе ремешиванием (180 об/мин) в течение 24 ч. Клетки собирали центрифугированием и хранили при -80°C. Клетки разрушали и освобождали от нуклеиновых кислот как описано ранее [33]. Далее очистку прово дили с иcпользованием ионообменной хроматогра фии на колонке с DEAE-сефарозой, уравновешен ной рабочим буфером. Колонку промывали рабочим буфером, содержащим 100 мM KCl. Фермент элюи ровали рабочим буфером, содержащим 500 мM KCl, концентрировали и диализовали против рабочего буфера. Чистоту препарата проверяли при помощи ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях по методу Лэммли [34]. Концентрацию очищенных препаратов определяли, используя коэффициент А1% 278 = 0.8 [23]. Определение активности фермента и параметров стационарной кинетики Активность МГЛ в процессе очистки определяли в реакциях γ- и β-элиминирования, измеряя ско рости образования кетокислот в сопряженной ре акции с D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназой (реакция γ-элиминирования) или лактатдегидро геназой (реакция β-элиминирования) по снижению поглощения NADH при 340 нм (ε = 6220 M-1cм-1) и 30°С. Реакционные смеси содержали рабочий бу фер, 0.2 мМ NADH, 10 ед. лактатдегидрогеназы или 70 мкг D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназы, 30 мМ S-этил-L-цистеина или 30 мМ L-метионина. За единицу ферментативной активности принима ли количество фермента, катализирующее образо вание 1.0 мкМ/мин пирувата (или α-кетобутирата). Удельная активность препаратов фермента, имею щих 95% чистоты, составила 26.8 ед./мг в реакции γ-элиминирования L-метионина и 8.32 ед./мг в реак ции β-элиминирования S-этил-L-цистеина. Стационарные кинетические параметры реак ций γ- и β-элиминирования определяли таким же образом, варьируя концентрации субстратов. Полученные данные обрабатывали согласно уравне нию Михаэлиса-Ментен с использованием програм мы EnzFitter. В расчетах использовали величину мо лекулярной массы субъединицы фермента, равную 43 кДа. Ингибирование реакции γ-элиминирования L-метионина различными аминокислотами изучали в условиях, описанных выше, варьируя концентра цию субстратов и ингибиторов в реакционных смесях. Значения констант ингибирования определяли с по мощью программы EnzFitter. Данные обрабатывали в координатах Диксона [35]. Спектральные исследования Спектр поглощения холофермента регистрирова ли при 25°C на спектрофотометре Cary-50 (Varian, США) в рабочем буфере без ПЛФ. Концентрация фермента - 1.036 мг/мл. Антимикробная активность препаратов Ночные культуры C. freundii и S. aureus, выращен ные на среде Лурия-Бертани (LB-среда) при 37°С, разводили в 100 раз в среде LB и растили при 37°С при перемешивании до оптической плотности 0.2-0.3 при 600 нм. Культуры бактерий рассевали на чаш ки с твердой средой (LB-агар). Смеси МГЛ из разных источников и сульфоксидов аминокислот, предва рительно инкубированные при комнатной темпе ратуре в течение 1 ч, наносили на диски из филь тровальной бумаги диаметром 12 мм, помещенные на чашки. Концентрации МГЛ из C. sporogenes и C. freundii и сульфоксидов составляли 10 и 2.5 мг/мл соответственно. Чашки инкубировали в течение 24 ч при 37°С, затем измеряли зоны ингибирования. Контрольные препараты растворов смесей фермен та с сульфоксидами сохраняли антибактериальную активность в течение 2 недель. Определение аллицина Аллицин, образующийся в смесях, содержащих МГЛ и аллиин, определяли в реакции с 2-нитро-5 тиобензойной кислотой. Смесь МГЛ и аллиина добав ляли к 1 мл 0.1 мМ 2-нитро-5-тиобензойной кислоты в 100 мМ калий-фосфатном буфере, содержащем 0.2 мМ ПЛФ, рН 8.0. Смесь инкубировали в тече ние 30 мин при комнатной температуре. Молярную концентрацию аллицина рассчитывали по умень шению оптической плотности при 412 нм, исполь зуя значение молярного коэффициента поглощения 2-нитро-5-тиобензойной кислоты при 412 нм, равное 28300 М-1см-1 [27]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Кинетические параметры реакций β- и γ-элиминирования Ранее [25] мы определили, что отщепление тром бином His-tag от МГЛ C. sporogenes приводит к по вышению в 1.5 раза активности фермента в физи ологической реакции с L-метионином. В данной работе определены параметры стационарной ки нетики МГЛ C. sporogenes без His-tag в реакции γ-элиминирования пяти субстратов - L-метионина, сульфоксида L-метионина, S-этил-L-гомоцистеина, сульфоксида S-этил-L-гомоцистеина и O-ацетил-L-гомосерина, в реакции β-элиминирования четы рех субстратов - S-этил-L-цистеина, сульфоксида S-этил-L-цистеина, O-ацетил-L-серина и алли ина. В табл. 1 приведены параметры для МГЛ из C. sporogenes, для МГЛ из двух других бактери альных источников и His-tag МГЛ C. sporogenes. У МГЛ C. sporogenes параметр kкат в реакции γ-элиминирования трех субстратов - L-метионина, S-этил-L-гомоцистеина и сульфоксида L-метионина, оказался в 2-3 раза больше, чем у His-tag МГЛ C. sporogenes. Величины Kм для первых двух суб стратов оказались близкими, в случае сульфоксида L-метионина величина Kм была несколько больше, чем у His-tag МГЛ. Фрагмент His-tag не влияет на кинетические параметры реакции β-элиминирования S-этил-L цистеина, величины kкат и Kм у МГЛ практически такие же, как у His-tag МГЛ. Катализ стадии эли минирования боковой группы субстрата в реакциях γ- и β-элиминирования осуществляется разными кислотными группами фермента. Предполагается, что в реакции β-элиминирования, катализируе мой ПЛФ-зависимыми лиазами, такой группой является боковая группа остатка лизина (Lys210 в C. freundii МГЛ), связывающего кофермент [36]. В ПЛФ-зависимых реакциях γ-элиминирования и γ-замещения эта роль приписывается консерва тивному остатоку тирозина (Tyr113 в C. freundii МГЛ), находящемуся в стекинг-взаимодействии с кольцом кофермента [36]. Это предположение подтверждают данные для мутантной формы МГЛ Pseudomonas putida с заменой Tyr114 на Phe [37]. Получены также свидетельства того, что кислотно основные свойства Tyr113 МГЛ С. freundii регули руются триадой Cys115/Tyr113/Arg60 [2]. Arg60 расположен в подвижной N-концевой петле фер мента, и атом азота гуанидиновой группы находится на расстоянии водородной связи от гидроксильной группы Tyr113 в трехмерной структуре холофер мента [38], в структурах комплексов МГЛ с амино кислотами, моделирующими комплекс Михаэлиса [39], и в пространственной структуре внешнего аль димина фермента с глицином [40]. Фрагмент His-tag может влиять на конформацию N-концевой петли и, следовательно, на взаимное расположение ги дроксильной группы Tyr113 и гуанидиновой группы Arg60, что, в свою очередь, может влиять на вели чину рKа гидроксильной группы Tyr113. Возможно, этим объясняется увеличение γ-элиминирующей активности МГЛ C. sporogenes по сравнению с Histag МГЛ. Сравнение ферментов из трех бактериальных ис точников (табл. 1) - P. putida, C. freundii и C. sporogenes, показало, что сродство как к физиологиче скому субстрату, так и к его аналогам практически одинаково. Каталитические эффективности реакции γ-элиминирования L-метионина у МГЛ C. sporogenes и P. putida близки, а величина kкат/Kм у МГЛ C. freundii несколько меньше. Кинетические параме тры реакции β-элиминирования S-этил-L-цистеина у трех ферментов очень близки. МГЛ C. sporogenes катализирует реакцию γ-элиминирования сульфоксида L-метионина с ката литической эффективностью на порядок большей, чем в реакции γ-элиминирования сульфоксида S-этил-L гомоцистеина. Скорость реакции β-элиминирования сульфоксида S-этил-L-цистеина, катализируе мой ферментом, в 15 раз меньше скорости реак ции γ-элиминирования сульфоксида L-метионина, но за счет большего сродства МГЛ C. sporogenes к это му субстрату каталитическая эффективность практи чески одинакова. В реакциях с сульфоксидами амино кислот наиболее эффективно фермент катализирует реакцию β-элиминирования аллиина. Фермент из C. sporogenes более эффективно ка тализирует реакцию γ-элиминирования сульфокси да L-метионина, чем МГЛ C. freundii (величины kкат больше в 2.5 раза). Скорость расщепления аллиина МГЛ C. sporogenes почти в 2 раза больше, чем у фер мента C. freundii, сродство к субстрату в 3 раза, а эф фективность катализа в 6.3 раза выше. Аминокислоты с неразветвленной боковой це пью ингибировали реакцию γ-элиминирования L-метионина по конкурентному типу. В табл. 2 при ведены константы ингибирования МГЛ из C. sporogenes, C. freundii и P. putida. У всех этих ферментов наблюдается улучшение связывания с увеличени ем количества метиленовых групп в аминокислотах с неразветвленной боковой цепью, что, вероятно, объясняется гидрофобным характером активных центров фермента из P. putida [41] и C. freundii [38]. Возможно, значительное возрастание срод ства при переходе от L-норвалина к L-норлейцину у фермента из трех источников и близкие значе ния величин Ki L-норлейцина и Kм для L-метионина и S-этил-L-цистеина объясняются наличием «карма на» для метильной группы аминокислот в активных центрах МГЛ. Спектральные характеристики фермента Спектр поглощения холофермента МГЛ C. sporogenes (рис. 1) при рН 8.0 сходен со спектром МГЛ C. freundii [23] с преобладающей полосой в области 422-425 нм, принадлежащей внутреннему альди мину в форме кетоенамина (рис. 1, структура II). Как и у His-tag МГЛ C. sporogenes [24], спектр содер жит интенсивную полосу поглощения с максимумом в области 502-505 нм, которую в спектрах комплек сов ПЛФ-зависимых ферментов с аминокислотами и модельными соединениями приписывают хиноид ному интермедиату [42]. Разложение спектра холофермента с использова нием логнормальных кривых в области 300-500 нм проводили согласно [23]. В табл. 3 приведены пара метры полос поглощения, полученные в результате разложения. Внутренний альдимин, помимо кетое намина (рис. 1, структура II, ε = 10410 М-1с-1), описы вается минорными структурами, енольным тауто мером (рис. 1, структура I) и двумя конформерами кетоенамина, с альдиминной связью, перпендику лярной плоскости кольца кофермента (поглощает в области 380 нм), и с альдиминной связью, частично выведенной из плоскости кольца, но сохраняющей сопряжение с π-электронами кофактора и водо родную связь между альдиминным азотом и 3’-ок сигруппой ПЛФ (поглощает в области 327-328 нм). Ионная форма внутреннего альдимина и таутомер ное равновесие практически такие же, как у МГЛ C. freundii. Идентификация поглощения в области 502-505 нм нуждается в дополнительных исследо ваниях. Антимикробная активность смесей МГЛ C. freundii и C. sporogenes с сульфоксидами аминокислот Антибактериальная активность смесей МГЛ из двух источников с сульфоксидами аминокислот прове рена на культурах бактерий - грамположительной S. aureus и грамотрицательной C. freundii (табл. 4). Все смеси показали бактериостатический эффект в отношении грамположительных и грамотрица тельных бактерий. Наиболее значительный эф фект наблюдали для культуры S. aureus ( рис. 2). Бактериостатический эффект был сравним с ингиби рованием роста бактериальных клеток канамицином. Зоны ингибирования канамицином (0.05 мг) и смесью, содержавшей 0.04 мг аллицина, на культуре C. freundii составили 314 и 346 мм2. Таким образом, полученные данные показали, что клонированный фермент эффективно катализи рует конверсию сульфоксидов аминокислот в тио сульфинаты. Это позволяет предположить, что фар макологическая пара МГЛ и сульфоксид может обеспечить образование тиосульфинатов в количе ствах, достаточных для терапевтических целей. ВЫВОДЫ МГЛ катализирует реакции γ- и β-элиминирования сульфоксидов - аналогов метионина и цистеина - с каталитическими эффективностями, сравнимыми с эффективностями реакций γ- и β-элиминирования этих аминокислот. На твердой среде показано, что смеси МГЛ с суль фоксидами перспективны как антимикробные сред ства против грамположительных и грамотрицатель ных бактерий in situ. Наибольший бактериостатический эффект сме си МГЛ с сульфоксидами аминокислот оказывают на грамположительную бактерию S. aureus, и бак териостатический эффект аллицина, полученного in situ, сравним с эффектом канамицина.

Об авторах

Н. В. Ануфриева

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

E. A. Морозова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

В. В. Куликова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

Н. П. Бажулина

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

И. В. Манухов

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Email: tvd@eimb.ru
Россия

Д. И. Дёгтев

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Email: tvd@eimb.ru
Россия

E. Ю. Гнучих

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Email: tvd@eimb.ru
Россия

A. Н. Родионов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

Г. Б. Завильгельский

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Email: tvd@eimb.ru
Россия

T. В. Демидкина

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: tvd@eimb.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы