Роль липидного окружения в процессе димеризации трансмембранных доменов гликофорина А

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Белок-белковые взаимодействия играют важную роль в формировании супрамолекулярных комплек сов, выполняющих важнейшие функции в клетке. Изучение этих взаимодействий особенно затруднено в случае мембранных белков (МБ), так как они теряют свои нативные свойства в немембранном окружении. Поскольку наиболее часто встречающимся струк турным элементом в трансмембранных (ТМ) доменах МБ является α-спираль, то в ряде случаев исследование белок-белковых взаимодействий сводится к изучению поведения ТМ α-спиралей в мембране. Именно оно определяет пространственную структуру мембраносвязанных участков ионных каналов [1-4] и функционирование битопных (т.е. имеющих лишь одну ТМ-спираль) мембранных белков, в частности рецепторных тирозинкиназ (РТК) [5-9]. Показано, что для активации РТК необходимо формирование ди меров или олигомеров, причем в процессе ассоциации участвуют именно ТМ-домены [6, 10-12]. В случае на рушения работы этих МБ развиваются серьезные за болевания, такие, как сахарный диабет или рак, поэто му их исследование особенно важно. Показано, что ряд нарушений работы РТК связан непосредственно с мутациями в ТМ-доменах [13-16]. Перспективной представляется разработка терапевтических агентов, так называемых «пептидов-перехватчиков», селек тивно действующих на ТМ-сегменты белка-мишени, однако для решения этой задачи необходимо понима ние всех деталей молекулярного механизма передачи сигнала через эти домены целевых РТК [17-20]. Таким образом, взаимодействие α-спиралей в мембране яв ляется ключевым процессом, детали которого еще требуют подробного изучения. Cреди экспериментальных методов исследова ния взаимодействия ТМ-доменов можно выделить использование гибридных молекулярно-биологиче ских конструкций с белками-маркерами, например FRET [21] и TOXCAT [22], а также определение про странственной структуры димеров методом спек троскопии ядерного магнитного резонанса в средах, имитирующих мембранное окружение [5, 23-25]. Обе группы подходов дают хорошие результаты, однако они связаны со сложными и длительными процесса ми экспрессии и наработки целевых белков, а также с трудностями стабилизации олигомерных состояний в мембраноподобном окружении. Поэтому для реше ния задачи все чаще используют методы компью терного моделирования, позволяющие эффективно оценивать параметры белковых комплексов. В част ности, для изучения роли среды и влияния мутаций на димеризацию ТМ-доменов МБ используют метод оценки свободной энергии ассоциации с применением расчетов молекулярной динамики (МД) [11, 12, 26, 27]. На основании результатов анализа аминокис лотных последовательностей ТМ-доменов ряда МБ, в частности гликофорина А (GpA), предложе на концепция «мотивов димеризации», характерных остатков, которые располагаются в области контакта и определяют взаимодействие между α-спиралями [28-31]. Так называемый «гликофориновый» мотив димеризации включает два остатка глицина, разде ленных в последовательности тремя другими остат ками, и обозначается GG4. Этот мотив обнаружен и у других белков [5], однако в некоторых случаях он оказывался нефункциональным [9]. Гликофорин до сих пор считается хорошей моделью для теоре тического и экспериментального изучения влия ния точечных мутаций и свойств среды на диме ризацию ТМ-спиралей [27, 29, 32-34]. Несмотря на то что в рассматриваемых работах ключевая роль в формировании димера отводится белок-белковым взаимодействиям, показано, что на димеризацию оказывают влияние параметры липидной мембраны [35-37]. Эти различия объясняли работой принци па гидрофобного соответствия, когда для наиболее эффективного встраивания белка в мембрану дли на области гидрофобных остатков в спирали должна быть равна толщине гидрофобной области липидного бислоя [38]. Известно, что липидная мембрана не является го могенной средой, а склонна к формированию класте ров липидов даже в простейших модельных системах [39, 40]. Белки же, в свою очередь, часто содержат на своей поверхности сайты связывания молекул фосфолипидов и холестерина, которые могут моду лировать их активность [4, 21, 41, 42]. Встраивание любого белка в мембрану вызывает изменение ее свойств [43, 44], а процесс димеризации может ин дуцировать более сложные эффекты [40, 45]. Таким образом, взаимодействие ТМ-доменов МБ не огра ничивается лишь поиском наиболее выгодных белок белковых контактов, а представляет собой сложную комбинацию вкладов взаимодействий белков и среды. Следовательно, возникает вопрос о количествен ной оценке вклада эффектов мембранной среды в свободную энергию димеризации ТМ-доменов белка. Более того, необходимо установить роль каж дого аминокислотного остатка в данном процессе. Важную информацию можно получить, изучая воз действие точечных мутаций в аминокислотной по следовательности на распределение вкладов в энер гию белка и окружения. В настоящей работе изучено влияние двух мутаций в ТМ-домене GpA на процесс формирования димера. Были выбраны замены, вли яющие на разные факторы димеризации: мутация Gly83Ala, нарушающая плотную упаковку спира лей, и Thr87Val, делающая невозможной образова ние межмолекулярной водородной связи. Для из учения на атомарном уровне применяли метод МД в явно заданном цвиттер-ионном липидном бислое. Полученные результаты позволяют сделать вывод о доминирующей роли мембраны на начальном этапе формирования димера и о различных молекулярных механизмах нарушения ассоциации ТМ-комплексов в мутантных белках. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Исследуемые системы Для исследования выбрали две мутации, затрагива ющие наиболее важные для димеризации аминокис лотные остатки ТМ-домена гликофорина А: Gly83Ala и Thr87Val [46, 47]. Аминокислотные последователь ности пептидов приведены в табл. 1. Мономеры и димеры ТМ-домена изучали в гидратированных липидных бислоях из пальмитоилолеилфосфатидил холина (ПОФХ). В мономерах белок представляли в виде идеальной α-спирали; начальную конформа цию димера строили на основании эксперименталь ной структуры димера GpA дикого типа (PDB ID: 2KPF [48]). Модели димеров мутантных форм GpA строили по гомологии, заменяя соответствующие остатки, с последующей энергетической релаксаци ей структуры. Модели белка помещали в липидный бислой (128 молекул ПОФХ), добавляли молекулы воды с помощью утилиты genbox. Размер расчетной ячейки составлял 6.5 × 6.5 × 7.5 нм3. Молекулярная динамика Траектории МД рассчитывали с использованием программного пакета GROMACS версии 4.6.7 и си лового поля GROMOS96 43a2 [49]. Шаг интегриро вания составлял 2 фс, использовали периодические граничные условия по всем направлениям. Расчет производили при постоянном давлении 1 атм и тем пературе 315 К. Давление в системе контролировали с помощью алгоритма баростата Берендсена [50]. Применяли раздельные схемы термостатирования для белка, липидов и воды, алгоритм V-rescale [51]. Электростатические взаимодействия рассчиты вали с использованием суммирования по Эвальду, ван-дер-ваальсовы взаимодействия - потенциала Леннарда-Джонса с двойной отсечкой на расстоя нии 1.0/1.2 нм. Перед расчетом траектории МД проводили мини мизацию энергии системы методом наискорейше го спуска (50000 шагов), а затем в течение первых 50 пс МД температуру в системе линейно повышали с 5 до 315 К. Для релаксации мембранного окруже ния сначала рассчитывали траекторию длиной 5 нс с зафиксированной молекулой белка, а затем 50 нс без каких-либо ограничений. Стабильность димера анализировали по изменению углов скрещивания осей α-спиралей и наклона относительно плоскости бислоя, изменению вторичной структуры, а также по значению среднеквадратичного отклонения (СКО) координат атомов основной цепи в структуре белка от начальных значений. Расчет свободной энергии димеризации α-спиралей Профили свободной энергии ассоциации ТМ-доменов рецептора получали методом интегрирования сред ней силы, действующей между мономерами. В каче стве координаты реакции использовали расстояние между центрами масс пептидов. Для этого создавали набор состояний димера, характеризующихся раз личным расстоянием между мономерами (32 точки, от 0.75 до 2.10 нм с шагом 0.05 нм). Начальные состо яния получали путем параллельного переноса моно меров на заданное расстояние вдоль прямой, прохо дящей через их центры масс. Релаксацию мембраны в МД производили в течение 50 нс, длина расчетной траектории также составляла 50 нс. Для каждого из состояний рассчитывали значение средней силы, действующей между мономерами белка, и инте грировали. В полученных энергетических профи лях оценивали ошибку путем независимого расчета для пяти неперекрывающихся фрагментов каждой траектории МД. Для каждой системы провели по два независимых расчета, суммарная длина используе мых траекторий МД составила около 10 мкс. Разложение энергии взаимодействия α-спиралей на компоненты Для разложения суммарного энергетического про филя на составляющие использовали следующий подход: по координатам атомов на каждом шаге МД заново рассчитывали силы, учитывая лишь вклады тех подсистем, влияние которых хотели установить. Далее эти силы усредняли по длине траектории МД, проецировали на направление, соответствующее ко ординате реакции, и интегрировали. При построении диаграмм распределения вкладов отдельных амино кислотных остатков выбирали значения энергии, со ответствующие глобальному минимуму в суммарном профиле потенциала средней силы. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Стабильность пептидов в липидном бислое Показано, что в ходе МД все модели ТМ-доменов GpA стабильны по набору исследуемых параметров. Так, не наблюдали расплетания α-спиралей в цен тральной части, углы скрещивания осей α-спиралей в димерах были близки к начальным значениям (табл. 2). В случае мономеров наблюдали наклон спи рали относительно нормали мембраны, обусловлен ный подстройкой пептида под окружение - так назы ваемый эффект гидрофобного соответствия. Во всех системах происходило частичное расплетание кон цов спиралей в области контакта с водой. В димере GpA дикого типа, а также в мутанте Gly83Ala на блюдали образование остатками Thr87 межмолеку лярной водородной связи, которая рассматривается как один из важных факторов, стабилизирующих димер. Тем не менее димер с мутацией Thr87Val, де лающей такую связь невозможной, стабильно суще ствовал в МД и не отличался значительно по ругим параметрам. Свободная энергия димеризации α-спиралей GpA Полученные профили энергии ассоциации всех трех изучаемых систем свидетельствуют о наличии ста бильного димерного состояния у каждого из белков, однако глубина минимума энергии различается (рис. 1А). Так, мутант Thr87Val обладает очень не большой (по модулю) свободной энергией димери зации (-16 ± 3 кДж/моль) по сравнению с димером дикого типа (-60 ± 3 кДж/моль). Мутация Gly83Ala также ослабляет димеризацию, но не так сильно (-30 ± 5 кДж/моль). Таким образом, поведение исследу емых пептидов различается. Для более детально го исследования различий построили аналогичные энергетические профили непосредственного взаи модействия белок-белок без учета вкладов липидов и воды (рис. 1Б). Оказалось, что мутант Gly83Ala практически не отличается по энергии от димера дикого типа, имеет энергетический профиль той же формы и глубины, в то время как мутант Thr87Val и в данном случае является значительно более сла бым. Таким образом, мутация Gly83Ala затрагивает взаимодействие ТМ-домена GpA с липидным окру жением, а не прямой контакт мономеров. При срав нении кривых можно также заметить, что в случае суммарных профилей энергии минимумы смещены в сторону меньших расстояний по сравнению с про филями, характеризующими белок-белковые вза имодействия. Таким образом, мембрана «приводит» мономеры в более плотный контакт по сравнению с их равновесным положением без учета эффектов среды. Вклады аминокислотных остатков При детальном изучении распределения энергетиче ских вкладов по остаткам было показано, что остат ки, лежащие на интерфейсе димеризации, могут формировать энергетически невыгодные контакты (Gly79, Val80, Gly83, Thr87), в то время как основ ной вклад, способствующий образованию комплек са, вносят остатки, взаимодействующие с мембраной (Phe78, Ala82, Ile89, Tyr93) (рис. 2А). Влияние мутации Thr87Val ярко проявляется в белок-белковых взаимодействиях, в то время как мутация Gly83Ala в этом случае вызывает компенсационный эффект (рис. 2Б). Таким образом, влияние этих двух мутаций имеет различную природу: замена Thr87Val нару шает белок-белковые взаимодействия, делая невоз можной водородную связь, в то время как Gly83Ala приводит к незначительной перестройке структуры, дестабилизируя взаимодействие димера с мембран ным окружением. Здесь также следует отметить, что остаток Gly83 в димере с липидами не взаимо действует и опосредованно влияет на всю структуру, улучшает общую упаковку в белок-белковых контак тах (табл. 2, рис. 1Б), но ухудшает взаимодействие с мембранным окружением. Таким образом, при опи сании взаимодействия α-спиралей в мембране не достаточно рассмотрения белок-белковых взаимо действий и плотности упаковки белковой структуры. Липидное окружение может вносить не меньший вклад в стабилизацию димерных форм, поэтому важно также изучение эффектов, оказываемых ТМ пептидами той или иной природы на мембрану. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты атомистического моделирования взаи модействия ТМ-доменов гликофорина А и двух его мутантных форм показывают, что липидная мембра на играет важную роль в образовании димера наряду с непосредственным контактом между мономерами. Один из основных выводов настоящей работы со стоит в том, что взаимодействия между лежащими на интерфейсе спираль-спираль остатками ТМ сег ментов белков часто являются энергетически невы годными. Это, однако, компенсируется выгодными вкладами в суммарную свободную энергию системы контактов белок-среда. Предложены два различных сценария нарушения ассоциации ТМ-спиралей GpA, вызванного точечными мутациями. Так, мутация Thr87Val напрямую нарушает белок-белковые вза имодействия, а замена Gly83Ala вызывает опосре дованный эффект, влияя на мембранное окружение рецептора. Таким образом, водно-липидная среда активно участвует в функционировании рецептор ных систем клетки, и ее роль необходимо учитывать при рассмотрении работы мембранных белков, а так же при рациональном конструировании новых мо лекул, способных заданным образом модулировать работу сигнальных и других мембранных систем, в первую очередь, рецепторных тирозинкиназ.

Об авторах

A. С. Кузнецов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: r-efremov@yandex.ru
Россия

П. E. Волынский

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: r-efremov@yandex.ru
Россия

Р. Г. Ефремов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Национальный исследовательский университет Высшая школа экономики; Межведомственный суперкомпьютерный центр РАН

Email: r-efremov@yandex.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы