Модельная система в клетках S2 для тестирования функциональной активности инсуляторов дрозофилы

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В клетках высших эукариот энхансер может ак тивировать промотор на расстоянии, достигаю щем нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов [1-3]. Изучение инсуляторов может внести значи тельный вклад в понимание механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элемента ми. Инсуляторами названы регуляторные элемен ты, способные блокировать взаимодействия между энхансером и промотором, если находятся между ними [4-7]. При этом инсуляторы не влияют непо средственно на активность энхансера и промотора, т.е. промотор может быть активирован любым другим энхансером, а энхансер способен активировать любой другой промотор. В последнее время стало очевид ным, что многие инсуляторные белки обеспечивают специфичные взаимодействия между удаленными регуляторными элементами и структурными доме нами хромосом [1]. В изучении транскрипционных факторов, функ ционирующих в составе инсуляторов, важную роль играют модельные системы, созданные на основе клеточных линий млекопитающих [8] и дрозофилы [9-11]. Одной из проблем при создании удобной мо дельной системы для изучения инсуляторов явля ется сравнительно небольшое число описанных эн хансеров, способных эффективно функционировать в культурах клеток дрозофилы. Ранее было показано, что энхансер из ретро транспозона copia активирует промотор гена белка теплового шока 70 в клетках S2 Drosophila melanogaster, имеющих эмбриональное происхождение [10]. Энхансер, размером 150 п.н., находится непо средственно после 5’-длинного концевого повто ра ретротранспозона copia ( рис. 1А) и содержит на 3’-конце дупликацию из 28 п.н. [12, 13]. В состав дуплицированной последовательности входят две копии октануклеотида TTGTGAAA, расположенные в инвертированной ориентации. Три аналогичных октануклеотида находятся в 5’-области энхансера. Известны copia-элементы, содержащие энхансер только с одной последовательностью 28 п.н., которые обладают значительно сниженной транскрипционной активностью. Предполагается, что с последователь ностью TTGTGAAA связывается фактор транскрип ции, который и определяет активность энхансе ра. Выделено также несколько транскрипционных факторов, которые преимущественно связываются с 5’-областью энхансера и могут как активировать, так и ингибировать транскрипцию [13-15]. В нашей работе проведено детальное исследо вание энхансера copia в модельной системе, ко торая используется для тестирования инсулято ров в культуре клеток дрозофилы. Адекватность модельной системы, основанной на транзиентной экспрессии кольцевой плазмиды в культурах кле ток дрозофилы, изучали с использованием инсу лятора, локализованного в регуляторной области ретротранспозона МДГ4 дрозофилы [4-7]. Ранее с помощью модельных систем, созданных на основе стабильных трансгенных линий дрозофилы, на при мере этого инсулятора были описаны основные свойства регуляторных элементов данного класса. В представленной работе показано, что все основ ные свойства инсулятора MДГ4 воспроизводятся при транзиентной экспрессии кольцевой плазмиды в культуре клеток дрозофилы. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Создание конструкций В качестве исходных векторов использовали плазми ды pGL3basic и pGL3enhancer (Promega). Промотор (-203…+253 п.н. относительно старта транскрип ции) гена hsp70 амплифицировали с геномной ДНК D. melanogaster и встраивали по сайтам рестрикции HindIII, EcoRI в векторы pGL3basic и pGL3enhancer. Энхансер copia размером 168 п.н. амплифицировали с геномной ДНК D. melanogaster и встраивали ниже сигнала полиаденилирования, в вектор pGL3basic и pGL3enhancer (конструкции he) по сайту ре стрикции BamHI. Конструкции ed, er получены пу тем встраивания амплифицированного энхансера copia выше кодирующей части гена люциферазы. В конструкциях edh и erh энхансер copia клонирова ли в вектор h выше промотора по сайту рестрикции SmaI. В случае конструкций gdedh, gredh, gderh, grerh, edgdh, edgdh, gdedgdh, gredgdh, edsdh, edsdgdh, edsdgrh, edsdgrh, edgdsdh сначала отдельно собирали последователь ность из регуляторных элементов на основе вектора pBluescript, а затем переносили ее в вектор h по сай ту рестрикции SmaI выше промотора. Инсулятор gypsy (из ретротранспозона МДГ4) - ранее ампли фицированный в лаборатории фрагмент из 450 п.н. Сигнал полиаденилирования вируса SV40 был вы резан из вектора pAc5.1hisB (Invitrogen) по сайтам рестрикции BamHI, SalI. В случае конструкций hedgd, hedgr, hgded, hgdedgd, hgdedgr так же собирали совокуп ность регуляторных элементов в векторе pBluescript и переносили в вектор h по сайту рестрикции BamHI после сигнала полиаденилирования. В конструкции gdhgded регуляторные элементы встраивали по сай там рестрикции SmaI и BamHI - выше и ниже транс крипционной единицы соответственно. Культивирование клеток, трансфекция Культуру клеток S2 Drosophila выращивали в среде SFX (HyClone) при 25°C. Клетки трансфицировали с помощью реагента Cellfectin II (Invitrogen) согласно рекомендациям производителя (около 8 × 105 клеток на трансфекцию). За 2 ч до трансфекции клетки раз носили по лункам 12-луночного планшета. На одну трансфекцию брали 0.5 мкг ДНК. Во всех случаях проводили котрансфекцию опытных конструкций, в которых в качестве репортерного гена использова ли ген люциферазы светлячка, и контрольной кон струкции, в которой под контролем промотора гена актина размещали ген люциферазы медузы (в со отношении 19 : 1). Клетки собирали через 48 ч после трансфекции. Выделение РНК, обратная транскрипция РНК выделяли из клеток S2 при помощи TRI реагента (Ambion) согласно рекомендациям произ водителя. Выделенную суммарную РНК очищали от примеси геномной ДНК с помощью набора ре активов Turbo DNA-free (Ambion). К 1-5 мкг пре парата РНК добавляли рассеянную затравку до концентрации 1-5 мкМ, нагревали до 70°C, ин кубировали в течение 5 мин и быстро охлаждали во льду. Добавляли dNTP до концентрации 0.5 мМ, буфер для обратной транскриптазы, 5 ед. ингиби тора РНКаз SUPERase-In (Ambion), 60 ед. обратной транскриптазы ArrayScript Reverse Transcriptase (Ambion). Реакционную смесь инкубировали в тече ние 2 ч при 42°C, затем ферменты инактивировали, нагревая до 95°C в течение 5 мин. Количественная ПЦР с получением результатов в режиме реального времени Количественную ПЦР с получением результатов в режиме реального времени проводили на образ цах кДНК. Одновременно проводили как минимум три независимых реакции с каждой парой прайме ров для каждого из трех независимо собранных об разцов. Относительные количества ДНК определяли методом ΔΔCt. В качестве эндогенного контроля ис пользовали участки генов γTub37C и rpl32. В работе использовали следующие пары праймеров: tub (gctttcccaagaagctcataca и ggttcagtgcggtattatccag), rpl32 (gttcgatccgtaaccgatgt и ccagtcggatcgatatgctaa), Fluc (ttgctccaacaccccaacat и ttccgtgctccaaaacaaca), Rluc (cagtggtgggccagatgtaaacaa и taatacaccgcgctactggctcaa). Двойной люциферазный анализ Двойной люциферазный анализ проводили, исполь зуя фирменный набор реактивов Firefly & Renilla Luciferase Assay Kit (Biotium), согласно протоколу производителя. Измерение проводили на планшет ном анализаторе с чувствительностью 100 и време нем экспозиции 1 с. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Активность энхансера мобильного элемента copia зависит от клеточной линии дрозофилы Ранее было показано [10], что энхансер copia (рис. 1А) может более чем в 100 раз усиливать транскрипцию с промотора гена белка теплового шока 70 (hsp70) в составе плазмиды, трансфицированной в клетки S2. Однако согласно [16], энхансер copia не стимулирует транскрипцию в клетках S2, и его активность выяв лена только в клеточной линии DH-33, полученной из Drosophila hydei. Первым вероятным объяснением таких противо речивых результатов было предположение о том, что конструкция, используемая в работе [10], со держала дополнительные регуляторные элементы, которые могли усиливать работу энхансера copia в клетках S2. Действительно, экспрессионный вектор содержал три копии энхансера copia с 3’-стороны ре портерного гена люциферазы светлячка, контроли руемого минимальным hsp70-промотором (рис. 1Б). Рядом с копиями энхансера copia (e3) находился эн хансер SV40 (s), который также мог принимать уча стие в стимуляции транскрипции [10]. С целью изучения роли сложной организации об ласти энхансеров в стимуляции транскрипции срав нили активность этой конструкции (he3s) и конструк ции, содержащей только промотор (h), в S2-клетках, полученных из двух разных источников (рис. 1Б). Одна линия клеток велась в нашей лаборатории (S2_G), вторая получена непосредственно из фирмы Invitrogen (S2_I). Неожиданно оказалось, что слож ный элемент, состоящий из трех энхансеров copia и энхансера SV40, не стимулирует hsp70-промотор ни в одной из тестируемых линий клеток (рис. 1Б). Таким образом, сложный энхансер не стимулирует транскрипцию в клетках S2. Полученные результаты можно объяснить разли чиями в наборе транскрипционных факторов, кото рые экспрессируются в клеточных линиях S2, куль тивируемых независимо на протяжении длительного времени. С целью проверки данного предположения создан новый вектор, в котором за репортерным геном была встроена только одна копия энхансера copia (рис. 1В). Мы использовали две дополнитель ные линии клеток: S2_Р (линия, использованная в проекте MODEncode) и Sg4 (получена из лабора тории В. Пирротты, Университет Ратгерса, США). Линия Sg4 - производная линии S2, отличается от S2 профилем экспрессии части генов. В результате трансфекции контрольной и опыт ной плазмид в четыре клеточные линии установи ли, что энхансер copia способен примерно в 80-100 раз стимулировать транскрипцию hsp70-промотора в линиях S2_P и Sg4, но не обладает стимулирующим потенциалом в двух ранее используемых линиях S2. Таким образом, одна копия энхансера copia способна эффективно стимулировать транскрипцию только в определенных вариантах клеток S2. Энхансер copia индуцирует транскрипцию в двух направлениях с эффективностью, сравнимой с базовой активностью промотора hsp70 В работе [10] показано, что сложный регуляторный элемент, состоящий из энхансеров SV40 и copia, ин дуцирует двустороннюю транскрипцию. В настоящее время существует достаточно много данных о том, что инициация транскрипции происходит на большой части энхансеров [2, 3]. Наиболее часто с энхансеров транскрибируются короткие нестабильные непо лиаденилированные транскрипты, которые обычно не транспортируются в цитоплазму и не транслиру ются. Поэтому решили проверить способность энхан сера copia индуцировать транскрипцию. Ранее было показано, что некоторые энхансеры могут продуци ровать полноценные мРНК [2, 3], поэтому была из учена способность энхансера copia продуцировать полиаденилированную РНК, способную транслиро ваться. С этой целью получили конструкции, в кото рых энхансер copia был встроен в прямой либо об ратной ориентации вместо hsp70-промотора выше репортерного гена люциферазы светлячка (рис. 2). В качестве контроля использовали плазмиды с/без hsp70-промотора выше репортерного гена. Этими плазмидами трансфицировали клетки Sg4. В резуль тате показали, что с энхансера copia в обеих ориен тациях запускается транскрипция и экспрессирует ся люцифераза, но в 5-20 раз слабее, чем в случае конструкции с hsp70-промотором. При этом в прямой ориентации энхансер copia функционирует в каче стве промотора, приблизительно в 3 раза более силь ного, чем в обратной ориентации. Таким образом, энхансер copia может функционировать как слабый двунаправленный промотор, индуцирующий форми рование функциональной мРНК, на матрице которой синтезируется люцифераза. Уровень транскриптов, синтезируемых с энхансера copia и hsp70-промотора, сравнили с помощью обратной транскрипции РНК с последующей количественной ПЦР. Оказалось, что транскрипция с промотора всего лишь в 2-3 раза эффективней транскрипции с энхансера. Таким об разом, одна копия энхансера copia может запускать двунаправленный синтез молекул РНК, пригодных для прохождения этапов трансляции, и на уровне, со поставимом с базовой активностью hsp70-промотора. Инсулятор из ретротранспозона МДГ4 незначительно влияет на активность энхансера copia в положении перед промотором Наиболее сильный инсулятор дрозофилы, состоящий из 12 сайтов связывания белка Su(Hw), локализован в регуляторной области ретротранспозона МДГ4 [17-19]. В трансгенных линиях дрозофилы актив ность этого инсулятора зависит от взятых в иссле дование энхансеров и промоторов. Так, одна копия такого инсулятора полностью блокирует активность энхансеров гена yellow, но почти не влияет на актив ность энхансера гена white [20, 21]. С помощью транс фекции кольцевой плазмиды в клетки S2 дрозофилы показано [9], что одна копия инсулятора из МДГ4, размещенная перед промотором репортерного гена, снижает в 2 раза активность энхансера copia, встро енного с 3’-стороны гена. Двукратное снижение транскрипции можно объяснить влиянием инсуля тора как на активность энхансера, так и на промотор, расположенный рядом. Так, белок Su(Hw) детекти руется не только на инсуляторе, но также на после довательностях энхансера copia и промотора hsp70 в составе трансфицированных конструкций [22]. Определить, на активность какого элемента вли яет инсулятор, мы попытались с помощью серии конструкций, в которых энхансер находился в по ложении -233 п.н. относительно старта транскрип ции с hsp70-промотора (рис. 3). Энхансер был раз мещен в двух ориентациях - прямой (ed) и обратной (er). В трансфицированных клетках Sg4 уровень экс прессии репортерного гена не зависел от ориентации энхансера. Инсулятор МДГ4 (g) располагался непо средственно перед энхансером либо в прямой, либо в обратной ориентации. Таким образом, получены четыре конструкции, в которых инсулятор и энхан сер размещались в разных ориентациях друг отно сительно друга и промотора. Всеми конструкциями трансфицировали клетки Sg4 (рис. 3). Определение уровня экспрессии люциферазы показало, что в кон струкциях, в которых энхансер и промотор имели друг относительно друга противоположную ориен тацию, присутствие инсулятора в любой ориентации не влияло или незначительно увеличивало уровень экспрессии репортерного гена. В тех случаях, ког да энхансер был встроен в прямой ориентации, уро вень экспрессии репортерного гена снижался при мерно в 2 раза в присутствии инсулятора в любой ориентации. Таким образом, инсулятор может вли ять на активность расположенного рядом энхансера, находящегося в непосредственной близости от про мотора. В этом случае механизм влияния не связан с блокированием взаимодействия между энхансером и промотором. Наиболее вероятно, что подобное ин гибирование транскрипции, зависящее от ориен тации, связано с прямым взаимодействием белков, связанных с инсулятором и энхансером, что согла суется с данными о распределении инсуляторных белков [10]. Следующей задачей стало изучение влияния ин сулятора на уровень экспрессии репортерного гена в положении между энхансером и промотором. С этой целью получили конструкцию, в которой инсулятор встроен в положение -233 п.н. относительно старта транскрипции hsp70-промотора (рис. 3). Энхансер на ходился непосредственно перед инсулятором в пря мой ориентации, т.е. инсулятор располагался между энхансером и промотором. В этом случае инсулятор снижал активность энхансера примерно в 4 раза. Таким образом, инсулятор, помещенный между эн хансером и промотором, сильнее ингибирует транс крипцию репортерного гена, чем в положении выше энхансера. Этот результат согласуется с основным свойством инсуляторов - способностью блокировать энхансер, которое проявляется, когда инсулятор рас полагается между энхансером и промотором. Две копии инсулятора, окружающие энхансер, полностью инактивируют его активность Полученные результаты показывают, что одна ко пия инсулятора способна только частично блокиро вать активность энхансера в транзиентной модели на основе кольцевых плазмид. Ранее мы показали, что только две копии инсулятора МДГ4, окружаю щие либо энхансер, либо репортерный ген white, спо собны полностью блокировать активность энхансера в трансгенных линиях дрозофилы [21]. Согласно мо дели за счет взаимодействия между инсуляторами формируется хроматиновая петля, которая значи тельно усложняет процесс установления взаимодействий между белковыми комплексами, связанными с энхансерами и промоторами. Чтобы определить, будет ли выполняться это правило функционирова ния инсуляторов в транзиентной модели на основе кольцевой плазмиды, получили две дополнитель ные конструкции, в которых энхансер, локализован ный перед hsp70-промотором, был окружен двумя инсуляторами, расположенными в одном или про тивоположных направлениях (рис. 4А). Оказалось, что в обоих вариантах уровень экспрессии репортер ного гена близок к уровню контрольной плазмиды, которая содержит только hsp70-промотор. Таким образом, два инсулятора, окружающие энхансер, приводят к полной инактивации его активности, что согласуется с результатами, полученными ранее в трансгенных линиях дрозофилы. В описанных выше опытах инсуляторы, окружа ющие энхансер, находились рядом с промотором. Возникает вопрос, сохранится ли эффект полного блокирования энхансера, если энхансер, окружен ный инсуляторами, будет находиться на значитель ном расстоянии от промотора. Для ответа на этот вопрос создали серию конструкций, в которых энхансер copia был встроен в прямой ориентации в положении +2230 п.н. относительно старта транс крипции репортерного гена люциферазы светлячка (рис. 4Б). В этом положении энхансер стимулировал транскрипцию репортерного гена примерно в 2 раза эффективнее, чем в положении перед промотором. В двух плазмидах, в которых инсулятор находился в прямой/обратной ориентации с 3’-стороны от эн хансера, уровень экспрессии репортерного гена ока зался близким к экспрессии плазмиды, содержащей только энхансер. Таким образом, инсулятор, рас положенный за энхансером, не влиял на его актив ность. Однако при размещении инсулятора между репортерным геном и энхансером происходило ше стикратное снижение уровня экспрессии репортер ного гена. Таким образом, даже в рамках кольцевой плазмиды взаимное расположение энхансера и ин сулятора относительно промотора определяет эф фективность ингибирования транскрипции. В сле дующей серии конструкций энхансер был встроен между двумя одно- или разнонаправленными инсу ляторами (рис. 4Б). При транзиентной трансфекции таких плазмид в клетки Sg4 экспрессия репортер ного гена детектировалась на уровне контрольной плазмиды, содержащей только hsp70-промотор. Таким образом, две копии инсулятора, окружаю щие энхансер, полностью блокируют его активность. Следовательно, расстояние между энхансером и промотором не влияет на эффективность блоки рования энхансера, расположенного между парой инсуляторов. В трансгенных линиях дрозофилы две копии инсу лятора, окружающие репортерный ген, слабее бло кировали активность энхансера, чем две копии инсу лятора, окружающие энхансер [21]. Для дальнейшей проверки степени корреляции результатов, получен ных в кольцевых плазмидах и трансгенных линиях дрозофилы, использовали конструкцию, в которой инсуляторы окружали репортерный ген, а энхансер находился сразу за инсулятором с 3’-стороны гена. При трансфекции такой плазмиды в клетки Sg4 вы явлена слабая активность энхансера, что согласует ся с предположением о том, что инсуляторы в такой конфигурации не способны обеспечить полное блоки рование энхансера. Полная инактивация энхансера наблюдалась только в том случае, если два инсулято ра находились непосредственно рядом с энхансером. Таким образом выявлена полная корреляция между результатами, полученными на трансгенных линиях дрозофилы и в транзиентной модели в клетках Sg4. Транскрипция с энхансера регулирует активность инсулятора МДГ4 Ранее предполагалось [10, 23, 24], что транскрипция помогает энхансеру двигаться по хроматину в по исках промотора. Согласно этой модели, инсулятор блокирует продвижение энхансера вместе с РНК полимеразой II в сторону промотора. Транскрипция, которая инициируется на энхансере, также может непосредственно влиять на активность промотора и инсулятора. Для исследования функциональной роли транс крипции, инициируемой на энхансере, создана се рия плазмид, в которых для прерывания транс крипции используется универсальный терминатор вируса SV40 размером 220 п.н. В первой плазмиде терминатор SV40 встроен между энхансером copia, расположенным в прямой ориентации, и hsp70 промотором (рис. 5). При трансфекции этой плазми ды в Sg4-клетки уровень экспрессии репортерного гена снижался в 2 раза по сравнению с плазмидой, содержащей только энхансер. Этот результат ча стично можно объяснить тем, что транскрипция, инициируемая с энхансера, вносит вклад в экспрес сию репортерного гена. Терминатор SV40 прерыва ет эту транскрипцию и тем самым снижает уровень экспрессии репортерного гена. Однако ранее (рис. 2) мы показали, что с энхансера copia нарабатывается приблизительно в 5 раз меньше люциферазы, чем с hsp70-промотора. Поэтому основное возможное объяснение связано с тем, что терминатор SV40 спо собен частично блокировать взаимодействие энхан сера с промотором за счет остановки продвижения РНК-полимеразы II от энхансера в сторону промо тора. Такая интерпретация согласуется с моделью, согласно которой РНК-полимераза II играет опре деленную роль при передаче сигнала от энхансера к промотору [10, 24, 25]. В следующих двух плазмидах энхансер, располо женный в прямой ориентации относительно промо тора, был отделен от промотора терминатором SV40 и инсулятором, встроенным в прямой или обратной ориентации (рис. 5). При трансфекции любой из этих плазмид в клетки Sg4 экспрессия репортерного гена оставалась на том же уровне, как и у плазмиды, со держащей только терминатор SV40. Интересно, что при этом в присутствии комбинации инсулятора и терминатора транскрипция достигала более высо кого уровня по сравнению с плазмидой, содержащей только инсулятор. Таким образом, терминатор SV40 частично супрессирует блокирующую активность инсулятора вместо ожидаемого аддитивного нега тивного эффекта инсулятора и терминатора SV40 на экспрессию репортерного гена. При трансфекции в клетки Sg4 плазмиды, в которой инсулятор и тер минатор поменяли местами, в результате чего инсу лятор оказался между энхансером и терминатором, наблюдалось снижение уровня экспрессии репор терного гена (рис. 5). Полученные данные позволяют предположить, что транскрипция с энхансера уси ливает активность инсулятора, что приводит к более эффективному блокированию энхансера. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные в нашей работе данные предполага ют, что эмбриональные клеточные линии дрозофи лы, имеющие общее происхождение, отличаются по уровню экспрессии в них транскрипционных фак торов, необходимых для функционирования энхансе ра copia. По-видимому, в эмбриональных клеточных линиях может варьировать экспрессия и других ге нов, кодирующих транскрипционные факторы, ко торые не являются необходимыми для поддержания клеточной линии. Таким образом, клеточные линии, даже имеющие общее происхождение, могут зна чительно отличаться по набору транскрипционных факторов и, как следствие, по функциональной ак тивности регуляторных элементов. Нами доработана модельная система, позволяю щая изучать активность инсуляторов в эмбриональ ных клеточных линиях дрозофилы. В транзиентной модели на кольцевых плазмидах наиболее хорошо известный инсулятор МДГ4 сохраняет свои основные свойства, описанные при использовании модельных систем на основе трансгенных линий дрозофилы [25]. Одна копия инсулятора только частично блокиру ет активность энхансера, в то же время две копии, окружающие либо энхансер, либо репортерный ген, приводят к полной инактивации энхансера. Недавно в нашей лаборатории было показано, что транскрипция через энхансер ингибирует его активность [26]. В настоящей работе установлено, что энхансер copia обладает свойствами слабого дву стороннего промотора, и транскрипция с энхансера может усиливать способность инсулятора МДГ4 бло кировать активность энхансера. Действительно, су ществует ряд данных, согласно которым связывание транскриптов с комплексом Su(Hw) может регулировать активность инсулятора [27, 28].

Об авторах

M. В. Тихонов

Email: mog@genebiology.ru
Россия

Н. Б. Гасанов

Email: mog@genebiology.ru
Россия

П. Г. Георгиев

Email: mog@genebiology.ru
Россия

O. Г. Максименко

Автор, ответственный за переписку.
Email: mog@genebiology.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы