Рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFv-PE40 для таргетной терапии HER2-положительных опухолей

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Рекомбинантные иммунотоксины представляются исключительно перспективными соединениями с точки зрения развития таргетного лечения опухолей с определенным молекулярным профилем. В работе исследованы свойства нового рекомбинантного иммунотоксина, специфичного к онкомаркеру HER2, полученного на основе антитела формата scFv и фрагмента РЕ40 псевдомонадного экзотоксина А (4D5scFv-PE40). Показаны высокая аффинность иммунотоксина к онкомаркеру, избирательность токсического действия в отношении HER2-гиперэкспрессирующих клеток и стабильность иммунотоксина при хранении. Значение IC50 иммунотоксина 4D5scFv-PE40 в отношении раковых клеток, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2, на 2.5-3 порядка ниже, чем в отношении клеток СНО, не экспрессирующих этот онкомаркер, и на 2.5-3 порядка ниже, чем значение IC50 свободного PE40 в отношении раковых клеток, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2. Полученные данные позволяют рассчитывать в перспективе на высокие значения терапевтического индекса иммунотоксина 4D5scFv-PE40 при использовании in vivo.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Прогресс в изучении молекулярных основ канцеро генеза позволил выявить тонкие биохимические от личия опухолевых клеток от нормальных и, таким образом, создал предпосылки для развития методов лечения, опирающихся на эти отличия. Концепция таргетной терапии подразумевает создание препара тов, специфически взаимодействующих с молекула ми-мишенями, экспрессирующимися в опухолевых клетках, но не представленными в нормальных тка нях. Этот подход позволяет прицельно элиминиро вать опухолевые клетки с минимальным негативным воздействием на другие ткани и органы. К таргетным препаратам относят, в первую оче редь, моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с поверхностными рецепто рами-онкомаркерами (включая антиангиогенные антитела) [1, 2] и низкомолекулярные ингибиторы ферментов [3]. Для усиления специфического воз действия на опухоль в состав препаратов на основе антител может быть введен дополнительный ток сический компонент [4]. Первым таким бифункци ональным соединением стал препарат Kadcyla® [5], введенный в клиническую практику для лечения метастатического рака молочной железы в конце 2013 года. Этот препарат представляет собой хими ческий конъюгат полноразмерного гуманизирован ного антитела, специфичного к онкомаркеру HER2, и токсического соединения, ингибирующего ассоци ацию тубулиновых субъединиц при сборке микро трубочек. В случае, когда и направляющий, и эф фекторный (токсический) модули представлены белковыми молекулами, принципиально возможным становится объединение их в единую полипептидную цепь методами генной инженерии. Рекомбинантные бифункциональные белки, получившие название иммунотоксинов, представляются исключительно перспективными соединениями с точки зрения дальнейшего развития таргетного лечения опухолей бла годаря строго контролируемому составу, возможно сти биотехнологической наработки в бактериальных продуцентах, возможности оптимизации свойств ме тодами генной инженерии и т.п. [6]. В рамках данной работы исследованы физико химические и функциональные свойства нового HER2-специфичного рекомбинантного иммуноток сина, полученного на основе антитела формата scFv и псевдомонадного экзотоксина А. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Получение и характеристика белков Наработку рекомбинантного иммунотоксина 4D5scFv-PE40 и свободных полипептидов 4D5scFv и PE40 (ETA) осуществляли в культуре Escherichia coli штамма BL21, предварительно трансфор мированной плазмидами pSD-4D5scFv-PE40, pSD-4D5scFv и pSD-PE40, содержащими гены бел ков 4D5scFv-PE40, 4D5scFv и PE40 соответственно, под контролем lac-промотора. Используемые плаз миды были получены на основе векторов pIG6-4D5 и pIG6-4D5MOCB-ETA [7, 8]. Очистку белков осуществляли в две стадии ме тодами Ni2+-хелатной аффинной хроматогра фии с использованием колонки HisTrap FF 1 ml (GE Healthcare, США) и ионообменной хроматогра фии на колонке Q Sepharose FF 1 ml (GE Healthcare, США). Фракции, содержащие целевой белок, анализиро вали с помощью электрофореза в 12% ПААГ в дена турирующих условиях согласно стандартному про токолу [9]. Константу диссоциации комплекса 4D5scFv-PE40 с рецептором HER2 определяли методом по верхностного плазмонного резонанса на оптическом биосенсоре BIAcore 3000 (GE Healthcare, США) с использованием рекомбинантного внеклеточного домена рецептора HER2 p185HER2-ECD (Sino Biological, Inc., Китай). Исследование цитотоксичности В работе использовали клетки аденокарциномы яичника человека линии SKOV-3 (номер по катало гу ATCC - HTB-77), характеризующиеся гиперэк спрессией рецептора HER2, и HER2-отрицательные клетки яичника китайского хомячка CHO (ATCC - CCL-61). Для получения флуоресцентной опухолевой линии SKOV-kat клетки SKOV-3 были трансфицированы геном красного флуоресцент ного белка TurboFP635 с использованием вектора pTurboFP635-C (Evrogen, Россия) [10]. Клетки выращивали в среде RPMI-1640 (HyClone, США) с 10% эмбриональной сывороткой телен ка (HyClone, США) и 2 мМ глутамином («ПанЭко», Россия) при 37оС в атмосфере 5% СО2. Анализ цитотоксичности исследуемых белков проводили с помощью стандартного МТТ-теста [11]. При этом обработку клеток проводили по двум схемам. Для оценки эффекта краткосрочного воз действия клетки инкубировали в присутствии ис следуемых белков в течение 40 мин при 4°С. Затем несвязавшиеся белки отмывали, к клеткам добав ляли ростовую среду и выращивали в течение 48 ч. В случае анализа эффекта длительного воздействия клетки выращивали в присутствии в среде исследу емых белков в течение 72 ч. Расчет среднего значения и 95%-доверительно го интервала для концентрации белка, приводящей к снижению жизнеспособности культуры в 2 раза (IC50), проводили в программе GraphPad Prism 6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследуемый иммунотоксин 4D5scFv-PE40 пред ставляет собой единую полипептидную цепь, объ единяющую направляющий и токсический модули (рис. 1). Рекомбинантный белок 4D5scFv-PE40 содер жит фрагмент PE40 экзотоксина А из Pseudomonas aeruginosa с молекулярной массой 40 кДа без при родного рецепторузнающего домена. Фрагмент PE40 присоединен к С-концу анти-HER2-антитела формата scFv (4D5scFv) через гибкий гидрофиль ный 16-аминокислотный линкер [12]. Благодаря этому линкеру расстояние между соединяемыми им участками белковой молекулы, 4D5scFv и PE40, составляет 2.5-2.7 нм, что позволяет двум доменам белка не испытывать стерических затруднений и со хранять свои функциональные свойства. Антитело 4D5scFv представляет собой рекомбинантный по липептид на основе слитых вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей полноразмерного антитела 4D5, специфичного к онкомаркеру HER2. Антитело 4D5scFv зарекомендовало себя как эффективный на правляющий агент при создании бифункциональных цитотоксических белков [13-18]. На С-конце молекула иммунотоксина содержит олигопептид KDEL - сигнал транслокации в эндо плазматический ретикулум. Олигогистидиновые последовательности включены на оба конца целево го белка для его очистки с помощью металл-хелат ной аффинной хроматографии. Сигнальный пептид ompA обеспечивает секрецию целевого рекомби нантного белка в периплазматическое пространство как для снижения его токсического действия на клет ку, так и для повышения уровня растворимой фрак ции целевого белка при биотехнологической наработ ке в бактериальных продуцентах [19]. Использование для очистки рекомбинантного бел ка последовательно методов металл-хелатной и ио нообменной хроматографии позволило получить иммунотоксин 4D5scFv-PE40 (Mr 71 кДа) с чистотой более 96%, стабильность которого подтверждена при хранении в течение 3 мес. при +4°С, что может рассматриваться как очень хороший показатель для белковых препаратов. В течение этого време ни показано также сохранение гомогенности и вы сокой аффинности иммунотоксина 4D5scFv-PE40 к внеклеточному домену рецептора HER2 (Kd ~7 нМ). Для сравнения, Kd свободного антитела 4D5scFv, определенная тем же методом плазмонного резонан са, составляет 5.2 нМ [20]. Исследование функциональных свойств 4D5scFv-PE40 было проведено на линии клеток SKOV-kat [10], полученной путем трансфекции клеток роди тельской линии SKOV-3 (аденокарцинома яичника человека), характеризующейся гиперэкспрессией онкомаркера HER2, геном красного флуоресцентно го белка TurboFP635. С учетом возможного влияния процедуры трансфекции на клетки особое внимание было уделено сохранению их морфологии и фенотипа. Предварительно методом иммунофлуоресцент ного анализа с использованием HER2-направленных комплексов полупроводниковых квантовых точек [21] было подтверждено сохранение гиперэкспрессии рецептора HER2 на поверхности трансфицирован ных клеток (рис. 2). Анализ цитотоксичности 4D5scFv-PE40 в усло виях короткой (40 мин) инкубации на холоде про демонстрировал высокоизбирательное токсическое действие в отношении клеток SKOV-kat (таблица). Поскольку данные условия препятствуют интерна лизации белков, очевидно, что именно специфиче ское связывание с рецептором HER2 и удержание на мембране оказывают влияние на метаболизм кле ток при их последующем культивировании после удаления иммунотоксина из среды. В условиях организма характерно длительное присутствие лекарственного препарата в крови и особенно в межклеточном матриксе. В опытах in vitro было показано, что селективность цитотокси ческого действия 4D5scFv-PE40 на клетки SKOVkat сохраняется даже при 72-часовом присутствии препарата в ростовой среде. Концентрация 4D5scFv- PE40, приводящая к двукратному снижению жиз неспособности культуры клеток SKOV-kat (IC50), на 3 порядка ниже IC50 4D5scFv-PE40 в отношении клеток CHO, не экспрессирующих рецептор HER2. Необходимо отметить проявление токсическо го действия и самого PE40 в этих условиях, однако IC50 полипептида PE40 в отношении клеток SKOV-3 и SKOV-kat также превышает IC50 иммунотоксина 4D5scFv-PE40 на 2.5-3 порядка. Полученные резуль таты позволяют рассчитывать в перспективе на вы сокие значения терапевтического индекса данного иммунотоксина при использовании in vivo. Хорошо известна устойчивость SKOV-3, исходной линии для получения SKOV-kat, к действию цито токсических агентов [22]. Тем не менее токсичность 4D5scFv-PE40 в отношении SKOV-3 также проявля лась в пикомолярном диапазоне концентраций и не существенно отличалась от таковой для SKOV-kat (таблица). Флуоресцирующие опухолевые клеточные ли нии являются уникальным по своим возможностям инструментом исследований. Благодаря экспрес сии флуоресцентного белка опухолевыми клетками SKOV-kat продолжение исследований созданного иммунотоксина 4D5scFv-PE40 на эксперименталь ных опухолевых моделях на основе этих клеток становится возможным с применением высокоин формативных методов прижизненной оптической визуализации на уровне целого организма. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Успехи первых таргетных противоопухолевых пре паратов принципиально изменили подход к разра ботке новых средств противоопухолевой терапии и привели к изменению стандартов лечения многих видов онкологических заболеваний. Наибольший успех достигнут в онкогематологии и лечении дис семинированных опухолей, однако и в случае лече ния сóлидных опухолей определенного молекуляр ного профиля показано преимущество таргетного подхода. Исследованный в работе иммунотоксин 4D5scFv-PE40 предназначен для таргетной терапии опу холей, экспрессирующих онкомаркер HER2. Специфичность данного иммунотоксина идентична таковой известного противоопухолевого препарата Герцептин®. В то же время наличие токсического модуля в составе 4D5scFv-PE40 многократно увели чивает специфическую токсичность данного белка в отношении HER2-экспрессирующих клеток и по зволяет рассчитывать на его эффективность в ходе последующих исследований терапевтического потен циала в экспериментах in vivo.

×

Об авторах

E. A. Соколова

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: irin-b@mail.ru
Россия

O. A. Стремовский

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: irin-b@mail.ru
Россия

T. A. Здобнова

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Email: irin-b@mail.ru
Россия

И. В. Балалаева

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Email: irin-b@mail.ru
Россия

С. M. Деев

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: irin-b@mail.ru
Россия

Список литературы

  1. Deyev S.M., Lebedenko E.N., Petrovskaya L.E., Dolgikh D.A., Gabibov A.G., Kirpichnikov M.P. // Russ. Chem. Rev. 2015, V.84(1), P.1-26
  2. Hojjat-Farsangi M. // Tumour Biol. 2015, V.36, P.543-556
  3. Roskoski R. Jr. // Pharmacol. Res. 2015, V.100, P.1-23
  4. Weiner G.J. // Nat. Rev. Cancer. 2015, V.15, №6, P.361-370
  5. Lambert J.M., Chari R.V. // J Med Chem. 2014, V.57, P.6949-6964
  6. Alewine C., Hassan R., Pastan I. // Oncologist. 2015, V.20, №2, P.176-185
  7. Deyev S.M., Waibel R., Lebedenko E.N., Schubiger A.P., Plückthun A. // Nat. Biotechnol. 2003, V.21, P.1486-1492
  8. Di Paolo C., Willuda J., Kubetzko S., Lauffer I., Tschudi D., Waibel R., Plückthun A., Stahel R.A., Zangemeister-Wittke U. // Clin. Cancer Res. 2003, V.9, P.2837-2848
  9. Laemmli U.K., Beguin F., Gujer-Kellenberger G. // J. Mol. Biol. 1970, V.47, P.69-85
  10. Zdobnova T., Sokolova E., Stremovskiy O., Karpenko D., Telford W., Turchin I., Balalaeva I., Deyev S. // Oncotarget. 2015, V.6, №31, P.30919-30928
  11. Mosmann T. // J. Immunol. Methods. 1983, V.65, P.55-63
  12. Muller K.M., Arndt K.M., Strittmatter W., Pluckthun A. // FEBS Lett. 1998, V.422, P.259-264
  13. Edelweiss E., Balandin T.G., Ivanova J.L., Lutsenko G.V., Leonova O.G., Popenko V.I., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. // PLOS ONE. 2008, V.3, e2434
  14. Balandin T.G., Edelweiss E., Andronova N.V., Treshalina E.M., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. // Invest. New Drugs. 2011, V.29, №1, P.22-32
  15. Serebrovskaya E.O., Edelweiss E.F., Stremovskiy O.A., Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Deyev S.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, V.106, P.9221-9225
  16. Mironova K.E., Proshkina G.M., Ryabova A.V., Stremovskiy O.A., Lukyanov S.A., Petrov R.V., Deyev S.M. // Theranostics. 2013, V.3, P.831-840
  17. Cao Y., Marks J.W., Liu Z., Cheung L.H., Hittelman W.N., Rosenblum M.G. // Oncogene. 2014, V.33, P.429-439
  18. Zhang M., Qiu Z., Li Y., Yang Y., Zhang Q., Xiang Q., Su Z., Huang Y. // Appl Microbiol Biotechnol. 2013, V.97, P.3913-3923
  19. Pines O., Inouye M. // Mol Biotechnol. 1999, V.12, P.25-34
  20. Sokolova E.A., Zdobnova T.A., Stremovskiy O.A., Balalaeva I.V., Deyev S.M. // Biochemistry (Mosc). 2014, V.79, №12, P.1376-1381
  21. Balalaeva I.V., Zdobnova T.A., Krutova I.V., Brilkina A.A., Lebedenko E.N., Deyev S.M. // J. Biophotonics. 2012. V. 5. № 11-12. 2012, V.5, №11-12, P.860-867
  22. Morimoto H., Safrit J.T., Bonavida B. // J. Immunol. 1991, V.147, P.2609-2616

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Соколова E.A., Стремовский O.A., Здобнова T.A., Балалаева И.В., Деев С.M., 2015

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах