Профилирование рибосом Mycoplasma gallisepticum

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Проведение системных исследований с использова нием «омиксных технологий» все чаще выявляет не ожиданные явления и новые регулируемые события, которые просто невозможно определить, используя одну омиксную технологию или традиционные ме тоды анализа. Вместе с тем, совместный анализ дан ных, полученных при количественных определениях содержания РНК или белков и пептидов, неизбежно генерирует значительное количество артефактов вследствие погрешностей каждого из используемых технологических приемов. Это требует тщательно го перекрестного анализа, а также дополнительного подтверждения получаемых данных с использовани ем альтернативных или ортогональных технологиче ских приемов. Поэтому простейшие микроорганизмы неслучайно служат объектами для отработки общей методологии анализа совместного поведения макро молекул в живых системах и их взаимного влияния друг на друга. Европейское молекулярно-биологическое сообще ство сформулировало проект, посвященный изуче нию возбудителя респираторных заболеваний чело века, представителя класса Mollicutes - Mycoplasma pneumoniae [1, 2]. Затем наша группа выбрала дру гого представителя этого класса - M. gallisepticum - для проведения аналогичных работ. Вскоре после этого американские исследователи смогли по строить компьютерную модель метаболизма и адап тивных реакций у наименьшей самореплицирую щейся бактерии - M. genitalium [3]. Несмотря на эти успехи, неизученными остаются большое количество вопросов, которые требуют привлечения дополни тельных методов, необходимых для измерения дина мических процессов при реализации минимального набора генетической информации, закодированной в геноме микоплазм. Молликуты, к которым относится M. gallisepticum, характеризуются существенной редукцией ге нома. Средний размер генома микоплазм составляет 0.8-1 млн п.н. (1 млн у M. gallisepticum) [4]. В связи с редукцией генома у микоплазм утрачены извест ные системы регуляции экспрессии генов [5]. Как показано нами ранее, M. gallisepticum отве чают на стрессовые воздействия на уровне транс крипции [6]. В то же время эти изменения в целом слабо отражаются на уровне трансляции [6]. У этого явления могут быть две причины: скорость трансля ции у M. gallisepticum слишком мала для того, чтобы изменения на уровне белка стали видимыми за вре мя эксперимента (30 мин); мРНК селективно связы вается с рибосомами во время стрессового ответа. Механизм селективного связывания мРНК с рибосо мами может быть реализован через взаимодействие с антисмысловыми РНК, блокирующими сайт связы вания рибосомы [7]. Кроме того, даже в пределах одной клетки рибосомы могут отличаться друг от друга как по нуклеотидной последовательности рРНК [8], так и своему белковому составу. Например, рибосо мы Escherichia coli, не имеющие в своем составе бел ка S1, транслируют преимущественно безлидерные транскрипты [9]. С рибосомами могут быть ассоции рованы регуляторные белки, модулирующие процесс трансляции отдельных транскриптов [10]. В комплек се с рибосомой могут находиться «неканонические» белки, основная функция которых не имеет ничего общего с процессом трансляции. Например, глико генсинтаза Saсcharomyces cerevisiae может влиять на трансляцию ряда РНК [11]. Развитие высокопроизводительных техноло гий привело к накоплению большого объема дан ных, характеризующих процессы транскрипции и трансляции в масштабе целой клетки. Согласно классическим представлениям, уровень бел ка в целом определяется уровнем соответству ющей мРНК, однако, в ряде случаев это не так. Высокопроизводительные технологии значитель но увеличили количество случаев, когда уровень белка не коррелирует с уровнем мРНК. Такие дан ные получены для различных бактерий, включая E. coli [12], Desulfovibrio vulgaris [13] и Lactococcus lactis [14]. Коэффициент корреляции Пирсона меж ду уровнем мРНК и уровнем белка, согласно опу бликованным данным, может варьировать от 0.53 до 0.19 в зависимости от вида и состояния бакте рии. Значительный прогресс в изучении регуляции экспрессии генов на уровне трансляции достигнут при использовании технологии профилирования ри босом [15], позволяющей наблюдать процесс транс ляции почти в реальном времени. Таким образом, этап связывания мРНК с рибосомой и ее трансляции является чрезвычайно важным звеном регуляции экспрессии генов у бактерий. Поскольку для мол ликут в целом и M. gallisepticum в частности харак терна сильная редукция регуляторных механизмов, работающих на уровне транскрипции, регуляция экспрессии генов на уровне трансляции может быть едва ли не самым важным звеном, определяющим представленность белков в клетке. В настоящей работе проведены высокопроизво дительное протеомное профилирование рибосом M. gallisepticum для определения их состава и транс крипционное профилирование мРНК, связанной с рибосомами, методом ПЦР в реальном времени. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Культивирование клеток M. gallisepticum S6 Культуру клеток M. gallisepticum S6 культивирова ли в жидкой среде (Триптоза 20 г/л, NaCl 5 г/л, KCl 1.3 г/л, Tрис 3 г/л, дрожжевой диализат 5%, сыворот ка крови лошади 10% («Биолот»), глюкоза 1%, pH 7.4) до середины логарифмической фазы как описано в [16]. Выделение рибосом К 12 мл культуры клеток M. gallisepticum добав ляли хлорамфеникол до конечной концентрации 100 мкг/мл, тщательно перемешивали и инку бировали в течение 5 мин на льду. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4500 g (20 мин при 4°C). Супернатант отбирали и суммарный оса док клеток, полученный с 50 мл культуры, ресу спендировали в 500 мкл буфера для лизиса (20 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 6 мМ MgCl2, 2 мМ спермиди на, 100 мкг/мл хлорамфеникола, 5 мкл ингибитора протеаз (GE Healthcare), 200 ед. ингибитора РНКаз (Thermo Scientific), pH 7.5). После ресуспендирова ния к буферу добавляли 15 мкл NP-40 и тщатель но перемешивали. Клеточный лизат замораживали при -75°C не менее 1 ч. Затем клеточный лизат ос ветляли центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин при 4°C. Супернатант отбирали и фракциони ровали с помощью центрифугирования в ступенча том градиенте сахарозы. Ступенчатый градиент сахарозы создавали в 5-мл поликарбонатной пробирке путем послойно го нанесения раствора сахарозы разной плотности с помощью пипетки. Объем каждого слоя - 750 мкл, шаг ступени - 10%. В настоящей работе использо вали градиент 10-50% сахарозы (всего пять ступе ней). Раствор сахарозы готовили на таком же буфе ре, как для лизиса клеток (без добавления NP-40, хлорамфеникола, ингибиторов протеаз и РНКаз) при 50000 об/мин (среднее ускорение 200620 g) в те чение 1 ч при 4°C, центрифуга Optima (Beckman Coulter), бакет-ротор MLS 50 (Beckman Coulter). Фракции объемом 200 мкл отбирали с помощью пипетки. Выделение РНК из фракций К каждой фракции добавляли 400 мкл реагента Trizol LS (Life Technologies). Смесь тщательно пере мешивали и добавляли 200 мкл хлороформа, еще раз перемешивали и центрифугировали в течение 10 мин при 16000 g и 4°C. Супернатант отбирали, добавляли равный объем изопропанола. Препарат инкубировали при -20°C не менее 1 ч. РНК осаждали центрифугированием при 16000 g (20 мин, 4°C). Осадок промывали 80% (об./об.) этанолом. Препарат РНК растворяли в 10 мкл воды (Panreac). Представленность РНК во фракциях измеряли с по мощью количественной ОТ-ПЦР в реальном време ни. Эксперимент проводили в трех биологических по вторностях. Выделение белка из фракций и трипсинолиз Для осаждения белков фракцию разводили в 10 раз в деионизованной воде и добавляли трихлоруксус ную кислоту (Sigma-Aldrich) до конечной концен трации 10% (об./об.), выдерживали при 4°C в течение ночи с последующим центрифугированием (15 мин при 16000 g). Полученные осадки промывали 2 раза 1 мл холодного ацетона (Pancreac) для удаления остатков трихлоруксусной кислоты. Белковые осадки перерастворяли в 25-35 мкл 50 мМ раствора гидрокарбоната аммо ния (Pancreac), содержащего 0.5% RapiGest SF (Waters) и 1 мкл смеси нуклеаз (GE Healthcare), после чего выдерживали в течение 30 мин при 4°С, инкубировали в течение 5 мин при 100°С и цен трифугировали (10 мин при 16000 g). Супернатант отбирали и определяли концентрацию белка в каждом образце с использованием бицинхони новой кислоты (Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit, Sigma-Aldrich). Для восстановления дисуль фидных мостиков к растворам белков добавляли дитиотреитол (Bio-Rad) до конечной концентра ции 10 мМ, реакцию проводили в течение 30 мин при 60°С на шейкере (600 об/мин). Последующее алкилирование остатков цистеина йодацетамидом (конечная концентрация 30 мМ) (Bio-Rad) прово дили в течение 30 мин при комнатной температу ре в темноте. Затем к образцам белков добавляли трипсин (Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Promega) в соотношении масса трипсина/мас са белка 1 : 50. Трипсинолиз проводили в течение 16 ч при 37°С. Реакцию останавливали добавлени ем 10% трифторуксусной ксилоты (Sigma-Aldrich) до pH 2.0, после чего продукты инкубировали в те чение 45 мин при 37°С и центрифугировали (15 мин при 16000 g) для удаления RapiGest SF. Смеси триптических пептидов дополнительно очищали путем твердофазной экстракции с использованием мини-колонок Discovery DSC-18 (Supelco) согласно рекомендациям производителя. Для дальнейшего масс-спектрометрического анализа элюаты вы сушивали на вакуумном концентраторе CentriVap (Labconco) и растворяли в 10 мкл 3% раствора аце тонитрила, содержащего 0.1% муравьиную кислоту. Выделение РНК из культуры клеток РНК из культуры клеток выделяли согласно [16]. К аликвоте клеточной культуры добавляли трой ной объем реагента Trizol LS (Thermo Scientific). Разделение фаз проводили, добавляя хлороформ из расчета 80 мкл на 100 мкл культуры. Образцы центрифугировали при 16000 g в течение 15 мин при 4°C. Далее РНК переосаждали изопропанолом в объемном соотношении 1 : 1. Синтез кДНК и кПЦР Синтез кДНК и ПЦР в реальном времени проводи ли как описано в [16]. РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Scientific). Затем кДНК синтезировали с по мощью обратной транскриптазы H-minus Reverse Transcriptase (Thermo Scientific) и случайных гекса меров. Для увеличения стабильности РНК использо вали ингибитор РНКаз RiboLock (Thermo Scientific). Количественную ПЦР в реальном времени (кПЦР) проводили на амплификаторе C1000 Touch (Bio-Rad) с оптическим модулем CFX96 (Bio-Rad). Для прове дения ПЦР использовали ×10 ПЦР-буфер («Литех») (конечное разведение ×1.5) и ×10 раствор dNTP («Литех»), Taq-полимеразу («Литех»), краситель SYBR Green I (Life Technologies), по 5 пмоль прай меров, 2% формамида. Данные нормировали по сред ней представленности мРНК 21 гена домашнего хо зяйства (eno, gaphd, tpiA, tuf, tsf, acoA, acoB, aceF, ldh, ackA, pgk, fba, pgi, pfkA, gpmI, pykF, tktA1, rpiB, eutD, prsA, lpd). Использовали те же праймеры для кПЦР, что и ранее [6]. Идентификация белков Хроматомасс-спектрометрический анализ пеп тидных экстрактов проводили с помощью масс спектрометра Q-Exactive HF (Thermo Fisher Scientific), сопряженного с хроматографической системой Ultimate 3000 RSLCnano (Dionex) че рез источник ионов Nanospray Flex (Thermo Fisher Scientific). Пептиды разделяли с помощью обращенно-фазо вой хроматографии с использованием предколонки Acclaim PepMap (сорбент - C18, длина - 2 см, вну тренний диаметр - 75 мкм, размер частиц - 3 мкм, диаметр пор - 100 А, Dionex) и колонки Zorbax (сор бент - Zorbax 300SB-C18, длина - 15 см, внутренний диаметр - 75 мкм, размер частиц - 3.5 мкм, диаметр пор - 100 А, Agilent Technologies). Каждую пробу наносили на предколонку в воде для ВЭЖХ с 0.1% муравьиной кислоты (об./об.) со скоростью потока 2 мкл/мин в течение 5 мин, после чего предколонку включали в линию перед колонкой. Пептиды элю ировали смесью растворителей А (вода для ВЭЖХ с 0.1% муравьиной кислоты (об./об.)) и Б (79.9% аце тонитрила для ВЭЖХ (об./об.), 20% воды для ВЭЖХ и 0.1% муравьиной кислоты (об./об.)), линейно повы шая содержание растворителя Б от 5 до 40% (об./об.) в течение 120 мин при скорости потока 300 нл/мин, после чего систему промывали в течение 10 мин сме сью с 99% (об./об.) растворителя Б, а затем в течение 10 мин смесью с 5% растворителя Б. Напряжение источника 2000 В, а температура ка пилляра 200°C. Масс-спектрометр работал в режиме данные-зависимого анализа: в каждом цикле снимали обзорный масс-спектр, 20 наиболее интенсивных в обзорном масс-спектре ионов поочередно отбира ли для фрагментации и записи масс-спектра дочер них ионов, после чего исключали из рассмотрения на 10 с. Обзорный масс-спектр снимали при разре шении 70000 в диапазоне отношений массы к заря ду от 400 до 1200 m/z c параметром автоматической регулировки усиления (AGC) 106 и ограничением по времени заполнения в 50 мс. Спектры дочер них ионов снимали при разрешении 17500 и AGC - 105 c ограничением по времени заполнения в 100 мс. Параметр энергии столкновений был равен 30, шири на полосы пропускания - 2. На основе полученных масс-хроматограмм (фор мата.raw) с помощью утилиты MSConvert пакета ProteoWizard (версия 3.0.7.414, 64 бита) составля ли список спектров фрагментации в центроидном виде в формате Mascot Generic Format, которые затем интерпретировали с помощью поисковой ма шины Mascot (Matrix Science Inc.). Идентификацию проводили по базе белковых последовательностей M. gallisepticum S6 CP006916.2 с добавленными к ней последовательностями часто встречающих ся белковых контаминантов. Использовали следу ющие параметры идентификации - триптические пептиды с не более чем одним пропущенным сайтом расщепления трипсином, заряд прекурсоров - +2 или +3, допустимая ошибка масс родительских ио нов - 10 ppm, допустимая ошибка масс фрагментов - 0.5 Да, инструмент - ESI-TRAP, постоянные моди фикации - нет, вариабельные модификации - кар бамидометилирование цистеина и окисление мети онина. Список статистически значимых идентификаций определяли как список белков, для которых иденти фицировано два или более пептида со значимостью выше 0.05 согласно рангу. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Распределение РНК в выделенных фракциях После фракционирования цитоплазмы M. gallisepticum распределение РНК во фракциях измеря ли с помощью ОТ-кПЦР (см. «Экспериментальную часть»). Результаты представлены на рис. 1, на кото ром видно, что малые субъединицы и полноразмер ные рибосомы образуют пики в соответствующих фракциях (7 и 11). Для M. gallisepticum характе рен примерно четырехкратный избыток 16S рРНК по сравнению с 23S рРНК [16], что согласуется с на блюдаемой картиной. Во фракциях после 12-22 на блюдается эквимолярное соотношение 16S и 23S рРНК. Относительно высокое содержание мРНК вы явлено только в полисомах (фракции 15 и больше). Наибольшим было количество мРНК во фракциях 17 и 18, где оно составляло примерно 1 мкг. Это де лает соответствующие фракции наиболее удобными для последующего анализа, особенно методами высо копроизводительного секвенирования. Пригодность методики для количественного ана лиза представленности транскриптов, связанных с рибосомами, проверяли на фракции номер 18. Было проведено транскрипционное профилирование ме тодом кПЦР 67 генов в трех биологических повторах. Воспроизводимость полученных данных оценили методом корреляции по Спирману (таблица). Во всех парах образцов корреляция составила 0.87-0.92, что говорит о хорошей воспроизводимости методи ки. Корреляция между представленностью транс криптов во фракции, связанной с рибосомами мРНК, и в суммарной цитоплазматической фракции мРНК составила 0.78. Протеомное профилирование рибосом M. gallisepticum С целью валидации методики выделения рибосом из клеток M. gallisepticum проведено протеомное профилирование фракций 7 (30S субъединицы), 17 и 18 (70S рибосомы, связанные с мРНК), и получена полуколичественная оценка представленности бел ков с помощью индекса emPAI. Во фракции 7 обнаружено 18 из 20 белков ма лой субъединицы рибосомы и только 8 из 33 белков большой субъединицы, что согласуется с данными о распределении рРНК во фракциях. Таким обра зом, во фракции 7 преимущественно содержатся ма лые субъединицы рибосомы. Необходимо отметить, что фракция 7 содержит значительное количество примеси других клеточных белков. Во фракциях 17 и 18, как и ожидалось, наибо лее представлены рибосомные белки. Всего обна ружено 47 рибосомных белков из 53 (19 из 20 бел ков 30S субъединицы и 28 из 33 50S субъединицы). Все не найденные белки имеют небольшой размер (менее 100 аминокислотных остатков), что, вероят но, и стало причиной отсутствия их идентифика ции. Представленность рибосомных белков в данной фракции можно оценить как эквимолярную. Белки малой и большой субъединиц набирают одинаковые индексы emPAI. Кроме того, во фракции 18 обнару жено высокое содержание белков, ассоциированных с рибосомами (факторы трансляции EF-Tu и EF-Ts, шапероны Tig и DnaK), а также белка HU. Известно, что этот белок, бактериальный аналог гистонов, способен связывать как ДНК, так и РНК [17]. Не ис ключено, что он также способен связывать мРНК или рРНК в составе рибосом. Во фракции 18 нами выявлен белок GCW_03230 с высоким индексом emPAI. Это консервативный бе лок с неизвестной функцией, встречающийся у мно гих микоплазм. Его особенностью является экстре мальное значение pI 11.0 при небольшой длине (74 аминокислотных остатка), что делает его похожим на рибосомные белки. Возможно, GCW_03230 - но вый рибосомный белок. Во фракции 18 также обна ружено некоторое количество белков с достаточно высоким индексом представленности emPAI, не име ющих прямого отношения к процессу трансляции. Например, это триозофосфатизомераза, тиоредок син, ряд белков с неизвестной функцией. Их присут ствие, с одной стороны, можно объяснить неспецифи ческим взаимодействием с рибосомами после лизиса клетки. С другой стороны, за последнее время по казано, что такие белки могут модулировать актив ность рибосомы in vivo [11]. Влияние вторичных структур и сайта связывания рибосомы на представленность мРНК в пуле, связанном с рибосомами Наши результаты показывают, что представленность мРНК во фракции, связанной с рибосомами, в целом, соответствует представленности мРНК во фрак ции суммарной РНК. Однако ряд мРНК содержится в этой фракции в значимо большем или меньшем ко личестве. Эффективность связывания мРНК с рибо сомой определяется в том числе комплементарными взаимодействиями между 3’-концом 16S рРНК и сай том связывания рибосомы в 5’-нетранслируемой об ласти мРНК, а также наличием вторичных структур в этой области, способствующих или препятствую щих связыванию рибосомы. С помощью программы RNAduplex мы прове ли in silico моделирование взаимодействия меж ду 3’-концевой последовательностью 16S рРНК (UUACCUCCUUUCU, подчеркнут канонический сайт связывания рибосомы в E. coli) и 25-нуклеотид ной последовательностью перед старт-кодоном каж дого гена. В результате получены оценки силы свя зывания 16S рРНК с 5’-нетранслируемой областью соответствующих мРНК. Корреляция (по Спирману) между нашей оценкой силы сайта связывания рибо сомы и представленностью соответствующей мРНК во фракции РНК, связанной с рибосомами, составила 0.39 (p < 0.01). Мы выбрали мРНК более чем в 2 раза перепредставленные (19) и недопредставленные (25) во фракции, связанной с рибосомами, по сравнению с суммарной мРНК. Энергия образования дуплек са с 3’-концевой областью 16S рРНК у 5’-нетранслируемой области перепредставленных мРНК была в среднем в 2 раза меньше, чем у недопредставлен ных (dG = -4.96 и -2.52 ккал/моль соответственно). Некоторые мРНК, такие, как GCW_02495 и putA, несмотря на низкую расчетную эффективность связывания с рибосомой (dG > 0), лучше представ лены во фракции, связанной с рибосомами, чем в суммарной РНК. В случае GCW_02495 этот па радокс можно объяснить тем, что ген GCW_02495 экспрессируется в составе полицистронной мРНК вместе с соседним геном GCW_02490, который име ет очень эффективный сайт связывания рибосомы (dG = -11.8 ккал/моль). Таким образом, соответству ющая мРНК, в целом, хорошо связывается с рибосо мой. Ряд мРНК менее представлен в связанной с рибо сомами фракции, чем в суммарной РНК, несмотря на предсказанную эффективность связывания с ри босомой. К таким мРНК относятся GCW_00085, glpF, gyrA, gyrB, ruvA, potD и hrcA. Подобное поведение можно объяснить присутствием неких вторичных структур в 5’-нетранслируемой области мРНК, пре пятствующих связыванию рибосомы. С помощью программы quickfold мы рассчитали величины dG образования шпилечных структур в районе сай та связывания рибосом и старт-кодона с помощью скользящего окна длиной 30 нуклеотидов. В резуль тате обнаружили, что величина dG структуры в рай оне старт-кодона коррелирует с представленностью мРНК в связанной с рибосомами фракции (рис. 2). Наилучшая корреляция наблюдается в диапазоне -21…+9 нуклеотидов от старт-кодона как для пред ставленности мРНК в связанной с рибосомами фрак ции, так и для относительного обогащения связанной с рибосомами мРНК относительно суммарной РНК. Таким образом, представленность мРНК в связанной с рибосомами фракции M. gallisepticum может моду лироваться с помощью вторичных структур в районе старт-кодона. ВЫВОДЫ Результаты нашей работы позволяют заключить, что количество мРНК, связанной с рибосомами, у M. gallisepticum в основном определяется двумя параметрами: уровнем транскрипции соответствую щего гена и эффективностью комплементарных вза имодействий между 3’-концом 16S рРНК и сайтом связывания рибосомы в 5’-нетранслируемой области мРНК. Нами разработана количественная и воспро изводимая методика получения фракции связанной с рибосомами мРНК M. gallisepticum, которая может использоваться для изучения процесса трансляции у этой бактерии.

Об авторах

Г. Ю. Фисунов

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России

Автор, ответственный за переписку.
Email: herr.romanoff@gmail.com
Россия

Д. В. Евсютина

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России

Email: herr.romanoff@gmail.com
Россия

A. A. Арзамасов

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России

Email: herr.romanoff@gmail.com
Россия

И. O. Бутенко

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России

Email: herr.romanoff@gmail.com
Россия

В. M. Говорун

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России

Email: herr.romanoff@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы