Аттенуация вируса осповакцины

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В 1980 году после объявления о ликвидации нату ральной оспы Всемирной организацией здравоохра нения было рекомендовано прекратить вакцинацию людей против данного особо опасного заболевания [1]. Такое решение было обусловлено тем, что привив ки вируса осповакцины (ВОВ) могли в ряде случаев приводить к тяжелым поствакцинальным осложне ниям, иногда со смертельным исходом [1, 2]. В результате отказа от вакцинации против нату ральной оспы в человеческой популяции с каждым годом становится все меньше людей со специфиче ским иммунитетом против данного заболевания. Это делает человечество беззащитнее не только перед возможным инфицированием вирусом натуральной оспы (ВНО), но и другими близкородственными ор топоксвирусами, природным резервуаром которых служат различные животные, в первую очередь, грызуны [3]. К таким вирусам относятся вирусы оспы обезьян (ВОО) и оспы коров (ВОК), вызывающие оспоподобные заболевания животных и человека. Распространение этих вирусов в человеческой попу ляции потенциально может привести к их адаптации к защитным системам организма человека и появ лению вирусных вариантов, эпидемически опасных для людей [3, 4]. В последние годы в различных реги онах мира стали регистрировать необычно массовые вспышки ортопоксвирусных инфекций среди людей [3]. Кроме того, большую опасность представляет по тенциальная возможность использования ВНО в ка честве агента биотеррористических атак [5]. Единственным эффективным методом борьбы с возрастающей угрозой ортопоксвирусных инфек ций человека является вакцинопрофилактика [1, 2]. Накопление в последние десятилетия в человеческой популяции иммунодефицитных состояний привело к тому, что использование классических живых вак цин на основе ВОВ для вакцинации населения сейчас противопоказано, так как может привести к боль шому числу побочных реакций и более тяжелым их проявлениям, чем во время кампании ликвидации натуральной оспы. Поэтому существует настоятель ная потребность в создании современных антиорто поксвирусных вакцин, которые должны быть зна чительно безопаснее по сравнению с предыдущими поколениями противооспенных вакцин и при этом высокоиммуногенны, обеспечивая надежную защиту от вирусной инфекции. Первые аттенуированные штаммы ВОВ были по лучены в результате множественных пассажей ви руса на культуре фибробластов куриных эмбрионов (штамм MVA) [6] или культуре клеток почки кролика (штамм LC16m8) [7]. В этих случаях аттенуация ви руса была обусловлена спонтанными протяженными делециями и мутациями в вирусном геноме. При этом могут затрагиваться не только гены вирулентности, но и гены, функции которых определяют репли кативные свойства вируса и круг чувствительных к нему хозяев [5]. С развитием методов молекулярной биологии ста ло возможным создавать модифицированные вари анты ВОВ путем введения нужных последователь ностей в вирусный геном, удаления или нарушения генов самого вируса [8]. Выключение генов виру лентности способно существенно снизить патоген ные свойства ВОВ. Одно из наиболее перспективных направлений таких работ - создание методами гене тической инженерии высокоаттенуированных вари антов ВОВ, обладающих иммуногенностью и протек тивностью на уровне классической противооспенной вакцины, но при этом с меньшей патогенностью. Секвенирование полных геномов различных штаммов и разных видов патогенных для человека ортопоксвирусов [9-12], накопление данных о функ циях многочисленных генов этих вирусов [2, 13, 14], а также разработка методов введения направленных изменений в вирусный геном [15, 16] позволили нам сформулировать и реализовать новый подход к соз данию высокоаттенуированных вариантов ВОВ. Этот подход состоит в строго локализованном последова тельном удалении или инактивации индивидуальных генов вирулентности, не затрагивающем функции репликации вируса в культуре клеток и не влияю щем на круг хозяев, чувствительных к вирусу. Цель данной работы состояла в создании рекомби нантного варианта ВОВ с пятью нарушенными генами вирулентности, потенциального кандидата на исполь зование в качестве живой аттенуированной вакцины нового поколения для профилактики натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций челове ка, и в изучении биологических свойств этого виру са. Свойства полученного штамма ВОВ 1421ABJCN, такие, как репродукция на перевиваемых культурах клеток млекопитающих, патогенность для мышей и кроликов, специфичная иммуногенная активность, защита экспериментальных животных от инфициро вания летальными дозами высоковирулентного орто поксвируса, сравнивали со свойствами родительского штамма LIVP (клоновый вариант). Эти свойства ор топоксвирусной вакцины относятся к одним из важ нейших, изучаемых при проведении доклинических исследований новых вакцин [17]. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Бактерии, вирусы, культуры клеток В работе использовали бактериальные штаммы Escherichia coli JM109 и XL2-blue, а также штамм LIVP ВОВ (производный штамма Lister, полученный в Институте вирусных препаратов, Москва) и штамм К-1 вируса эктромелии (ВЭ) из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1, Vero и 4647 из коллекции клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Плазмиды интеграции Плазмиды интеграции, предназначенные для деле тирования целевых генов ВОВ, получены на основе векторной плазмиды pMGC20-gpt, несущей селек тивный ген gpt E. coli под контролем 7.5К-промотора ВОВ [16] (рис. 1). Методом ПЦР получали два фраг мента генома ВОВ (штамм LIVP), фланкирующие делетируемый ген слева (L-flank) и справа (R-flank) (рис. 1, 2). В плазмиду pMGC20-gpt встраивали од новременно оба фланкирующих фрагмента ДНК для каждого гена, расщепленных после ПЦР соот ветствующими эндонуклеазами рестрикции, сай ты узнавания которых были введены в нуклеотид ную последовательность ПЦР-праймеров (рис. 2). Структура плазмид pΔB8R, pΔC3L, pΔA56R и pΔN1L подтверждена рестрикционным анализом и секвени рованием. Ранее полученная плазмида pΔTK содержит по следовательность MCS, приводящую к инактивации вирусного гена тимидинкиназы (J2R) в результате сбоя рамки трансляции [18]. Получение ВОВ с делецией/нарушением генов вирулентности ВОВ выращивали в культуре клеток CV-1, исполь зуя поддерживающую среду ДМЕМ с добавлением 2% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота. Все мутантные варианты ВОВ получали методом временной доминантной селекции, описанным ра нее [16]. После четырех-пяти пассажей в условиях селекции (до получения ЦПД) вирус клонировали через бляшку под агарозным покрытием [19]. Далее эти клоны подращивали в неселективных условиях и клонировали повторно. ДНК из отобранных клонов рекомбинантных ВОВ выделяли согласно [15]. По ре зультатам ПЦР отбирали по одному реклону от двух трех клонов, подращивали на культуре CV-1, титро вали методом бляшек [19]. ПЦР-анализ ДНК рекомбинантных вирусов В ДНК клонов рекомбинантных ВОВ методом ПЦР выявляли целевые делеции/инсерции с использо ванием соответствующих пар олигонуклеотидных праймеров. Для ΔВ8R: 5’-TCACAAATATGATGGTGATGAGCGA-3’ 5’-CGTGATATACCCTAGCCATAGGCAT-3’. Для ΔC3L: 5’-TCGCGCTTTACATTCTCGAATCT-3’ 5’-TGTTCGTGTGTTCTTGCGGTGA-3’. Для ΔA56R: 5’-GTGGTATGGGACACCACAAATCCAA-3’ 5’-ATTAAACATTCCTAGAATTAATCCCGCTC-3’. Для ΔN1L: 5’-GGGTTGGATCCTTTACACATAGATCTACTACAGGCGGAACA- 3’ 5’-GGGAAAGCTTAATTTGTGAAGATGCCATGTACTACGCT- 3’. Для J2R-MCS: 5’-ATATGTTCTTCATGCCTAAACGA-3’ 5’-ATGAAGGAGCAAAAGGTTGTAAC-3’. ПЦР проводили в 0.2 мл тонкостенных микропро бирках (Applied Biosystems, США) в амплификато ре GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США). В реакции использовали реактивы: SE-буфер для Taq-ДНК-полимеразы, трифосфаты и Taq- ДНК-полимеразу производства фирмы «СибЭнзим» (г. Новосибирск, Россия), стерильную деионизован ную воду. ПЦР проводили по программе: 1.5 мин при 940C; затем 20 циклов: 20 с при 940C, 30 с при 550C и 1 мин при 720С. После последнего цикла пробирки прогревали в течение 5 мин при 720С. Продукты ам плификации хранили при температуре 4оC до про ведения электрофоретического анализа. Определение динамики роста мутантных вариантов ВОВ Для изучения динамики развития клона 14 исходного ВОВ LIVP и мутантных штаммов с нарушением ге нов вирулентности 90-100% монослой клеток линий CV-1 или Vero, полученный на шестилуночных план шетах, инфицировали вирусами с множественностью заражения 0.1 БОЕ/кл. Во временных точках 0, 24, 48 и 72 ч после инфицирования титр вируса определяли традиционным методом бляшек. Наработка и очистка вирусов для инфицирования мышей Монослой клеток линии 4647, рекомендованной для производства противооспенной вакцины [20], вы ращенный на культуральных матрасах с ростовой поверхностью 175 см2 (объем 650 мл), инфицирова ли ВОВ с множественностью заражения 1.0 БОЕ/кл. Инкубировали в течение 48 ч при температуре 37°С до образования полного ЦПД, 80% поддерживающей среды удаляли, а в 20% (около 20 мл) получали кри олизат (три цикла замораживания-оттаивания) ин фицированных клеток, обрабатывали его на ультра звуковом дезинтеграторе типа MSE 500 мощностью 22 кГц 2-3 раза по 10-15 с. От клеточного дебриса освобождались низкоскоростным центрифугирова нием (10 мин при 4000 g). Супернатант центрифу гировали в течение 1.5 ч при 30000 g. Осадок вируса суспендировали в 4 мл физиологического раствора. Инфекционный титр образцов определяли методом бляшек в монослое клеток 4647. Животные В зависимости от поставленных задач использова ли мышей линии Balb/c, самок весом 14-16 г (воз раст 4-5 нед.) или 1-2-дневных сосунков этой же линии весом 5-6 г. Животных объединяли в группы по 10 особей. Также использовали кроликов поро ды Шиншилла весом 2.5-3 кг. Все животные были получены из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Эксперименты с животными проводили с соблюдени ем «Правил проведения работ с использованием экс периментальных животных» в соответствии с прото колом, утвержденным Комиссией по биоэтике ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Оценка вирулентности штаммов ВОВ Для оценки нейровирулентности штаммов ВОВ 1-2-дневным мышам-сосункам интрацеребрально вводили рекомбинантный ВОВ 1421ABJCN или ис ходный клоновый вариант 14 ВОВ LIVP, разведен ные на физиологическом растворе, в количестве 102 БОЕ/0.01 мл/мышь. Животным контрольной группы вводили равный объем физиологического раствора. За животными наблюдали в течение 8 сут, учитывали количество погибших. Для определения репликации вируса в тканях го ловного мозга мышей-сосунков, инфицированных по аналогичной схеме, подвергали эвтаназии мето дом цервикальной дислокации через 3 сут после за ражения, стерильно извлекли пробы головного мозга. Пробы от животных из одной группы объединяли, готовили 10% тканевые суспензии на среде ДМЕМ по методике, описанной в [21]. Затем определяли ти тры вирусов традиционным методом бляшек в моно слое культуры клеток 4647. Вирулентность штаммов ВОВ при внутрикожном введении оценивали на кроликах, которым предва рительно удаляли шерсть на боках. Делали шесть 10-кратных разведений штаммов ВОВ на физиологи ческом растворе до содержания 102-107 БОЕ/0.05 мл, которые вводили животным внутрикожно в указан ном выше объеме, каждое разведение - в два от дельных участка кожи. На одном боку животного исследовали ВОВ 1421ABJCN, на другом - исход ный ВОВ LIVP. Наблюдение за животными прово дили в течение 14 сут. Определяли время появления и заживления инфильтратов в зависимости от титра и от штамма вируса. Иммуногенность вирусов Способность вирусов индуцировать выработку специфичных антител определяли по вирусней трализующей активности сывороток крови, инфи цируя 4-5-недельных мышей подкожно вируса ми 1421ABJCN или LIVP в дозах 106, 107 или 108 БОЕ/0.1 мл/мышь. Мышам контрольной группы вводили равный объем физиологического рас твора, на котором готовили разведения вируса. Иммунизацию проводили дважды с интервалом 28 сут. Через 28 сут после второй иммунизации (через 56 сут после первой) у предварительно наркотизи рованных мышей отбирали пробы крови из ретро бульбарного венозного сплетения, инкубировали их при 40С в течение 24 ч для формирования фибри нового сгустка. Сывороточную фракцию отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 5000 g. Препараты сывороток каждой группы объединяли и прогревали при 560С в течение 30 мин для инакти вации системы комплемента. Титр вируснейтрализу ющих антител определяли на культуре клеток 4647 согласно [22]. Протективность штаммов ВОВ Способность вирусных штаммов формировать защит ный иммунитет против ортопоксвирусной инфекции определяли на 4-5-недельных мышах, иммунизиро ванных дважды по схеме эксперимента по изучению иммуногенности штаммов ВОВ. Через 28 сут после второй иммунизации животных в состоянии легкого эфирного наркоза подвергали интраназальной ино куляции высокопатогенным для мышей ВЭ в дозе 10 LD50/0.02 мл/мышь согласно [23]. Наблюдение за животными вели в течение 14 дней, учитывая ко личество выживших и погибших животных. Анализ данных Экспериментальные данные оценивали с использо ванием t-критерия Стьюдента и программы Origin Professional 8.1.10.86. Статистически значимой счи тали величину P < 0.05 [24]. РЕЗУЛЬТАТЫ Получение клонового варианта вируса осповакцины Перед этапом рекомбинационной интеграции плаз мид в вирусный геном клонировали исходный штамм LIVP ВОВ методом предельного разведения через бляшку из-под агарозного покрытия [19], чтобы из бежать возможной внутриштаммовой гетерогенности вируса при последующем отборе индивидуальных рекомбинантных клонов. Были отобраны пять кло новых вариантов ВОВ, из которых выделяли ДНК и анализировали ее с использованием эндонуклеазы рестрикции HindIII. Для дальнейшей работы выбра ли клоновый вариант 14, не отличающийся по ре стрикционной картине ДНК от исходного штамма LIVP ВОВ. Создание рекомбинантных ВОВ с направленно нарушенными генами вирулентности Для последовательной инактивации были выбраны гены γ-интерферонсвязывающего белка (B8R), ком плементсвязывающего белка (C3L), гемагглютинина (A56R), ингибитора апоптоза (N1L) и тимидинкиназы (J2R) ВОВ (рис. 2А). Использованы плазмиды инте грации pΔB8R, pΔC3L, pΔA56R, pΔN1L и pΔTK, обе спечивающие направленную инактивацию нужных генов. На первом этапе работы монослой клеток CV-1 инфицировали клоновым вариантом 14 ВОВ LIVP и трансфицировали рекомбинантной плазмидой pΔB8R в условиях gpt-селекции рекомбинантов ВОВ. В результате единичного кроссинговера плаз миды интеграции и вирусной ДНК образовался ре комбинантный вирусный геном, содержащий как се лективный ген gpt, так и сегмент вирусного генома с целевой делецией и этот же сегмент без делеции. Такая генетическая конструкция нестабильна, она может существовать лишь под селективным давле нием [15, 16]. После снятия селективного давления по гену gpt и внутримолекулярной рекомбинации по районам R-R’ образовывался рекомбинантный вирус vΔB8R (рис. 1). Клоны данного варианта ви руса выявляли ПЦР-анализом вирусной ДНК (см. «Экспериментальную часть», данные не приведены). Один из отобранных клонов рекомбинантного ВОВ использовали на следующем этапе для удаления гена C3L. В результате получили вариант ВОВ с делеция ми двух генов - B8R и С3L, а затем последовательно трех и четырех генов и с одновременно нарушенными пятью генами вирулентности (vΔB8R/C3L/A56R/ N1L/J2R, рис. 3). Последний вариант рекомбинант ного вируса сокращенно обозначили как 1421ABJCN. Делеции/инсерции в районе каждого гена ВОВ вы являли с использованием ПЦР с соответствующими парами праймеров (см. «Экспериментальную часть»). На рис. 4 представлены результаты ПЦР-анализа ДНК рекомбинантного вируса 1421ABJCN с наруше нием пяти генов вирулентности. ПЦР-фрагменты, со ответствующие полноразмерным копиям генов A56R, В8R, С3L, N1L и J2R, у исходного вируса LIVP имели длину 2366, 1555, 1542, 1784 и 512 п.н. соответственно, а ПЦР-фрагменты, соответствующие делеционным вариантам генов ΔA56R, ΔB8R, ΔC3L, ΔN1L и инсер ционному варианту J2R-MCS вируса 1421ABJCN, со ставляли 1425, 737, 751, 1431 и 617 п.н. соответствен но, что совпадало с расчетными величинами. Эффективность размножения мутантных вариантов ВОВ в культурах клеток млекопитающих При создании современной высокоаттенуированной вакцины важно, чтобы получаемый вариант виру са сохранил репродуктивные свойства на культурах клеток. Поэтому на первом этапе изучения биологи ческих свойств сконструированных рекомбинантных вариантов ВОВ оценили эффективность их реплика ции в культурах клеток CV-1, Vero и 4647. На этих культурах клеток определяли титр вирусов в ди намике развития инфекционного процесса для ВОВ с нарушением как одного гена, так и двух, трех, че тырех и пяти генов вирулентности. Результаты та ких экспериментов на культуре клеток CV-1, приве денные на рис. 5, показали, что кривые размножения рекомбинантных вирусов не различаются статисти чески значимо между собой, а также не отличаются от исходного ВОВ LIVP. Сходные данные зарегистри рованы и при выращивании указанных выше вари антов ВОВ на культурах клеток линий Vero и 4647. Показано, что рекомбинантные варианты ВОВ жизнеспособны и стабильно сохраняют генотип в те чение 10 пассажей на культурах клеток CV-1 и 4647. Нейровирулентность вариантов ВОВ Способность вирусов вызывать гибель при интраце ребральном заражении изучали на новорожденных мышах, за которыми вели наблюдение в течение 8 дней после инфицирования. В группе животных, за раженных ВОВ LIVP в дозе 102 БОЕ/мышь, гибель началась с 4-х суток, а смертность на конец экспе римента составила 90%. В группе мышей, инфициро ванных такой же дозой ВОВ 1421ABJCN, гибель жи вотных за время эксперимента не наблюдали (рис. 6). Кроме того, определяли титр вирусов в мозге ин фицированных сосунков на 3-и сутки после интра церебрального заражения. Выявлено значительное снижение эффективности размножения в мозге мы шей штамма 1421ABJCN (титр вируса ± стандартное отклонение: 2.78 ± 0.66 lg БОЕ/г органа) в сравнении с исходным штаммом ВОВ LIVP (6.12 ± 0.20 lg БОЕ/г органа). Патогенность для кроликов Оценивали воспалительно-некротические прояв ления на эпилированной коже кроликов после вну трикожного введения вирусных препаратов. ВОВ 1421ABJCN вызывал воспалительную реакцию лишь начиная с дозы 105 БОЕ/инъекцию, в то вре мя как родительский ВОВ LIVP - с наименьшей использованной дозы 102 БОЕ/инъекцию (табли ца). Воспалительно-некротические проявления от 1421ABJCN были менее выражены по сравнению с ВОВ LIVP. Полное заживление инфильтратов, вы званных рекомбинантным вариантом 1421ABJCN, наступало на 9-е сутки от момента заражения, а некрозы, вызванные исходным штаммом LIVP, прохо дили лишь к 14-м суткам. Иммуногенная активность штаммов ВОВ Иммуногенность вариантов ВОВ оценивали по уров ню индуцируемых ими вируснейтрализующих анти тел в сыворотках крови мышей, полученных через 28 сут после второй иммунизации. Иммунизацию про водили дозами вирусов 106, 107 или 108 БОЕ/мышь. Как видно из данных, приведенных на рис. 7, реком бинантный штамм 1421ABJCN при подкожной им мунизации животных вызывает наработку вирус нейтрализующих антител, на уровне, сопоставимом с уровнем антител индуцируемых родительским ВОВ LIVP. Это свидетельствует о том, что аттену ированный вариант ВОВ обладает иммуногенной активностью, характерной для исходного штамма ВОВ LIVP. Сыворотки, полученные от мышей кон трольной группы, не обладали детектируемой ВОВ нейтрализующей активностью. Защитные свойства вариантов ВОВ Оценку протективных свойств штаммов ВОВ про водили на мышах, дважды подкожно иммунизи рованных разными дозами вирусов (106, 107 или 108 БОЕ/мышь), которых затем интраназальным путем заражали высокопатогенным для мышей ВЭ в дозе 10 LD50/мышь. Наблюдение за мышами вели в те чение 2 нед., учитывая процент выживших живот ных. Результаты этих экспериментов (рис. 8) пока зали полную защиту животных при иммунизации как штаммом 1421ABJCN, так и ВОВ LIVP при всех использованных дозах вирусов. ОБСУЖДЕНИЕ Род Ortopoxvirus семейства Poxviridae включает та кие патогенные для человека виды, как ВНО, ВОО, ВОК и ВОВ. ВНО вызывает одно из наиболее опас ных инфекционных заболеваний человека, унесшее в свое время миллионы жизней [1]. ВНО в процессе своей эволюции сузил круг чувствительных хозяев до одного вида - человека. Отсутствие другого при родного резервуара (чувствительных животных), а также наличие высокоэффективной противооспен ной вакцины на основе ВОВ позволило успешно реа лизовать международную программу по глобальной ликвидации оспы [1, 2]. Прекращение после 1980 года противооспенной вакцинации привело к постепенной утрате чело веческой популяцией иммунитета к ВНО и другим ортопоксвирусам, патогенным для человека [4]. Это повышает опасность возрождения и более широко го распространения среди людей ортопоксвирусных инфекций, возбудители которых потенциально могут эволюционировать ко все более патогенным и эпиде мически опасным вариантам [3]. Для создания высокоаттенуированного варианта ВОВ, который может быть использован в качестве антиортопоксвирусной вакцины и/или онколити ческого вируса, в нашей работе реализован подход последовательного удаления/инактивации генов различных молекулярных факторов вирулентности. По результатам анализа опубликованных данных в качестве перспективных генов нами выбраны гены ВОВ: B8R, C3L, A56R, N1L и J2R. Ген B8R ВОВ кодирует гликопротеин, секрети руемый из зараженной клетки в виде гомодимера на ранней стадии развития инфекции. Этот белок имеет сходство по аминокислотной последователь ности с внеклеточным доменом клеточного рецептора γ-интерферона (гИФН), связывается и ингибирует активность гИФН у широкого круга млекопитающих [25]. Удаление гена B8R приводило к аттенуации ВОВ по сравнению с вирусом дикого типа на мышиных мо делях [26], вызывая меньшую заболеваемость даже при высоких дозах [27]. Ген C3L кодирует комплементсвязывающий бе лок (КСБ), секретируемый в больших количествах инфицированной клеткой на раннем этапе вирусной инфекции [28] и ингибирующий активность систе мы комплемента через взаимодействие с C3b и C4b [14, 29]. КСБ ингибирует воспалительные реакции [30] и антитело-зависимую нейтрализацию вирионов ВОВ, усиленную комплементом [31]. В опытах на жи вотных мутанты ВОВ, лишенные КСБ, обладали сни женной вирулентностью [14, 31]. Раннепоздний ген A56R кодирует гемагглютинин - поверхностный гликопротеин, обеспечивающий спо собность вируса присоединяться к клетке-хозяину, а также ингибирующий слияние инфицированных клеток и протеолитически активирующий инфекци онность вирионов. Показано, что делеция гена A56R у штамма NYCBH ВОВ вызывает снижение величи ны LD50 приблизительно на 4 порядка при интрацере бральном и интраназальном введении мышам по срав нению с родительским штаммом [32]. Показано также, что нарушение гена гемагглютинина приводит к зна чительной аттенуации ВОВ штамма WR [33]. Ген N1L относится к группе раннепоздних ге нов ВОВ. Он несуществен для размножения вируса in vitro, но важен для проявления вирулентности in vivo. Продукт этого гена представляет собой вну триклеточный гомодимер [34]. Белок N1 относится к семейству Bcl-2-подобных белков [35], ингибирует как апоптоз, так и активацию провоспалительного транскрипционного фактора NF-κB (nuclear factor kappa B) [36]. Ранний ген J2R ВОВ кодирует вирусную тимидин киназу. Показано, что нарушение гена тимидинкина зы ВОВ значительно снижает вирулентность вируса in vivo [37, 38]. Для получения запланированных вариантов ВОВ разработана схема направленной инактивации це левых вирусных генов (рис. 1, 2). Последовательно в состав генома клонового варианта 14 ВОВ LIVP вводили делеции/инсерции целевых генов (рис. 3). Изменения в геноме ВОВ с пятью инактивирован ными генами вирулентности подтверждены ПЦР анализом (рис. 4) и секвенированием. Поскольку задача нашей работы состояла в соз дании высокоаттенуированной вакцины без утра ты функций репликации ВОВ на культурах клеток млекопитающих, проанализировали эффективность размножения полученных вариантов ВОВ на лини ях клеток CV-1, Vero и 4647. Оказалось, что как ВОВ с нарушением выбранных единичных генов, так и ва рианты с одновременной инактивацией нескольких генов вирулентности не уступали исходному ВОВ LIVP в эффективности размножения на изученных культурах клеток (рис. 5). Полученные результа ты позволяют заключить, что удаление/нарушение выбранных генов вирулентности не влияет на про дуктивные свойства созданных вариантов ВОВ на культурах клеток млекопитающих, что важно для наработки вакцины. Считается, что неврологические осложнения при противооспенной вакцинации обусловлены ин фицированием ВОВ мозга человека и развитием вследствие этого энцефалита. Поэтому важнейшая характеристика вакцинного штамма ВОВ - его ней ровирулентность, тестируемая обычно при интраце ребральном заражении новорожденных мышей [39, 40]. Вакцинный штамм ВОВ LIVP, введенный в дозе 102 БОЕ/мышь, приводил за 8 сут наблюдения к ги бели 90% экспериментальных животных, в то вре мя как полученный на его основе штамм 1421ABJCN при той же дозе интрацеребрального заражения ви рулентных свойств не проявил (рис. 6). Оценка нако пления вируса в мозге новорожденных мышей на 3-й день после инфицирования показала, что рекомби нантный ВОВ 1421ABJCN размножается в мозге мышей в 1000 раз менее эффективно по сравнению с родительским штаммом ВОВ LIVP. При внутрикожном заражении кроликов обнару жено также, что ВОВ 1421ABJCN как минимум на 2 порядка менее вирулентен, чем родительский ВОВ LIVP (таблица). Оба изучаемых вируса при подкожной иммуни зации мышей индуцировали сравнимый по уровню синтез специфичных вируснейтрализующих антител (рис. 7) и обеспечивали полную защиту животных от высоковирулентного для мышей ортопоксвируса ВЭ (в дозе 10 LD50/мышь) даже при минимальной ис пользованной иммунизирующей дозе ВОВ 106 БОЕ/ мышь (рис. 8). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Методами генетической инженерии получен эф фективно размножающийся в культурах клеток млекопитающих штамм ВОВ 1421ABJCN с пятью направленно-инактивированными генами виру лентности. Реактогенность и нейровирулентность у рекомбинантного ВОВ 1421ABJCN значительно снижены по сравнению с родительским штаммом ВОВ LIVP, используемым в России для вакцина ции людей. При этом ВОВ 1421ABJCN сохранил иммуногенные и протективные свойства исходного штамма LIVP. Такой вирус может составить основу живой аттенуированной противоортопоксвирусной вакцины нового поколения, а также служить векто ром для создания безопасных живых рекомбинант ных поливалентных вакцин и/или онколитических вирусов.

Об авторах

С. Н. Якубицкий

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: snshchel@rambler.ru
Россия

И. В. Колосова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: snshchel@rambler.ru
Россия

Р. A. Максютов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: snshchel@rambler.ru
Россия

С. Н. Щелкунов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»; Институт цитологии и генетики СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: snshchel@rambler.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы