Вальпроевая кислота может увеличивать потенциал гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Изучение дифференцировочных способностей клеток представляет собой одну из наиболее важ ных проблем современной клеточной биологии. Получение необходимого количества клеток in vitro и их последующая дифференцировка могут дать материал для регенеративной медицины, а так же помочь в изучении регуляции развития или те стировании лекарственных средств. Считается, что с помощью малых молекул, способных менять эпигенетический статус клеток, можно увеличить эффективность клеточной дифференцировки in vitro [1]. Малые молекулы облегчают репрограммирование клеток и увеличивают эффективность дифференци ровки клеток различного типа [2-5]. Вальпроевая кислота (2-пропил-пентановая кис лота, VPA) используется в клинической практике в качестве эффективного противоэпилептическо го средства с широким спектром действия [6]. VPA ингибирует гистон-деацетилазы и вызывает не специфичное повышение экспрессии генов [7]. Идея применения ингибиторов гистон-деацетилаз для уве личения дифференцировочных способностей клеток основана на том, что ацетилирование гистонов при водит к повышению уровня экспрессии различных генов и увеличению транскрипционного пула клетки в целом, облегчая, таким образом, клеточную диффе ренцировку [8]. Одну из наиболее важных проблем представля ет разработка методик клеточной терапии печени. VPA обладает способностью повышать эффектив ность гепатоцитарной дифференцировки как плюри потентных, так и детерминированных клеток [9, 10]. В стандартном протоколе гепатоцитарной диффе ренцировки VPA увеличивает способность эмбрио нальных стволовых (ES) клеток мыши к дифферен цировке в гепатоцитоподобные клетки и уменьшает степень их дифференцировки в протоковом направ лении [9]. Клетки костного мозга человека эффек тивнее дифференцируются в гепатоцитарном на правлении после обработки 5 мМ VPA. Эти клетки экспрессируют альбумин и секретируют мочевину более эффективно, чем клетки, не обработанные VPA [10]. Мезенхимные стволовые клетки пуповинной крови человека лучше подвергаются гепатоцитарной дифференцировке после воздействия 10 мМ VPA, причем прослеживается зависимость эффективности воздействия от концентрации VPA [11]. Разработка методов клеточной терапии печени осложнена недостатком клеток, способных с доста точной эффективностью восполнять функции гепа тоцитов. Таким образом, поиск клеток, способных к гепатоцитарной дифференцировке, представляет важную задачу. Клетки поднижнечелюстной слюн ной железы обладают высокими дифференцировоч ными способностями в энтодермальном направлении и могут стать перспективным источником клеток для терапии органов энтодермального происхожде ния [12-14]. Клетки слюнной железы (КСЖ), полу ченные от человека и различных животных (мышь, крыса, свинья), представляют собой активно про лиферирующую культуру in vitro и обладают спо собностью к дифференцировке в гепатоцитарном и панкреатическом направлениях [13, 15-17]. Нами показано, что культивируемые КСЖ мыши про являют фенотипическую конвергенцию с прогени торными клетками, полученными из печени [18]. Сравнительный in vitro анализ КСЖ и прогенитор ных клеток печени (ПКП) мыши выявил сходство в экспрессии генов клеточных маркеров: EpCAM, CD29, c-Kit, Sca-1, c-Met, цитокератинов 8, 18, 19, Afp и ряда регуляторных генов [18]. При определен ных условиях культивирования КСЖ приобретают способность к синтезу инсулина или альбумина [14-16], однако гепатоцитарная и панкреатическая диф ференцировка этих клеток неполная [16]. Обработка КСЖ мыши 5 мМ вальпроевой кислотой в течение 5 дней вызывает увеличение уровня экспрессии мРНК маркеров как гепатоцитарной (G6p, Alb, Tdo), так и панкреатической (Ngn3, Pax4, Ins1) дифферен цировки [19]. Однако эффект от воздействия ингиби торов гистон-деацетилаз обратим и неспецифичен, поэтому целесообразно применять VPA совместно со специфическими дифференцировочными цито кинами. В представленной работе изучено влияние VPA на эффективность гепатоцитарной дифферен цировки КСЖ мыши с использованием стандартного протокола [20, 21], включающего основные стадии, происходящие при созревании клеток печени. Перед гепатоцитарной дифференцировкой КСЖ обрабаты вали 5 мМ вальпроевой кислотой в течение 5 дней, затем сравнивали эффективность дифференциров ки клеток, подвергнутых и не подвергнутых воз действию VPA. В качестве контроля использовали культуры ПКП и КСЖ мыши на первом пассаже. Примененный подход поможет оценить влияние вальпроевой кислоты на эффективность гепатоци тарной дифференцировки КСЖ, а также изучить фенотипическую пластичность этих клеток. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Животные В работе использовали самцов мышей линии C57BL/6 8-15-недельного возраста, полученных из питомника лабораторных животных «Пущино». Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к пище и воде. Все процедуры были проведены согласно правилам, установленным этическим комитетом Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. При работе с животными руководствовались приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 г. Выделение и культивирование клеток Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъ екцией хлоралгидрата (Sigma) в дозе 300 мг/кг массы тела. Обе поднижнечелюстные слюнные железы и печень были извлечены в стерильных условиях и помещены в фосфатно-солевой буфер (PBS) с 40 мкг/мл гентамицина. После измельче ния органы инкубировали в среде DMEM/F12 (1 : 1) (Gibco) с 0.1% коллагеназой типа IV (Sigma) в те чение 30-40 мин при 37°C. Затем клетки пропуска ли через фильтр с диаметром пор 40 мкм (Corning). Клеточные суспензии дважды промывали средой DMEM/F12, для осаждения клеток использовали мягкое центрифугирование (2 мин, 100 g). Клетки рассаживали на покрытые коллагеном типа I культуральные флаконы (Corning) с плотностью 5 × 103 клеток/см2 и культивировали в стандарт ной среде DMEM/F12 (1 : 1) с добавлением 10% фе тальной телячьей сыворотки (FBS) (HyClone), 2 мМ глутамина (Gibco), 1% инсулин-трансферрин-селе нита (ITS) (Invitrogen) и 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) (Gibco). Среду меняли каж дые 3 дня. После формирования монослоя (5-7 день культивирования) клетки промывали Версеном («ПанЭко»), снимали 0.25% раствором трипсина/EDTA (Gibco) и рассаживали на покрытые колла геном типа I культуральные флаконы с плотностью 1 × 104 клеток/см2. Гепатоцитарная дифференцировка клеток слюнной железы После достижения монослоя КСЖ на первом пас саже (15-20 день после выделения клеток) подвер гали гепатоцитарной дифференцировке. Клетки разделяли на две группы: первую группу инкуби ровали с 5 мМ VPA в течение 5 дней в стандартной ростовой среде (среду с VPA меняли каждый день). Вторую группу инкубировали в течение 5 дней со стандартной ростовой средой без добавления VPA (среду также меняли каждый день). Затем в обе их группах среду заменяли на дифференцировоч ную, содержащую DMEM/F12 (1 : 1) с добавлением 10% FBS (HyClone), 2 мМ глутамина (Gibco), 1% ITS (Invitrogen), 0.03 мМ никотинамида (Sigma), 20 нг/ мл EGF (Gibco) и 20 нг/мл гепатоцитарного факто ра роста (HGF) (Invitrogen). Этот день считали пер вым днем дифференцировки. Дифференцировку проводили в обеих группах по одинаковому про токолу: с 1 по 5 день клетки инкубировали в диф ференцировочной среде с добавлением 20 нг/мл BMP2 (Invitrogen), с 5 по 10 день - с добавлени ем 10 нг/мл онкостатина М (Invitrogen) и 0.1 мкМ дексаметазона (Sigma), с 10 по 15 день - с 1% N2 и 1% B27 (Invitrogen). Среду меняли каждые 3 дня. На 15-й день дифференцировки клетки анали зировали в 2D- и 3D-условиях культивирования. Недифференцированные КСЖ и ПКП на первом пассаже использовали в качестве контроля. Иммуноцитохимия Перед проведением иммуноцитохимического окра шивания клетки рассаживали на культураль ные чашки, покрытые коллагеном типа I, за 3 дня до фиксации. Клетки фиксировали 4% парафор мальдегидом (Sigma) в течение 10 мин, промывали PBS и инкубировали в течение 30 мин при комнат ной температуре в PBS, содержащем 1% бычий сы вороточный альбумин (Sigma) и 0.1% Тритон Х-100 (Sigma). Клетки инкубировали с первичными ан тителами в течение 1 ч при 370C. Антитела разво дили в PBS в следующем соотношении: анти-аль фа-фетопротеин (Afp), 1 : 200 (R&D; MAB1368); антиальбумин (Alb), 1 : 200 (R&D; MAB1455); анти цитокератин 19 (Krt19), 1 : 100 (AbCam; ab15463-1). Затем клетки трижды промывали PBS и инкуби ровали с вторичными антителами (1 : 1000) в те чение 40 мин при 370C. Использовали вторичные антитела: Alexa Fluor® 488 антикроличьи IgG осла (H + L) (Invitrogen; A-21206) и Alexa Fluor® 488 ан тимышиные IgG козы (H + L) (Invitrogen; A-11029). Клетки промывали 3 раза по 10 мин PBS, во вре мя последней отмывки добавляли DAPI (Sigma). Клетки анализировали на флуоресцентном микро скопе Olympus IX51. В качестве негативного кон троля использовали окраску только вторичными антителами. Выделение тотальной РНК Тотальную РНК выделяли с использованием AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen) по инструкции произ водителя. Концентрацию РНК измеряли с использо ванием мини-флуориметра Qubit и RNA Assay Kit (Invitrogen). Для обратной транскрипции использо вали Superscript II kit (Invitrogen) со случайными праймерами по инструкции производителя. В реак цию брали 500 нг тотальной РНК. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) ПЦР-РВ проводили с использованием набора с кра сителем EVA Green («Синтол») на приборе CFX96 (BioRad) в следующем режиме. Предварительная инкубация - 95оС, 5 мин для активации ДНК полимеразы; 40 циклов: денатурация - 95оС, 30 с; отжиг - 57-59оС, 30 с; элонгация - 72°С, 45 с. Детекцию флуоресценции в канале Fam и первич ную обработку результатов осуществляли с ис пользованием программного обеспечения прибора в автоматическом режиме. В качестве внутренне го стандарта для вычисления концентрации всех мРНК использовали мРНК гена домашнего хо зяйства Gapdh. Список праймеров представлен в табл. 1 приложения. Исследование метилирования ДНК методом бисульфитного секвенирования ДНК выделяли из замороженных клеток с помощью набора GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich G1N70) по инструкциям произ водителя. ДНК после определения концентрации с помощью мини-флуориметра Qubit (Invitrogen) обрабатывали бисульфитом натрия с использовани ем набора EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen). Праймеры для амплификации участков генов на модифициро ванной бисульфитом геномной ДНК конструировали с помощью онлайн-сервиса BiSearch (http://bisearch. enzim.hu/?m=search). Выбирали участки, соответ ствующие CpG-островкам (CGI) вблизи точки ини циации транскрипции или, при отсутствии остров ков, области, непосредственно предшествующей точке инициации транскрипции. Список праймеров представлен в табл. 2 приложения. Амплификацию осуществляли в два этапа с заменой одного из прай меров на внутренний на втором этапе. В качестве матрицы на втором этапе использовали 2 мкл ПЦР смеси, полученной на первом этапе. ПЦР проводили на приборе ДТ-322 («ДНК-Технология») с исполь зованием набора для амплификации qPCRmix-HS SYBR+ROX («Евроген»). Условия амплификации: денатурация матрицы и активация полимеразы: 95оС, 5 мин; затем 40 циклов: 95оС, 30 с; 52-56оС (в зависимости от температуры плавления прай меров), 30 с; 72оС, 45 с; последняя элонгация: 72оС, 2 мин. Продукты амплификации фракционирова ли электрофорезом в 2% агарозном геле, продукты ожидаемой длины вырезали под ультрафиолетом, ДНК экстрагировали и очищали с помощью на бора GenElute Gel Extraction Kit (Sigma-Aldrich NA1111-1KT). Полученные фрагменты секвенирова ли в ЦКП «Геном» (http://www.genome-centre.ru/) с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продук тов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Визуализацию ре зультатов секвенирования и их экспорт в формате fasta осуществляли с помощью программы Sequence Scanner (http://www.lifetechnologies.com/global/ en/home/technical-resources/software-downloads/ sequence-scanner-software.html), а дальнейшую об работку с помощью онлайн-сервиса Meth Tools 2.0 (http://194.167.139.26/methtools/MethTools2_submit.html) [22]. Анализ метилирования гистонов Фракционирование хроматина (ChIP) осуществля ли с помощью антител к метилированным формам гистона H3 (Abcam: H3K4me3, № ab1012, H3K9me3, № ab8898, H3K27me3, № ab6002) и набора Imprint Chromatin Immunoprecipitation Kit (Sigma-Aldrich CHP1) по инструкции производителя. Фракции ДНК, ассоциированные с модифицированными ги стонами, амплифицировали с помощью набора пол ногеномной амплификации REPLI-g UltarFast Mini Kit (Qiagen 150033) по инструкции производителя. Относительное содержание изучаемых генов в ас социированных с модифицированными гистонами фракциях ДНК определяли с помощью ПЦР-РВ. Для сравнения использовали суммарную геном ную ДНК из тех же самых клеток. ПЦР-РВ прово дили с помощью набора qPCRmix-HS SYBR+ROX («Евроген»), в реакцию брали 50 нг ДНК-матрицы. Праймеры для ПЦР-РВ представлены в табл. 3 при ложения. По соотношению пороговых циклов в реак циях с H3Kme-ассоциированными образцами ДНК, с одной стороны, и контрольной геномной ДНК, с дру гой, определяли относительную степень обогащения каждой фракции участками изучаемых генов. Анализ секреции мочевины Способность клеток секретировать мочевину анали зировали в 3D-условиях культивирования в колла геновом геле. Коллаген типа I растворяли в стериль ной 0.1% уксусной кислоте до концентрации 5 мг/мл. В отдельную пробирку последовательно добавляли следующие компоненты: NaOH (Sigma) до концен трации 0.023 мМ, Na2CO3 («ПанЭко») до 0.26%, ×10 DMEM (Sigma) до ×1, 100% GlutaMax (Gibco) до 2 мМ, 100% HEPES (Gibco) до 1%, FBS (HyClone) до 10%. Затем добавляли раствор коллагена до конечной концентрации 4%. Суспензию клеток вносили в PBS, концентрация клеток - 1 × 106 на 1 мл геля. Гель инкубировали в чашках Петри при 37°С в течение 30 мин, после полимеризации геля в чашки добав ляли по 2 мл среды культивирования. Клетки в геле культивировали в СО2-инкубаторе в стандартных условиях. Концентрацию мочевины определяли в среде культивирования с помощью набора Urea Assay Kit (BioVision) по инструкции производителя. Пробы среды в 3D-условиях культивирования отбирали на 1, 5, 10 и 15 день инкубации клеток в геле. За 24 ч до взятия пробы среду культивирования заменяли средой DMEM/F12 без сыворотки. Количество мо чевины определяли по интенсивности хромоген ной реакции на планшетном ридере Start Fax 2100 (Awareness Technology Inc.). Статистическая обработка данных Все эксперименты проводили на культурах, полу ченных от трех разных животных. Каждая проце дура была проведена в трех технических повторах, осуществляемых в одинаковых условиях. При оценке статистической значимости различий показателей использовали t-критерий Стьюдента. Различия счи тали статистически значимыми при р < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ Иммуноцитохимическое окрашивание и ПЦР-РВ выявляют увеличение экспрессии гепатоцитарных маркеров и уменьшение экспрессии протоковых маркеров в клетках слюнной железы, обработанных вальпроевой кислотой На 15-й день гепатоцитарной дифференцировки клетки окрашивали антителами к альбумину (Alb, маркер гепатоцитов), альфа-фетопротеину (Afp, маркер прогениторных клеток печени) и цитокера тину 19 (Krt19, маркер прогениторных и протоковых клеток). Дифференцированные КСЖ, подвергнутые обработке VPA, были названы КСЖ-диф-VPA, диф ференцированные КСЖ, не обработанные VPA, на званы КСЖ-диф. КСЖ и ПКП на первом пассаже экспрессируют Krt19, слабо экспрессируют Afp и Alb (рис. 1). В ПКП Krt19 локализуется около ядра, а в КСЖ также под клеточной мембраной. После дифференцировки экспрессия Afp и Alb в КСЖ увеличивается, при чем после воздействия VPA уровень экспрессии Alb значительно возрастает (рис. 1), и происходит поте ря локализации Krt19 под мембраной клетки. Кроме того, в КСЖ-диф-VPA значительно снижается уро вень экспрессии Krt19. Методом ПЦР-РВ в целом подтверждены резуль таты, полученные при иммуноцитохимическом ис следовании. Для удобства интерпретации результа тов после нормирования по Gapdh уровни экспрессии генов в КСЖ на первом пассаже принимали равными 1. В остальных культурах уровни экспрессии генов выражали относительно КСЖ на первом пассаже (рис. 2, 3). В КСЖ-диф значительно увеличивается экс прессия мРНК ранних маркеров дифференциров ки Aat и Afp (рис. 2). Возрастает также экспрессия маркеров гепатоцитов G6p, Pepck, Tat и Cyp3a13, но не поздних дифференцировочных маркеров Alb и Tdo. В КСЖ-диф-VPA уровни экспрессии ранних маркеров Aat и Afp увеличиваются в меньшей сте пени, чем в СЖ-диф, однако экспрессия поздних дифференцировочных маркеров Alb и Tdo значи тельно возрастает по сравнению с КСЖ-диф (рис. 2). Экспрессия гена протокового маркера Krt19 в КСЖ диф-VPA снижается, а характерного для протоко вых клеток цитохрома P450 7a1 возрастает после дифференцировки, однако в КСЖ-диф-VPA в мень шей степени (рис. 2). Экспрессию генов транскрипционных факторов, необходимых для гепатоцитарной дифференциров ки, также анализировали методом ПЦР-РВ. На пер вом пассаже в культуре ПКП выявлен высокий уро вень экспрессии гепатоцитарных ядерных факторов Hnf-3β, Hnf-4α и Hnf-6. Однако экспрессия ранне го маркера энтодермы Hnf-3α была выше в КСЖ (рис. 3). В КСЖ-диф уровни экспрессии Hnf-3β, Hnf- 4α и Hnf-6 увеличивались до значений, наблюдаемых в культуре ПКП. Наряду с этим, в КСЖ-диф возрас тает экспрессия раннего маркера дифференцировки (Tbx3), а также транскрипционных факторов, необ ходимых для протоковой (Hhex1) и ацинарной (Ptf1a) дифференцировки (рис. 3). VPA неоднозначно влияет на экспрессию транскрипционных факторов. С од ной стороны, экспрессия Hhex1 снижается, а Tbx3 и Ptf1a увеличивается незначительно, что может го ворить о повышении специфичности дифференци ровки. С другой стороны, экспрессия Hnf-4α не уве личивается. В целом, в дифференцированных КСЖ мыши зна чительно возрастает экспрессия факторов транс крипции, необходимых для гепатоцитарной диффе ренцировки, и ранних гепатоцитарных маркеров (Afp и Aat). Увеличение экспрессии более поздних диффе ренцировочных маркеров (G6p, Pepck, Tat, Alb и Tdo) выражено слабее. Таким образом, в 2D-условиях культивирования инициируется гепатоцитарная дифференцировка и осуществляются ее начальные этапы. Эффект от воздействия VPA на дифферен цировку КСЖ не однозначен. С одной стороны, экс прессия маркеров протокового направления (Krt19 и цитохрома P450 7a1) снижается, а маркеров гепато цитов - Alb и Tdo - повышается, что может говорить об ускорении процесса дифференцировки. С другой стороны, уровень экспрессии более ранних гепато цитарных маркеров в КСЖ-диф-VPA, как правило, ниже, чем в КСЖ-диф. Не исключено, что КСЖ-диф-VPA находятся в более поздней стадии гепатоци тарной дифференцировки, для которой характерен низкий уровень экспрессии ранних дифференциро вочных маркеров. Кроме того, известно, что гены Afp и Aat в норме экспрессируются в клетках слюнных желез. Увеличение экспрессии Aat в протоковых от делах слюнных желез наблюдается в процессе их дифференцировки и развития [23, 24]. Изначально культура КСЖ представлена малодифференциро ванными клетками. В ходе гепатоцитарной диффе ренцировки могут возникать более поздние дифференцировочные стадии, характерные для слюнной железы, т.е. наблюдаемое нами различие в экспрес сии Afp и Aat в культурах КСЖ-диф и КСЖ-диф-VPA может также отображать различную степень их собственной дифференцировки. В этом случае уменьшение экспрессии этих генов в КСЖ-диф- VPA может говорить о повышении специфичности гепатоцитарной дифференцировки и об уменьшении коммитирования, свойственного слюнным железам. Анализ метилирования ДНК не выявил значительных изменений метилирования промоторных областей генов, ключевых для гепатоцитарной дифференцировки, в дифференцированных клетках слюнной железы Проанализирован характер метилирования генов, необходимых для гепатоцитарной дифференци ровки, в культурах КСЖ, ПКП и КСЖ-диф-VPA на первом пассаже. Анализировали участки, соответ ствующие CpG-островкам, вблизи точки инициации транскрипции или, в случае отсутствия островков, области, непосредственно предшествующей точке инициации транскрипции. В большинстве случа ев метилирование именно этих областей наиболее существенно для экспрессии генов. В графическом виде, сгенерированном онлайн-сервисом Meth Tools 2.0, характер метилирования генов представлен на рис. 4. Показано, что метилирование ДНК сходно во всех трех проанализированных культурах. Часть CpG островка гена Gata4, находящаяся в промоторной области, практически не метилирована, а метилиро ванные остатки цитозина расположены ниже точки инициации транскрипции. Ген Gata6 практически не метилирован. Возможно, во всех трех культурах эти гены активны или находятся в предактивиро ванном состоянии. Промоторная область гена Hnf-1α сильно метилирована во всех культурах, однако она не является CpG-островком, а представляет собой спорадические CpG-сайты, поэтому не ясно, как данное метилирование влияет на экспрессию. Ген Hnf-3β метилирован сильно и одинаково во всех трех культурах, что может говорить о его устойчивой репрессии, хотя CpG-островок находится не в про моторной, а в начале кодирующей области. Известны случаи, когда подобное метилирование не препят ствует транскрипции. Ген Alb метилирован довольно сильно и практически одинаково во всех культурах. Это может означать, что он устойчиво репрессирован в клетках всех трех типов, или метилирование дан ного участка не существенно для транскрипции. Таким образом, не выявлено значительных раз личий в метилировании ДНК промоторных областей большинства исследованных генов в трех клеточ ных культурах. По всей видимости, специфический контроль транскрипции этих генов осуществляется в проанализированных клетках за счет других эпиге нетических модификаций (возможно, модификаций гистонов). Обработка вальпроевой кислотой и последующая дифференцировка клеток слюнной железы изменяет метилирование гистона Н3 на участках хроматина, ассоциированных с генами, ключевыми для гепатоцитарной дифференцировки Метилирование гистонов играет одну из наиболее важных ролей в эпигенетической регуляции транс крипции. Мы проанализировали три наиболее из ученных типа метилирования гистона H3: H3K4me3, наиболее четко коррелирующего с транскрипци онной активностью промоторов; H3K9me3, корре лирующего с инактивацией генов по механизму гетерохроматинизации; H3K27me3, вовлеченного в реализацию инактивирующего действия Polycomb репрессорных комплексов второго типа (PRC2) на ак тивность генов. Показано, что характер метилирования гистона H3 на ранних энтодермальных генах Gata4 и Gata6 в КСЖ в целом сходен (рис. 5). В КСЖ на первом пассаже молекулы гистона H3, ассоциированные с этими генами, триметилированы по положению H3K9, что говорит об их гетерохроматиновой инак тивации. В то же время в КСЖ на обоих генах вы явлено триметилирование гистона Н3 в положении H3K4. Низкий уровень экспрессии Gata4 и Gata6 в КСЖ, обнаруженный ранее методом глубокого сек венирования транскриптома [18], свидетельствует о том, что инактивирующая модификация H3K9me3 гистона Н3 в этих клетках является доминантной. В ПКП уровень модификации H3K9me3 гистона Н3 на генах Gata4 и Gata6 гораздо ниже, а модификация H3K27me3 практически отсутствует. Это коррели рует с относительно высокой экспрессией этих генов в прогениторных клетках печени, что показано ранее методом глубокого секвенирования транскриптома. В КСЖ-диф-VPA значительно снижается метили рование гистона Н3 в положении H3K9me3 на генах Gata4 и Gata6, при том что несколько увеличивается метилирование в положении H3K27me3. Это может свидетельствовать об активации транскрипции дан ных генов после дифференцировки и возможной их вторичной инактивации. В КСЖ на первом пассаже выявлена сильная инактивация гена транскрипционного фактора Hnf-1α по механизму гетерохроматинизации, а также по вышение уровня H3K27me3-модификации гистона H3 на этом гене по сравнению с ПКП. После диффе ренцировки модификации H3K9me3 и H3K27me3 практически полностью исчезают. Метилирование H3K4me3 гистона Н3 на гене Hnf-1α в КСЖ-диф-VPA соответствует уровню, характерному для ПКП на первом пассаже. Это может свидетельствовать об активации транскрипции данного гена после про ведения гепатоцитарной дифференцировки. Гены ядерных факторов гепатоцитов Hnf-3β и Hnf-4α характеризуются сходными особенно стями метилирования гистонов. В КСЖ на первом пассаже молекулы гистона H3, ассоциированные с данными генами, метилированы по положениям H3K9me3 и H3K27me3, однако уровень H3K9me3 метилирования гена Hnf-3β несколько ниже, чем в ПКП. Эти данные коррелируют с результатами, полученными методами ПЦР-РВ и глубокого секве нирования транскриптома, согласно которым в КСЖ на первом пассаже экспрессируется Hnf-3β. В слу чае гена Hnf-4α уровень метилирования H3K9me3 соответствует уровню в ПКП. Однако уровень ме тилирования H3K27me3 в КСЖ на первом пассаже значительно выше, чем в ПКП. После дифферен цировки метилирование H3K9me3 на генах Hnf-3β и Hnf-4α практически исчезает, а метилирование H3K27me3 сохраняется на низком уровне. Это мо жет свидетельствовать об активации данных генов, что коррелирует с результатами ПЦР-РВ, согласно которым уровень экспрессии Hnf-3β в КСЖ-диф-VPA возрастает в 3 раза по сравнению с начальным значением. Для Hnf-6 в КСЖ характерен высокий уровень метилирования H3K9me3. После дифференцировки метилирование существенно уменьшается, однако уровень H3K27me3 немного возрастает. Это может свидетельствовать о вторичной инактивации гена Hnf-6. Для гена Alb в КСЖ на первом пассаже харак терно H3K9me3- и H3K27me3-метилирование ги стона H3. После дифференцировки метилирование H3K9me3 практически исчезает, а уровень метили рования H3K27me3 немного снижается по сравне нию с начальным значением. Уровень метилирования H3K4me3 в КСЖ-диф-VPA соответствует уровню в ПКП на первом пассаже. Это может свидетельство вать о некоторой активации транскрипции данного гена. По результатам ПЦР-РВ начальный уровень экспрессии Alb в КСЖ на первом пассаже незначи телен. После дифференцировки уровень экспрессии Alb увеличивается почти в 18 раз, однако абсолютное значение экспрессии данного гена в КСЖ-диф-VPA остается довольно низким. Таким образом, полученные результаты свиде тельствуют о том, что обработка VPA и последу ющая процедура дифференцировки затрагивают механизмы эпигенетической регуляции генома. Метилирование ДНК промоторных областей ге нов в изучаемых клетках различается очень мало. Однако характер метилирования молекул гистона H3, ассоциированного с изученными генами, суще ственно различается. Гены ранних маркеров энто дермы Gata4 и Gata6 и ядерных гепатоцитарных факторов Hnf-1α и Hnf-6 в КСЖ на первом пассаже инактивированы по механизму гетерохроматини зации. Гены Hnf-3β, Hnf-4α и Alb, помимо этого, по видимому, могут подвергаться действию Polycomb репрессорного комплекса второго типа. После дифференцировки в КСЖ практически во всех случаях исчезает H3K9me3-метилирование гисто на Н3. Однако гены Gata4, Gata6, Hnf-6 и Alb могут, вероятно, подвергаться вторичной инактивации по средством метилирования H3K27me3. В целом, вы явлено хорошее соответствие результатов анализа метилирования гистонов и экспрессии генов. Вальпроевая кислота увеличивает секрецию мочевины клетками слюнной железы мыши в 3D-условиях культивирования Одна из детоксикационных функций печени - синтез мочевины из аммиака, осуществляемый гепатоци тами. Способность синтезировать мочевину широко используется в качестве теста на функциональную активность клеток при гепатоцитарной диффе ренцировке [25]. Для оценки степени гепатоцитар ной дифференцировки in vitro определили уровень синтеза мочевины дифференцированными КСЖ в 3D-условиях (в коллагеновом геле). В качестве кон троля использовали ПКП и КСЖ на первом пассаже, не подвергавшиеся дифференцировке. На первом пассаже в 2D-условиях КСЖ и ПКП практически не синтезируют мочевину, но приобре тают способность синтезировать ее в 3D-условиях культивирования. Увеличение уровня синтеза моче вины клетками в коллагеновом геле в течение всего периода наблюдения говорит о том, что 3D-условия культивирования способствуют дифференцировке данных клеток. К 15-му дню инкубации КСЖ в геле уровень син теза ими мочевины достигает 24 мМ на 1 × 106 клеток за 24 ч (рис. 6), тогда как свежевыделенные гепато циты мыши синтезируют около 350 мМ мочевины на 1 × 106 клеток за 24 ч. Высокий уровень синтеза мочевины КСЖ может отражать их значительную способность к дифференцировке в гепатоцитарном направлении при определенных условиях культи вирования. ПКП активнее синтезируют мочевину в 3D-условиях: к 15-му дню уровень синтеза мочеви ны ПКП в 7.6 раза меньше, чем у первичной культу ры гепатоцитов. Это говорит о высокой степени диф ференцировки контрольных ПКП в гепатоцитарном направлении в 3D-условиях. После гепатоцитарной дифференцировки спо собность КСЖ синтезировать мочевину возрастает, причем при использовании VPA КСЖ синтезируют мочевину на сопоставимом с контрольными ПКП уровне. Таким образом, использованный протокол гепатоцитарной дифференцировки затрагивает не только регуляторные гены КСЖ мыши, но вли яет также на их функциональные характеристики. Гепатоцитарная дифференцировка КСЖ позволяет получить клетки, способные к выполнению некото рых функций гепатоцитов. VPA может повысить эф фективность дифференцировки. ОБСУЖДЕНИЕ Использование малых молекул, способных влиять на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов и вызывать увеличение эффективности диффе ренцировки, является перспективным подходом в клеточной биологии. VPA повышает эффектив ность дифференцировки различных типов клеток. Dong и соавт. [9] показали, что после воздействия VPA значительно увеличивается эффективность ге патоцитарной дифференцировки ES-клеток мыши и уменьшается степень их спонтанной дифференци ровки в структуры, напоминающие клетки желчных протоков. Предполагается, что одним из механизмов, ускоряющих дифференцировку ES-клеток, может быть переход клеточного цикла в фазы G0/G1, кото рый происходит при воздействии VPA. Замедление клеточного цикла способствует утрате плюрипотент ности и дифференцировке ES-клеток. VPA также может увеличивать эффективность дифференцировки детерминированных клеток. После 72 ч воздействия 5 мМ VPA на клетки кост ного мозга человека увеличивается ацетилирование гистонов H3 и H4, что способствует деметилиро ванию ДНК данных клеток [10]. При последующей дифференцировке в гепатоцитарном направлении клетки костного мозга человека экспрессирова ли альбумин и запасали гликоген более эффектив но, чем клетки, не подвергнутые воздействию VPA. Дифференцированные клетки костного мозга были способны к секреции мочевины, причем после об работки VPA синтез мочевины возрастал примерно в 1.5 раза [10]. Предполагается, что увеличение эф фективности дифференцировки клеток костного моз га связано с деметилированием генов, участвующих в гепатоцитарной дифференцировке. Помимо ингибирования гистон-деацетилаз, VPA способна вызывать активное деметилирование ДНК, не зависящим от репликации способом [7]. Этот эф фект также может увеличивать транскрипционную активность генов. Кроме того, VPA активирует гены семейства Wnt [26]. Показано, что сигнальный путь Wnt/β-катенин необходим для формирования энто дермы и дифференцировки клеток печени и подже лудочной железы [27, 28]. Проведенное нами сравнительное исследование КСЖ и ПКП мыши дает представление о способ ности КСЖ к гепатоцитарной дифференцировке и о влиянии VPA на эффективность дифференци ровки. Показано, что инициация и начальные этапы гепатоцитарной дифференцировки КСЖ проходят достаточно эффективно, затрагивая как широкий набор транскрипционных факторов, так и различ ные маркеры, характерные для клеток печени. Однако в 2D-условиях культивирования доволь но сложно добиться терминальных дифференци ровочных стадий. По этой причине эффективность дифференцировки мы оценивали в 3D-условиях культивирования, которые приближают клетки к условиям, в которых они находятся в организме. Культивирование клеток в коллагеновом геле способ ствует проявлению их морфогенетического и диффе ренцировочного потенциала [29, 30]. В 3D-условиях культивирования КСЖ-диф-VPA секретируют мочевину на высоком уровне, сопоставимом с кон трольными ПКП. Это говорит об эффективной гепа тоцитарной дифференцировке, влияющей на функ циональные характеристики клеток. Использованный протокол дифференцировки практически не влияет на метилирование ДНК про моторных областей ключевых для гепатоцитарной дифференцировки генов, что не удивительно, учиты вая консервативный механизм метилирования ДНК. Однако обработка VPA и последующая дифферен цировка в значительной степени влияют на метили рование гистона H3. Показано, что метилирование гистонов в большинстве случаев выше в контрольных КСЖ и, как правило, ниже в дифференцированных КСЖ. В целом, это можно объяснить прогенитор ной природой КСЖ: многие гены в прогениторных клетках имеют бивалентную конфигурацию, т.е. обо гащены и активирующими, и ингибирующими мо дификациями гистонов. Это позволяет им диффе ренцироваться в разных направлениях. Выявлена хорошая корреляция между метилированием гисто нов в КСЖ и экспрессией генов. Скорее всего, существует несколько путей воз действия VPA на дифференцировочный потенциал клеток. Эффективность дифференцировки зависит не только от приобретения ими маркеров целевых клеток, но и от потери дифференцировочных свойств исходной клеточной линии. Как известно из опыта перепрограммирования клеток, детерминированные клетки легче приобретают дифференцировочные маркеры целевых клеток, а потеря маркеров исход ных клеток происходит медленнее [31]. Согласно по лученным нами данным, VPA способна уменьшать экспрессию ряда маркеров, характерных для ис ходных КСЖ. Возможно, одним из механизмов воз действия VPA на эффективность дифференцировки является способность к стиранию эпигенетической программы исходной клеточной линии, что уско ряет дифференцировку. Помимо этого, вероятным механизмом влияния VPA на эффективность диф ференцировки может быть модификация гистона H3 генов-мишеней и увеличение доступности этих ге нов для факторов роста и цитокинов, используемых в дифференцировочном протоколе. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что клетки поднижнечелюстной слюнной же лезы мыши проявляют значительную фенотипиче скую пластичность и способны к дифференцировке в гепатоцитарном направлении. Вальпроевая кислота влияет на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов посредством модификации гистонов, она спо собна увеличивать специфичность и эффективность гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши. Механизм воздействия вальпроевой кислоты на эффективность дифференцировки мо жет заключаться в стирании коммитирования исход ной клеточной линии и/или облегчении доступности целевых генов для факторов роста и цитокинов, ис пользуемых в процессе дифференцировки.

Об авторах

O. С. Петракова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

В. В. Ашапкин

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

В. Ю. Штратникова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

Л. И. Кутуева

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

E. A. Воротеляк

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

M. A. Борисов

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

В. В. Терских

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

И. Г. Гвазава

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

A. В. Васильев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы