Клонирование и характеристика новой сайт-специфической метилзависимой эндонуклеазы ElmI, узнающей и расщепляющей С5-метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)^NG(5mC)-3’

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Сайт-специфические метилзависимые эндонуклеа зы (MD-эндонуклеазы) узнают и расщепляют ДНК по определенным метилированным последователь ностям и не расщепляют неметилированную ДНК. За последние 9 лет описано более 10 прототипов этих ферментов с разными сайтами узнавания, которые расщепляются лишь при условии С5-метилирования определенных остатков цитозина в них. MD-эндонуклеазы, в отличие от эндонуклеаз ре стрикции, узнают не только определенную нуклео тидную последовательность и положение гидроли зуемой связи относительно этой последовательности, но и строго определенный узор метилирования. Поэтому разные MD-эндонуклеазы даже со сход ным сайтом узнавания могут по-разному расщеплять ДНК в зависимости от характера ее метилирования. Это хорошо видно на примере ферментов, узнающих метилированную последовательность 5’-GCNGC-3’. Так, среди ферментов с таким сайтом узнавания и с гидролизуемой позицией после центрального ну клеотида «N» BlsI [1] расщепляет эту последователь ность при наличии в ней, как минимум, двух, а PkrI [2] - трех остатков 5-метилцитозина. Среди фермен тов, гидролизующих связь перед центральным ну клеотидом «N», MD-эндонуклеаза BisI [3] расщепля ет 5’-GCNGC-3’ при наличии двух 5-метилцитозинов (и намного менее эффективно в случае одного), тогда как для GluI [4] нужны четыре остатка 5-метилци тозина. Нами описан новый представитель данной груп пы ферментов - MD-эндонуклеаза ElmI, узнающая метилированную последовательность 5’-GCNGC-3’ и расщепляющая ее перед центральным нуклеоти дом «N» (с образованием 5’-выступающих однону клеотидных концов), если содержит не менее двух остатков 5-метилцитозина, причем активность фер мента увеличивается на порядок, если в сайте узна вания метилированы три или четыре остатка цито зина. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Проведение ПЦР-скрининга на ДНК энтеробактерий из природных образцов и получение плазмиды pElmI, несущей ген новой MD-эндонуклеазы Колиформные бактерии выделяли из природных образцов (сточных вод) на селективной среде Эндо согласно [5]. Из посевов каждого образца отбирали по 8-20 штаммов (серии LM, LT, LP и LV), отличаю щихся по морфологическим характеристикам. Из полученных штаммов выделяли хромосомную ДНК, на которой проводили ПЦР-скрининг с исполь зованием праймеров, приведенных ниже. Фрагмент, амплифицированный с ДНК одного из штаммов дико го типа, встраивали в плазмиду pMTL22 [6] по сайтам эндонуклеаз рестрикции FauNDI и BglII. После трансформации клеток E. coli ER2267 кло ны, несущие целевую плазмиду, названную pElmI, высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB с добавлением ампициллина (50 мкг/мл). Клоны подращивали в течение ночи при 370С, после чего пе ресевали на отдельные чашки с ампициллином (100 мкг/мл) и вновь выдерживали в течение ночи с це лью дальнейшего анализа. Наработка биомассы рекомбинантного штамма продуцента ElmI и тестирование целевой активности Рекомбинантный клон штамма E. coli ER2267, трансформированного плазмидой pElmI, пере носили с чашки Петри микробиологической петлей во флакон с 200 мл бульона LB, содер жащего 100 мкг/мл ампициллина. Инокулят подра щивали в течение ночи на термостатированной ка чалке при 37оС и 120 об/мин. Далее по 5 мл инокулята засевали в 20 фла конов с 200 мл бульона LB, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 0.5 мМ изопропил-β-D тиогалактопиранозида (IPTG). Культуру подращивали в термостатированной качалке при 120 об/мин в течение 10 ч, после чего для анализа активности фермента отбирали алик воту выросшей культуры (1 мл) и переносили ее в пробирку Eppendorf на 1.5 мл. Клетки осаждали в настольной центрифуге 5416 Eppendorf (Eppendorf GmbH, Германия) при 12000 об/мин в течение 2 мин. Супернатант убирали, а осадок суспендировали в 0.2 мл лизирующего буфера (10 мМ трис-HCl, pH 8.5, 0.1 мг/мл лизоцима, 0.5 М NaCl, 1 мМ EDТА, 0.1% Тритон Х-100). Активность фермента в лизате определяли в 20 мкл реакционной смеси, содержащей в качестве субстрата ДНК плазмиды pFsp4HI3 [4], предвари тельно линеаризованной рестриктазой DriI в SE буфере «W» (10 мМ трис-HCl (рН 8.5 при 25°C), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол) в течение 2 ч при 37оС. За 1 ед. акт. ElmI принимали количе ство фермента, достаточное для исчерпывающего гидролиза 1 мкг ДНК pFsp4HI3 в SE-буфере «W» за 2 ч при 37оС. Наличие или отсутствие гидролиза субстратной ДНК определяли методом электрофоре за в 1% агарозном геле. Клетки всей наработанной биомассы осаждали на центрифуге J2-21 (Beckman, США) в течение 30 мин (ротор JA-10, 8000 об/мин) и замораживали. Получение препарата фермента ElmI Все процедуры выделения и очистки препарата фер мента проводили при 40С с использованием следую щих растворов: - буфер А - 10 мМ трис-HCl, pH 7.5; 0.1 мМ EDТА; 7 мМ 2-меркаптоэтанол; - буфер В - 10 мМ К-фосфатный буфер, pH 7.4; 0.1 мМ EDТА; 7 мМ 2-меркаптоэтанол. Ферментативную активность определяли с ис пользованием в качестве субстрата ДНК pFsp4HI3 [4] в SE-буфере «W», которую гидролизовали в течение 15 мин в 20 мкл реакционной смеси путем добавления аликвот (1 мкл) из фракций хроматографического профиля. Получение грубого экстракта. Биомассу (8 г) су спендировали в 30 мл буфера А, содержащего 0.2 М NaCl, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 0.1% Тритон Х-100; 0.1 мг/мл лизоцима. Клетки раз рушали ультразвуком на дезинтеграторе Soniprep 150 (MSE, Великобритания), снабженного адапто ром диаметром 2 см, при амплитуде 20 мкм, 4 раза по 1 мин с интервалом в 1 мин для охлаждения су спензии в водяной бане. Экстракт осветляли центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 мин (роторе JA-20, центрифуга J2-21, Beckman, США). Хроматография на фосфоцеллюлозе P-11. Грубый экстракт разбавляли в 2 раза буфером А и наноси ли на колонку с фосфоцеллюлозой P-11 объемом 30 мл, уравновешенную буфером А, содержащим 0.1 М NaCl, промывали 160 мл этого же буфера. Адсорбированный материал вымывали линейным градиентом NaCl от 0.1 до 1 М объемом 800 мл в буфе ре А. Собирали 30 фракций, из которых объединяли фракции с 16 по 22 (от 0.35 до 0.47 М NaCl), содержа щие пик целевой активности. Хроматография на гидроксилапатите. Объединенные фракции наносили на колонку с гидроксилапа титом объемом 2 мл, уравновешенную буфером В, содержащим 0.05 М NaCl, промывали 10 мл этого же буфера. Адсорбированный материал вымывали ли нейным градиентом K-фосфатного буфера, pH 7.4, от 0.01 до 0.1 М, содержащим 0.05 М NaCl, объемом 30 мл. Собрали градиент из 20 фракций, из которых объединили фракции с 8 по 12 (от 0.044 до 0.056 М калий-фосфата), содержащие пик активности ElmI. Полученные фракции диализовали в течение 1 ч в 300 мл буфера А. Хроматография на гепарин-агарозе. Диализованные фракции наносили на колонку с гепарин-агарозой объемом 2 мл, уравновешенную в буфере В, содержа щим 0.05 М NaCl, и промывали 4 мл этого же буфера. Адсорбированный материал вымывали линейным градиентом NaCl (0.05 до 1 М) в буфере В объемом 30 мл. Собрали 20 фракций, из которых объединили фракции 12 и 13 (с градиентом от 0.62 до 0.67 М NaCl), содержащие целевую активность. Концентрирование, проверка активности и хране ние препарата. Полученные фракции диализовали в течение 20 ч против 15-кратного объема буфера В с 50% глицерином, 0.2 М NaCl и хранили при -20°С. Активность проверяли добавлением восьми по следовательных двукратных разведений препарата фермента (2, 1, 1/2 мкл и т.д.) к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0.5 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в SE буфере «W» с последующей инкубацией в течение 2 ч при 37°С. Для получения разбавленных препаратов ферментов использовали SE-буфер для разбавления ферментов «B100» (10 мМ трис-HCl (рН 7.6 при 25°C), 50 мМ KCl, 0.1 мМ EDТА, 200 мкг/мл БСА, 1 мМ ди тиотреитол, 50% глицерин). Реакцию останавливали, добавляя в каждую реакционную смесь 1 мкл стоп буфера следующего состава: 50% глицерин, 10 мМ EDТА, 0.2% бромфеноловый синий. Нуклеотидную последовательность ДНК опре деляли по методу Сэнгера на автоматическом сек венаторе ABI 3130xI Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Препараты ферментов, ДНК, дезоксинуклеозид трифосфатов и синтетических олигонуклеотидов, а также маркеры молекулярных масс (1 kb Ladder и Lambda/StyI), использованные в работе, произве дены в ООО «СибЭнзайм» (Россия). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Клонирование гена новой MD-эндонуклеазы ElmI и сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Описанные нами ранее MD-эндонуклеазы обна ружены в бактериях различных таксономических групп, но в основном среди представителей семейств Microbacteriaceae и Bacillaceae. Скрининг активности в лизатах клеток, проведенный ранее, не позволил нам выявить подобные сайт-специфические фермен ты в штаммах энтеробактерий, что может свидетель ствовать либо об отсутствии, либо о крайне низкой активности MD-эндонуклеаз у бактерий этой груп пы. Поэтому для решения этого вопроса была пред принята попытка найти гомологичные белки энтеро бактерий не биохимическим, а биоинформатическим способом. В базе данных аминокислотных последователь ностей энтеробактерий с помощью программы PSI-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) про веден поиск последовательностей, гомологичных ранее определенной нами MD-эндонуклеазе BisI (GenBank AJW87312) [7]. После выполнения двух итераций поиска у энтеробактерий обнаружили около 50 аминокислотных последовательностей, об ладающих гомологией (32-48% сходства и 17-30% идентичности) с последовательностью BisI, при чем функция ни одного из выявленных белков-го мологов еще не установлена. Нуклеотидные после довательности соответствующих генов извлечены из базы данных GenBank и сравнены между собой. Показано, что в выборке присутствуют две группы генов, нуклеотидные последовательности которых высокогомологичны между собой. Первая группа включает гены четырех гипотетических белков дли ной 143-144 аминокислотных остатка бактерий ро дов Escherichia (ACT43858 и AKN48098), Cronobacter (CCJ93299) и Klebsiella (KEG36084), в скобках ука заны идентификационные номера в базе данных GenBank. Сравнение этих генов между собой показа ло, что степень их идентичности составляет 93-99%. Вторая группа представлена генами энтеробакте рий, кодирующими белки из 290 аминокислотных остатков, N-концевая часть которых гомологична белку BisI (номера белков в GenBank: KFC97828, WP_000794335, WP_000794336, WP_000794337, WP_001655794, WP_004952390, WP_008806407, WP_021557167, WP_025912430, WP_032653240, WP_032671961 и WP_033070923). Степень идентич ности нуклеотидных последовательностей в данной группе составляет 83-99%. На рис. 1 приведено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей четырех вы сокогомологичных белков энтеробактерий из первой группы с последовательностью BisI. Также приведе на последовательность обнаруженной путем ПЦР скрининга эндонуклеазы ElmI (см. описание ниже). Множественное выравнивание соответствующих генов энтеробактерий первой группы, приведенное на рис. 2, показало высокую степень идентичности и на уровне нуклеотидного состава, несмотря на при надлежность хозяев к разным родам. В это вырав нивание добавлена также поcледовательность гена elmI, полученная в ходе дальнейшей работы. Высокий уровень идентичности последователь ностей генов из двух вышеупомянутых групп, ко торый распространяется и на их концевые участки, позволил подобрать праймеры для ПЦР-скрининга аналогичных генов в штаммах дикого типа. Для по иска генов, кодирующих белки, родственные белкам представителей первой группы, использовали прай меры, содержащие сайты узнавания эндонуклеаз ре стрикции FauNDI и BamHI, для встраивания ПЦР фрагментов в плазмидный вектор: Esp-1 5’-CCCCCATATGAGTGCACGTGAAGCATATC- 3’ Esp-2 5’-CGCGGATCCTTAGGGATTACACTGACTGAAACTCTTC- 3’. Для ПЦР-скрининга генов, аналогичных генам второй группы, были синтезированы праймеры: Esp-3 - 5’-TTGAAAAATAATCATTTAACATCATATG- 3’ Esp-4 - 5’-TCACTCCAGAACGCTGATAAGTTT-3’. Из 64 штаммов колиформных бактерий, обнару женных в сточных водах, была выделена геномная ДНК, которая служила матрицей для проведения ПЦР. Стоит отметить, что амплификация с исполь зованием праймеров Esp-3 и Esp-4 (вторая группа генов) не привела к появлению фрагмента ожидае мой длины (~870 п.н.) ни с одной из матричных ДНК. При использовании пары праймеров Esp-1 и Esp-2 (первая группа генов) положительный результат получен для одного из образцов ДНК - обнаружен ПЦР-фрагмент ожидаемой длины ~430 п.н. Этот амплифицированный фрагмент был обра ботан рестриктазами FauNDI и BamHI и лигирован в вектор pMTL22, предварительно расщепленный FauNDI и BglII. Полученной плазмидой, названной pElmI, трансформировали клетки E. coli ER2267. Определение таксономической специфичности ис ходного штамма, с геномной ДНК которого получен амплифицированный фрагмент, проведено с исполь зованием традиционных биохимических и морфо логических критериев [8], а также с помощью ана лиза структуры фрагмента 16S рРНК по программе BLAST [9]. Исходный природный штамм-продуцент обозначен как E. coli LM N17. Продуцируемая этим штаммом сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза названа ElmI. Проведено секвенирование встроенного в плаз миду pElmI ПЦР-фрагмента. Нуклеотидная после довательность этого фрагмента длиной 432 п.н. де понирована в базу данных GenBank под номером LN869919. Последовательность начинается со стар тового кодона ATG и заканчивается стоп-кодоном TAA (причем в гипотетической рамке трансляции отсутствуют другие стоп-кодоны), поэтому может рассматриваться как гипотетическая рамка транс ляции ДНК-эндонуклеазы ElmI, а ген, кодирующий этот белок, - elmI. Согласно результатам сравнительного анализа секвенированного фрагмента ген elmI имеет практи чески такую же последовательность, как и гены, ко дирующие полипептиды из ближайших гомологов - штаммов E. coli BL21(DE3) (ACT43858) и С41(DE3) (AKN48098). Единственная найденная замена - цито зин в положении 131 в гене elmI вместо тимина в го мологичных генах (рис. 2). Выведенная аминокислотная последователь ность эндонуклеазы ElmI соответственно отли чается от ближайших гомологов из штаммов E. coli BL21(DE3) и С41(DE3) одним аминокислотным остатком: в позиции 44 у ElmI находится серин, тог да как у ближайших гомологов (E. coli BL21(DE3) и С41(DE3)) в аналогичной позиции стоит лейцин (рис. 1). В то же время сходство аминокислотной по следовательности ElmI и BisI составляет около 50% при том, что количество идентичных аминокислот всего 112%. Таким образом, клонированный фраг мент ДНК, выявленный в результате ПЦР-скрининга и представленный предполагаемым геном метилза висимой ДНК-эндонуклеазы ElmI, оказывается вы сокогомологичным участкам геномных ДНК из хоро шо известных штаммов E. coli. Определение специфичности новой MD-эндонуклеазы ElmI В лизате клонов E. coli ER2267, несущих плазмиду pElmI, в отличие от исходного штамма, обнаружена эндонуклеазная активность, и один из клонов E. coli pElmI был выбран для наработки биомассы и выде ления фермента. По схеме, описанной в разделе «Эксперименталь ная часть», наработано 8 г биомассы E. coli pElmI. В результате хроматографической очистки из дан ной биомассы получено 3 мл препарата фермента ElmI с концентрацией 4 ед. акт./мкл. С целью определения сайт-специфичности ElmI различные субстратные ДНК расщепили в предвари тельно установленных оптимальных условиях: 37°C, реакционный SE-буфер «W», 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0.5 мкг субстратной ДНК, в тече ние 2 ч. ДНК расщепляли контрольным ферментом BisI в тех же условиях, но с использованием реакци онного SE-буфера «Y». В качестве субстрата для определения специфич ности фермента ElmI использовали ДНК плазмид, со держащих гены различных ДНК-метилтрансфераз. Благодаря активности этих генов в штаммах E. coli, из которых выделены плазмиды, ДНК-субстраты оказывались модифицированными соответствующи ми ДНК-метилтрансферазами и несли определенный узор метилирования. В качестве метилированных ДНК-субстратов ис пользовали следующие плазмиды: 1) pMHpaII, содержащая ген, кодирующий ДНК метилтрансферазу HpaII, вследствие чего в данной плазмиде метилирован первый цитозин во всех после довательностях 5’-CCGG-3’ на обеих цепях ДНК [10]; 2) pMHaeIII, содержащая ген, кодирующий ДНК метилтрансферазу HaeIII, вследствие чего в данной плазмиде метилирован первый цитозин во всех по следовательностях 5’-GGCC-3’ на обеих цепях ДНК [11]; 3) pHspAI2, содержащая ген, кодирующий ДНК метилтрансферазу HspAI, вследствие чего в плаз миде метилирован первый цитозин во всех последо вательностях 5’-GCGC-3’ на обеих цепях ДНК [12]. Кроме того, данная плазмида содержит гипермети лированный участок: 5’-G(5mC)G(5mC)G(5mC)GC-3’ 3’-CG(5mC)G(5mC)G(5mC)G-5’; 4) pHspAI4, также содержащая ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу HspAI, вследствие чего в плазмиде метилирован первый цитозин во всех по следовательностях 5’-GCGC-3’ на обеих цепях ДНК [12]. Кроме того, данная плазмида содержит гиперме тилированный участок: 5’-G(5mC)G C AG(5mC)G C-3’ 3’-С G(5mC)GTC G(5mC)G-5’; 5) pFsp4HI3, содержащая ген, кодирующий ДНК метилтрансферазу Fsp4HI, в результате чего в плаз миде во всех последовательностях 5’-GCNGC-3’ метилирован первый цитозин [4]. Данная плазмида содержит гиперметилированный участок: 5’-G(5mC)C G(5mC)G G(5mC)A G C-3’ 3’-C G G(5mC) G C(5mC)G T(5mC)G-5’. Все плазмиды были предварительно переведены из кольцевой формы в линейную путем гидролиза эндонуклеазой рестрикции DriI по уникальному (для каждой плазмиды) сайту 5’-GACNNNNNGTC-3’. Результаты анализа сайт-специфичности на дан ных ДНК-субстратах приведены на рис. 3. Как видно из рис. 3, ElmI не расщепля ет последовательности, метилированные ДНК метилтрансферазами HpaII (дорожка 2), HspAI2 (дорожка 4) и HaeIII (дорожка 6), т.е. последователь ности 5’-C(5mC)GG-3’/3’-GG(5mC)C-5’, 5’-G(5mC)GC- 3’/3’-CG(5mC)G-5’ и 5’-GG(5mC)C-3’/3’- C(5mC)GG- 5’ соответственно не являются сайтами узнавания ElmI. Из рис. 3 видно, что ElmI расщепляет ДНК pFsp4HI3/DriI (дорожка 9), образуя фрагменты ДНК такой же длины, как и после обработки этого же суб страта BisI (дорожка 10). Поскольку в этой плазмиде С5-метилированы все первые цитозины в последова тельностях 5’-GCNGC-3’ [4], и все они расщепляются MD-эндонуклеазой BisI, то данный факт свидетель ствует о том, что ElmI узнает и расщепляет эти же метилированные сайты. Важно также, что ElmI рас щепляет плазмиду pHspAI4 cо значительно мень шей эффективностью, образуя два слабых фраг мента (дорожка 12). Это является следствием того, что указанный выше гиперметилированный участок плазмиды pHspAI4 включает уникальную последо вательность 5’-GCNGC-3’, у которой метилированы уже не внутренние (первые) цитозины на обеих це пях, как в плазмиде pFsp4HI3, а внешние (вторые). Полученные данные означают, что ElmI узнает и расщепляет метилированную последовательность 5’-GCNGC-3’, содержащую два остатка 5-метилци тозина, причем на порядок более эффективно, если метилированы два внутренних остатка цитозина на обеих цепях, чем при метилировании только двух внешних цитозинов. Для того чтобы узнать, насколько эффективно ElmI расщепляет последовательности 5’-GCNGC-3’ с большим количеством остатков 5-метилцитозина, pFsp4HI3/DriI обрабатывали ElmI в количестве, не достаточном для полного гидролиза, и сравнивали с картиной расщепления препаратом эндонуклеазы BisI (рис. 4). Плазмида pFsp4HI3 содержит две по следовательности 5’-GCNGCNGC-3’ и одну 5’-GCNGCNGCNGC-3’, в которые входят два и три соответственно пересекающихся сайта узнавания метилазы Fsp4HI. В результате метилирования этих последовательностей метилазой Fsp4HL образуются последовательности 5’-GCNGC-3’ с тремя 5-метил цитозинами, в случае 5’-GCNGCNGCNGC-3’ цен тральный сайт 5’-GCNGC-3’ будет содержать уже четыре таких остатка. Анализ нуклеотидной после довательности плазмиды pFsp4HI3, проведенный с помощью программы Vector NTI Suite 7, показы вает, что при расщеплении pFsp4HI3/DriI только по этим последовательностям, а также по сайту уз навания эндонуклеазы DriI, используемой для лине аризации плазмиды, должны образоваться фрагмен ты длиной ~3000, ~490 (двойной фрагмент) и ~340 п.н. Как видно из рис. 4, эти фрагменты хорошо визуали зируются при использовании 2-6 разведений ElmI (дорожки 2-5). Даже в последнем (дорожка 8) раз ведении фермента хорошо визуализируется фраг мент длиной ~1300 п.н., который должен образоваться при расщеплении уникальной гиперметилированной последовательности 5’-GCNGCNGCNGC-3’, содер жащей в том числе сайт 5’-GCNGC-3’ с четырьмя остатками 5-метилцитозина. В случае же BisI эти фрагменты визуализируются намного хуже. Несмотря на то что во 2-4 разведени ях гидролиз плазмиды pFsp4HI3/DriI намного глуб же по сравнению с ElmI, в последнем (восьмом) раз ведении BisI мы уже практически не видим фрагмент длиной ~1300 п.н. (дорожка 17). Полученные данные говорят о том, что, в отличие от BisI, новая MD-эндонуклеаза ElmI расщепляет варианты последовательности 5’-GCNGC-3’ c тремя или четырьмя 5-метилцитозинами на порядок луч ше, чем в случае, когда таких метилированных остат ков только два. Поэтому даже при использовании 1/16 ед. акт. препарата ElmI (дорожка 5) исходная ДНК полностью отсутствует благодаря более эффек тивному расщеплению 5’-GCNGC-3’ с тремя или че тырьмя остатками 5-метилцитозина. Напротив, BisI расщепляет такие гиперметилированные варианты менее эффективно, поэтому при использовании 1/16 ед. акт. препарата исходный фрагмент ДНК уже ви зуализируется (дорожка 14). Определение позиции гидролиза ДНК в сайте узнавания ElmI Места гидролиза ДНК ElmI определяли, сравнивая длины фрагментов, образуемых при расщеплении MD-эндонуклеазами ElmI, PkrI и GluI (последняя также узнает метилированную последовательность 5’-GCNGC-3’ [4] и расщепляет ее подобно BisI перед центральным нуклеотидом) олигонуклеотидного ду плекса D1/D2, образованного из олигонуклеотидов D1 и D2 (предполагаемая узнаваемая ElmI последо вательность подчеркнута): D1: 5’-GAGTTTAG(5mC)GG(m5C)TATCGATCC-3’ D2 : 5’-GGATCGATAG ( 5 m C ) C G ( m 5 ) CTAAACTC- 3’. На рис. 5 приведен радиоавтограф электрофоре граммы продуктов расщепления радиоактивно ме ченного дуплекса D1*/D2 в 20% полиакриламидном геле с 7 М мочевиной. Как видно из рис. 5, фрагменты, образованные в результате гидролиза ферментами PkrI и ElmI (до рожки 2 и 3 соответственно) дуплекса D1*/D2, имеют разную электрофоретическую подвижность, что сви детельствует о том, что эти ферменты имеют разные позиции гидролиза относительно сайта узнавания. В то же время электрофоретическая подвижность фрагментов ДНК, образованных при гидролизе ElmI и GluI, одинакова (дорожки 3 и 4 соответственно). Таким образом, ElmI и GluI имеют одинаковую ги дролизуемую позицию относительно узнаваемой последовательности 5’-GCNGC-3’. Так как GluI рас щепляет последовательность 5’-GC^NGC-3’ перед центральным нуклеотидом «N» [4], то и ElmI также расщепляет ее перед центральным нуклеотидом. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, впервые обнаруженная в энтеробак терии рекомбинантная MD-эндонуклеаза ElmI узна ет нуклеотидную последовательность 5’-GC^NGC-3’ и расщепляет обе цепи ДНК перед центральным нуклеотидом «N» с образованием 5’-выступающих однонуклеотидных концов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что геномы энтеробактерий содержат гены MD эндонуклеаз, аминокислотные последовательности которых имеют умеренную гомологию с BisI, причем лишь примерно половина аминокислотных остат ков может рассматриваться как близких по физи ко-химическим свойствам. Тем не менее, несмотря на умеренную гомологию первичной структуры, сай ты узнавания и позиции гидролиза ферментами BisI и ElmI в значительной мере схожи. Стоит отметить, что с использованием пары прай меров Esp-1 и Esp-2 можно амплифицировать вы сокогомологичный гену elmI фрагмент ДНК ~430 п.н. из лабораторного штамма E. coli BL21(DE3) (ACT43858). Согласно базе данных GenBank этот фрагмент представляет собой рамку трансляции, ко торая кодирует полипептид с неизвестной функцией: Enterobact1 - WP_001276099.1 hypothetical protein [Escherichia coli] >ref|YP_003035796.1| hypothetical protein ECBD_1551 [Escherichia coli ‘BL21]. Однако, по нашим данным, эта рамка считывания представ ляет собой ген, кодирующий метилзависимую ДНК эндонуклеазу. Мы обозначили ген, соответствующий этой рамке, как ecoBLI, а кодируемый им белок - EcoBLI. Его свойствам будет посвящена отдельная публикация. Сайт-специфическая эндонуклеаза ElmI может быть использована в эпигенетических исследова ниях, молекулярной биологии и генной инженерии для сайт-специфического расщепления метили рованной ДНК, в том числе и для анализа статуса метилирования геномной ДНК растений [13], CNG метилирование у которых считается эпигенетически важным.

Об авторах

В. A. Чернухин

ООО «СибЭнзайм»

Автор, ответственный за переписку.
Email: valera@sibenzyme.ru
Россия

Д. A. Гончар

ООО «СибЭнзайм»

Email: valera@sibenzyme.ru
Россия

M. A. Абдурашитов

ООО «СибЭнзайм»

Email: valera@sibenzyme.ru
Россия

O. A. Беличенко

ООО «СибЭнзайм»

Email: valera@sibenzyme.ru
Россия

В. С. Дедков

ООО «СибЭнзайм»

Email: valera@sibenzyme.ru
Россия

Н. A. Михненкова

ООО «СибЭнзайм»

Email: valera@sibenzyme.ru
Россия

E. Н. Ломаковская

ООО «СибЭнзайм»

Email: valera@sibenzyme.ru
Россия

С. Г. Удальева

ООО «СибЭнзайм»

Email: valera@sibenzyme.ru
Россия

С. Х. Дегтярёв

ООО «СибЭнзайм»

Email: valera@sibenzyme.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы