Модификаторы дипольного потенциала липидных бислоев

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Одна из актуальных задач современной молекуляр ной фармакологии - поиск веществ, способных вли ять на величину дипольного потенциала мембраны (φd), а следовательно, регулировать процессы транс порта через плазматическую мембрану как в нор ме, так и при патологии. Этот скачок потенциала на границе раздела фаз бислой-раствор возникает в результате определенной взаимной ориентации диполей мембранных липидов и адсорбированной на поверхности бислоя воды [1-4]. Дипольный по тенциал мембраны зависит от ее липидного состава. Существенную роль играют степень ненасыщенно сти, длина и число углеводородных цепей в молеку ле фосфолипидов [5-7]. Чаще всего дипольными мо дификаторами являются амфифильные вещества, молекулы которых имеют значительный дипольный момент и характеризуются специфической ориен тацией на границе раздела фаз. Опубликованы све дения об успешном использовании дипольных моди фикаторов в качестве инструментов для изучения молекулярных механизмов формирования и функ ционирования ионных каналов, образованных раз личными токсинами и антимикробными агентами [8-25]. Установлено, что дипольмодифицирующие свойства проявляют некоторые флавоноиды, стеро иды, тиреоидные гормоны, ксантеновые и стирилпи ридиновые красители [1-3, 26-30]. Флавоноиды являются наиболее распространен ными фенольными соединениями растительного происхождения. Это производные бензо-гамма-пи рона, в основе структуры которых лежит скелет из двух бензольных колец (А и В), соединенных между собой трехуглеродным фрагментом (С2-С3-С4). Классификация флавоноидов основана на степени окисленности пирана (2-фенилхромана, или кольца С). Выделяют следующие группы: халконы, фла воны, флавонолы, флаваноны, флаванонолы, изо флавоноиды и др. До недавнего времени считалось, что на величину дипольного потенциала мембран способны влиять только халконы, флоретин и его гликозид флорицин [1, 3, 31]. Миорелаксанты используют для снижения тону са скелетной мускулатуры, в том числе для полного обездвиживания. Аммониевые стероиды (векуроний, панкуроний и рокуроний) относятся к недеполяризи рующим релаксантам. В основе структуры миорелак сантов находится стероидное ядро. Опубликованы сведения о влиянии на φd некоторых стероидов. Так, показано [32], что введение в мембранообразую щий раствор димиристоилфосфохолина холестери на, 6-кетохолестанола или копрастанола приводит к увеличению дипольного потенциала мембраны. Экстракция из липидного бислоя 5α-андростан-3β ола приводит к увеличению мембранной проводи мости, индуцированной К+-нонактином [20]. Этот результат указывает на то, что 5α-андростан- 3β-ол увеличивает дипольный потенциал бислоя. Установлено [33], что стероидный гормон прегнено лон уменьшает величину дипольного потенциала ли посом, сформированных из смеси дипальмитоилфос фатидилхолина и холестерина. Тиреоидные гормоны, тироксин и трииодтиронин, играют ключевую роль в регуляции метаболизма. Они представляют собой иодированные производные тирозина и отличаются друг от друга числом атомов йода и их локализацией. Показано также, что йодсо держащие гормоны щитовидной железы, как и фла воноид флоретин, уменьшают дипольный потенциал холестеринсодержащих липидных бислоев [27]. Ксантеновые красители представлены двумя группами: флуоресцеины и родамины. Первую груп пу образуют сам флуоресцеин и его галогенопро изводные (эритрозин, эозин, бенгальский розовый и флоксин В). Ксантеновые красители группы рода мина представляют вторую группу, они являются производными флуоресцеина, в которых обе гидрок сильные группы заменены алкилированными ами ногруппами. Показано, что адсорбция бенгальского розового на поверхности дифитаноилфосфатидил холиновой мембраны приводит, как и действие фло ретина, к уменьшению ее дипольного потенциала [29]. Стирилпиридиновые красители серии ANEPPS и RH относятся к потенциал-чувствительным флуо рохромам на основе стирилгемицианинов. Они разли чаются длиной углеводородных хвостов и(или) поли енового фрагмента. Эти флуоресцентные красители имеют высокий дипольный момент, образованный делокализованным положительным зарядом в пири диновом комплексе и отрицательным зарядом суль фогруппы на другом конце молекулы. RH-красители увеличивают φd фосфохолиновых мембран, и эта спо собность падает в ряду RH 421, RH 237 и RH 160 [28]. Цель представленной работы состояла в установ лении и количественном определении влияния не которых флавоноидов, миорелаксантов, тиреоидных гормонов и флуоресцентных красителей на диполь ный потенциал липидных бислоев различного со става. Особое внимание уделено взаимосвязи между химической структурой модификаторов и выражен ностью дипольмодифицирующих свойств соедине ний. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы В работе использовали следующие реактивы: KCl, HEPES, пентан, этанол, хлороформ, диметилсуль фоксид (ДМСО), гексадекан и сквален (Sigma, США); флоретин, флорицин, рутин, генистин, ге нистеин, кверцетин, мирицетин, биоханин А, (±) ги драт катехина, (±) гидрат таксифолина, даидзеин, 2′,4′,6′-моногидрат тригидроксиацетофенона (ТГАФ), 2′-гидрокси-4′,6′-диметооксиацетофенон (ДГАФ), RH 421, di-8-ANEPPS, L-тироксин, 3,3′,5′-трииодо-L тиронин, бенгальский розовый, флоксин В, эритро зин, эозин Y, флуоресцеин, родамин 6G, родамин 101, бромиды панкурония, векурония и рокурония (Sigma, США); RH 160 и RH 237 (Molecular Probes, США); 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДФФХ), 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДОФХ), 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфосерин (ДОФС), 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ) (Avanti Polar Lipids, США). Химические структуры использованных модификаторов пред ставлены в табл. 1. Измерение изменения величины дипольного потенциала липидных бислоев Бислойные липидные мембраны формировали по методу Монтала и Мюллера [34] путем сведения конденсированных липидных монослоев на отвер стии в тефлоной пленке, разделяющей эксперимен тальную камеру на два (цис- и транс-) отделения. Объем каждого отделения составлял 1.5 мл, толщина тефлоновой пленки - 10 мкм, диаметр отверстия - около 50 мкм. Перед началом процесса формирова ния мембраны отверстие в тефлоновой пленке об рабатывали гексадеканом. Монослои формировали на границе вода-воздух из раствора 1 или 2 мг/мл липида в пентане. Для образования монослоев ис пользовали ДФФХ, ДОФХ, ДОФС и ДОФЭ, а также эквимолярную смесь ДОФС и ДОФЭ (ДОФС/ДОФЭ). Эксперименты проводили при одинаковом ионном составе водных растворов электролита в обоих от делениях камеры (0.1 M KCl), кислотность раство ров (рН 7.4) поддерживали буферной смесью 5 мМ HEPES-KOH. Ионофоры, нонактин или валиномицин из спирто вого (7 мкг/мл) или метанолового (0.8 мг/мл) раствора соответственно добавляли к водной фазе обоих отде лений камеры до конечной концентрации 10-7-10-5 М. Известно, что флоретин в фосфолипидных мембра нах менее эффективен в отношении трансмембран ного тока, индуцированного K+-валиномицином, чем K+-нонактином [1]. Аналогичные результаты получе ны в ходе предварительных экспериментов с другими флавоноидами, а также миорелаксантами, ксан теновыми красителями и тиреоидными гормонами. По этой причине изменения дипольного потенциала мембраны при введении указанных модификаторов измеряли с использованием нонактина. Установлено, что стирилпиридиновые красители в ДФФХ-бислоях менее эффективны в отношении трансмембранно го тока, индуцированного K+-нонактином, чем K+ валиномицином, поэтому в экспериментах по измере нию увеличения дипольного потенциала мембраны, вызванного адсорбцией этих красителей, применяли валиномицин. Модификаторы вводили в оба отделения каме ры из миллимолярных растворов в этаноле, ДМСО или воде до конечной концентрации в околомем бранных растворах в диапазоне от 2.5 до 150 мкМ для флавоноидов, от 1 мкМ до 1 мМ для миорелак сантов, от 0.25 до 10 мкМ для ксантеновых краси телей, от 1 до 50 мкМ для тиреоидных гормонов щитовидной железы и от 1 до 10 мкМ для стирилпи ридиновых красителей. Конечная концентрация растворителя (этанол, метанол или ДМСО) в камере не превышала 0.1%. Указанные растворители в такой концентрации не нарушали целостности и стабильности липидных бислоев. В отсутствие ионофоров дипольные моди фикаторы в максимальных концентрациях также не влияли на проводимость модельных мембран. Измерения и оцифровку трансмембранных то ков проводили в режиме фиксации потенциала с помощью Axopatch 200B и Digidata 1440A (Axon Instruments, США). Для подачи трансмембранного потенциала (V) и отведения сигнала с мембраны ис пользовали хлорсеребряные электроды (Ag/AgCl), соединенные с растворами камеры через мостики с 1.5% агарозой в растворе 2 М KCl. Измерения про водили при комнатной температуре. Данные обрабатывали с использованием 8-по лярного фильтра Бесселя (Model 9002, Frequency Devices) и частоты фильтрации 1 кГц. Записи транс мембранных токов обрабатывали с использованием программного пакета Clampfit 9.0 (Axon Instruments, США). Статистический анализ данных проводили при помощи программы Origin 8.0 (OriginLab, США). Проводимость мембраны (G) определяли как от ношение равновесного тока, протекающего через бислойную липидную мембрану (I), к трансмембран ному потенциалу (V), равному 50 мВ. Изменение ди польного потенциала (Δφd) при введении модифи каторов определяли с использованием статистики Больцмана: m и Gm - значения равновесной К+-проводимости бислоя, обусловленной ионофором, до и после введения модификатора; e - заряд электрона; k - по стоянная Больцмана (1.38 × 10-23 Дж/К), T - термо динамическая температура (Т = 294 К) [1]. Средние величины изменения дипольного потен циала мембран определяли как средние арифмети ческие значения Δφd в каждой из эксперименталь ных систем при измерении от трех до пяти бислоев (среднее ± SD). Адсорбцию флавоноидов, миорелаксантов, тире оидных гормонов и ксантеновых красителей на по верхности липидных бислоев описывали с использо ванием изотермы Ленгмюра: где (C) d Δφ - изменение дипольного потенциала мем бран при концентрации (С) модификатора в омыва ющем растворе, ( ) d Δφ ∞ - максимальное изменение дипольного потенциала мембран при С → ∞, К - кон станта десорбции модификатора, характеризую щая его сродство к липидной фазе [3, 26]. Величину ( ) d Δφ ∞ определяли по графику зависимости (C) d Δφ как среднюю величину, соответствующую насыще нию: неизменности дипольного потенциала мембран при дальнейшем увеличении концентрации моди фикатора. Величину К находили как тангенс угла наклона прямой, аппроксимирующей зависимость Погрешность ( ) d Δφ ∞ определяли как максималь ную экспериментальную погрешность при измере нии (C) d Δφ , а погрешность определения параметра К рассчитывали как погрешность частного В пределах измеряемых концентраций стирилпи ридиновых красителей (до 10 мкМ) эффекта на сыщения не наблюдается. Дальнейшее увеличение концентрации красителя приводит к разрушению липидного бислоя. По указанным причинам для опи сания адсорбции на бислое стирилпиридиновых красителей применяли выражение, являющееся ре зультатом линеаризации уравнения (2) при малых концентрациях дипольного модификатора (С << К): коэффициент наклона прямой зависимости увеличе ния дипольного потенциала бислоев от концентрации красителя в омывающем растворе [28]. Для сравнения эффективности дипольмодифици рующего действия различных модификаторов ис пользовали относительную величину изменения ди польного потенциала (γ), которую рассчитывали как: где φd_nm - величина дипольного потенциала немо дифицированной мембраны, определяемая по лите ратурным данным. В отсутствие дипольных моди фикаторов дипольный потенциал ДФФХ-, ДОФХ-, ДОФС- и ДОФЭ-мембран считали равным 250 ± 40 [5, 35, 36], 225 ± 20 [5], 240 ± 20 мВ [37, 38] и 220 ± 5 мВ [5, 35, 36] соответственно. Для ДОФС/ДОФЭ-бислоев φd_nm рассчитывали как среднее величин φd_nm ДОФС и ДОФЭ-мембран. Погрешность определения γ рас считывали как погрешность частного В случае стирилпиридиновых красителей величину γ определяли как отношение изменения дипольного потенциала бислоя при 5 мкМ концентрации моди фикатора к φd_nm. Считали, что агенты, обладающие «слабыми» дипольмодифицирующими свойства ми, характеризуются величиной γ в диапазоне от 0 до 10%, «средними» - от 10 до 30%, «сильными» - от 30 до 60%. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Флавоноиды Известно, что адсорбция флоретина на мембране в первом приближении может быть описана изотер мой адсорбции Ленгмюра (1) с характеристическими параметрами: максимальное изменение дипольного потенциала при насыщении (Δφd(∞)) и константа де сорбции флавоноида (K) [3, 39]. В табл. 1 представ лены величины γ (4), характеризующие относитель ные изменения дипольного потенциала мембраны при введении различных модификаторов. Как видно из табл. 1, все флавоноиды уменьшают дипольный потенциал мембраны. По выраженности дипольмо дифицирующих свойств проверяемые агенты можно условно разделить на три группы. К первой группе относятся модификаторы «малой» эффективности с величиной γ в диапазоне от 0 до 10%. Это изофлаво ны даидзеин и генистин, флаванол катехин, флава нонол таксифолин и синтетический флорглюцинол ТГАФ. Во вторую группу входят соединения, обла дающие более выраженными дипольмодифицирую щими свойствами, так называемой «средней» эффек тивности (γ от 10 до 30%): флавонол рутин, изофлавон генистеин и флорглюцинол ДГАФ. К третьей группе относятся самые «сильные» среди флавоноидов ди польные модификаторы, у которых величина γ ва рьирует от 30 до 60%. Это халконы флоретин и фло рицин, флавонолы кверцетин и мирицетин, а также изофлавон биоханин А. Сравнивая химические структуры флавоноидов, приведенные в табл. 1, можно сделать заключение, что дипольмодифицирующие свойства модифика тора связаны с наличием двойной связи в С-кольце молекулы флавоноида. В С-кольцах таксифолина или катехина отсутствует двойная связь, представ ленная у кверцетина, это приводит к тому, что фла ванол и флаванонол, имеющие изогнутую форму, практически не влияют на величину φd, в то время как адсорбция плоского флавонола на мембране вы зывает значительное падение ее дипольного потенци ала. Анализируя табл. 1, также можно заметить, что, как правило, величина γ тем больше, чем меньше чис ло гидроксильных групп в молекуле флавоноида. Так, уменьшение φd при адсорбции флорицина, гликозида флоретина, меньше, чем в случае более гидрофобного агликона флоретина. Аналогичная ситуация наблю дается и для ряда флавонолов (кверцетин/мирицетин и рутин), изофлавонов (биоханин А, генистеин и гени стин) и флорглюцинолов (ДГАФ и ТГАФ). В отличие от биоханина А, изофлавон даидзеин, несмотря на ма лое число гидроксильных групп, практически не вли яет на величину дипольного потенциала ДФФХ мембран. Поскольку константа десорбции даидзеина выше, чем биоханина А, можно предположить мень шее сродство первого к липидной фазе по сравнению со вторым. Еще одной возможной причиной наблюда емых различий может быть разная ориентация да идзеина и биоханина А в мембране, обусловленная тем, что в молекуле даидзеина две гидроксильные группы расположены на противоположных концах молекулы, а в биоханине А - на одном. Следует также отметить, что константы десорбции гликозидов (фло рицина, рутина и генистина) превышают этот пара метр для соответствующих им агликонов (флоретина, кверцетина и генистеина). По всей вероятности, этот факт, как и меньшие изменения φd в присутствии гли козидов по сравнению с агликонами, обусловлен боль шей гидрофильностью гликозидов, а следовательно, их меньшим сродством к липидной фазе. Среди про веренных флавоноидов наибольшими константами десорбции обладают флорглюцинолы, ТГАФ и ДГАФ. Последнее наблюдение хорошо согласуется с резуль татами [40], которые показали, что коэффициент рас пределения ТГАФ между лецитином и водой в 8 раз меньше, чем у флоретина. В табл. 2 представлены характеристические па раметры изотермы адсорбции на липидных бисло ях различного состава самого «сильного» из фла воноидов модификатора - флоретина. Как видно из табл. 2, способность флоретина уменьшать φd зависит от вида мембранообразующего липида. ДОФЭ в результате ненасыщенности и ДФФХ бла годаря разветвленности углеводородных цепей имеют тенденцию к образованию неламеллярных структур, поэтому в образованных ими бислоях возникает эластическое напряжение вследствие деформации монослоев, характеризующихся от рицательной спонтанной кривизной. Это напря жение может быть обнаружено при исследова нии профиля латерального давления в бислое [41, 42]. ДОФХ формирует ламеллярные структуры, и включающие его монослои спонтанной кривиз ны практически не имеют. Максимальное умень шение дипольного потенциала при адсорбции флоретина практически одинаково для ДОФХ-, ДОФЭ- и ДФФХ-мембран (табл. 1 и 2). Эти ре зультаты указывают на то, что плоскость ад сорбции модификатора в мембране не совпадает с областью скачка латерального давления в ДОФЭ и ДФФХ-бислоях. При этом флоретин приблизи тельно в 1.5 раза менее эффективен в отношении бислоев, включающих отрицательно заряженный фосфолипид ДОФС (ДОФС или ДОФС/ДОФЭ) по сравнению с мембранами, сформированными из незаряженных фосфолипидов (ДФФХ, ДОФХ или ДОФЭ). Аналогичный результат получен [43] при изучении адсорбции флоретина на нейтраль ных и отрицательно заряженных монослоях из ди миристоилфосфатидилхолина и димиристоил фосфатидилглицерина соответственно. Учитывая, что за уменьшение дипольного потенциала ответ ственна незаряженная форма флоретина [1], на блюдаемые различия не могут определяться сни жением сорбции заряженной формы модификатора на ДОФС-содержащих мембранах. Об этом свиде тельствует и близость значений констант десорб ции флоретина для незаряженных ДФФХ, ДОФХ и ДОФЭ и заряженных ДОФС-мембран (табл. 1 и 2). Это позволяет утверждать, что коэффици ент распределения модификатора практически не зависит от фосфолипидного состава мембраны. Подобный эффект может быть следствием положи тельной спонтанной кривизны монослоев из ДОФС, возникающей из-за «расталкивания» одноименно заряженных липидных голов. В результате, сор бирующиеся в этой области молекулы флоретина могут приобретать ориентацию, отличную от не заряженных мембран, и/или иметь большее число возможных конформаций. Миорелаксанты Как видно из табл. 1, добавка бромидов панкуро ния, векурония и рокурония в растворы, омывающие ДФФХ-мембраны, практически не влияет на их ди польный потенциал (величина γ составляет не более 2%). Можно заключить, что все исследуемые миоре лаксанты обладают слабыми дипольмодифицирую щими свойствами. Учитывая, что имеющий только одну гидроксильную группу насыщенный стероид 5α-андростан-3β-ол увеличивает дипольный потен циал липидных бислоев [20], можно предположить, что отсутствие влияния стероидных миорелаксантов на φd связано с модификациями, увеличивающими ги дрофильность стероидной молекулы (присоединение ацетатных групп и азотсодержащих гетероциклов). Высокая гидрофильность и наличие функциональ ных групп на разных концах молекул панкурония, векурония и рокурония позволяют думать, что сор бированные на поверхности мембраны миорелаксан ты практически не погружаются в бислой. О малой глубине погружения косвенно свидетельствует и от сутствие влияния бромида панкурония на дипольный потенциал ДОФХ-мембран (величина γ равна 3 ± 1), которые, в отличие от ДФФХ-бислоев, не испытыва ют скачка латерального давления в углеводородной области. При этом малые величины констант десорб ции миорелаксантов (табл. 1) указывают на высокий коэффициент распределения этих соединений между бислоем и водным раствором. Поверхностный заряд мембраны существенным образом сказывается на адсорбции стероидных мио релаксантов. Бромиды панкурония и векурония уве личивают дипольный потенциал отрицательно за ряженных ДОФС/ДОФЭ-мембран (величина γ равна 17 ± 3%), при этом более гидрофобный бромид року рония на величину φd ДОФС/ДОФЭ-бислоев практи чески не влияет (величина γ около 1%). Зависимость эффектов от заряда мембранообразующих липидов позволяет предположить, что за изменение диполь ного потенциала при введении панкурония и векуро ния ответственны положительно заряженные фор мы модификаторов. Однако в ДОФС/ДОФЭ-бислоях константа десорбции этих миорелаксантов на два порядка больше, а следовательно, сродство мень ше, чем в ДФФХ-мембранах, что свидетельствует об обратном. По всей вероятности, как и в случае флоретина, наблюдаемые различия обусловлены не электростатическим взаимодействием между модификаторами и ДОФС-содержащей мембраной, а положительной спонтанной кривизной монослоя. На этом основании можно думать, что в ДОФС/ДОФЭ-бислоях панкуроний и векуроний локализу ются вблизи расталкивающихся отрицательно за ряженных сериновых голов. Тиреоидные гормоны Сравнение величин γ тиреоидных гормонов показы вает, что тироксин и трииодтиронин - это диполь ные модификаторы «средней» эффективности, сход ным образом увеличивающие дипольный потенциал ДФФХ-мембран. Аналогичные результаты были по лучены ранее [27]. Этот факт позволяет предполо жить, что присутствие в молекуле тироксина допол нительного (по сравнению с трииодтиронином) атома йода слабо влияет на дипольный момент модифика тора и его ориентацию в бислое. На рисунке А показаны зависимости вели чин уменьшения дипольного потенциала ДФФХ-,ДОФХ-, ДОФС-, ДОФЭ- и ДОФС/ДОФЭ-бислоев от концентрации тироксина в омывающих растворах. В табл. 2 представлены величины γ, характеризующие относительные изменения дипольного потенци ала мембраны при адсорбции тироксина на липидных бислоях различного состава. Из рисунка А и табл. 2 видно, что эффективность тироксина мало зависит от заряда мембранообразующих липидов. Сходные результаты получены при сравнении ДФФХ- и ди фитаноилфосфосериновых бислоев [44]. Отсутствие зависимости эффектов модификатора (как вели чин γ, так и значений К) от поверхностного заряда мембраны указывает на то, что уменьшение ди польного потенциала мембран обусловлено сорбци ей незаряженной формы йодсодержащих гормонов щитовидной железы. В пользу этого свидетельству ют и данные [27]. Близость значений γ для ДФФХ-,ДОФХ-, ДОФЭ- и ДОФС-мембран дает основание утверждать, что спонтанная кривизна монослоев не сказывается на сорбции тироксина. Можно пред положить, что плоскость адсорбции модификатора располагается между областями, соответствующими скачку латерального давления в ДОФЭ- и ДФФХ мембранах и локализации заряженных остатков се рина в ДОФС-бислоях. Ксантеновые красители Из табл. 1 видно, что рассмотренные в работе ксан теновые красители уменьшают дипольный потенци ал ДФФХ-мембран. Оценка эффективности диполь модифицирующего действия красителей позволяет отнести бенгальский розовый и флоксин В к наиболее эффективным модификаторам; эритрозин - к соеди нениям со «средней» эффективностью; а флуоресце ин, эозин Y, родамин 6G и родамин 101 - с «малой» эффективностью. Сравнивая представленные в табл. 1 структу ры, можно заключить, что основными факторами, определяющими величину уменьшения дипольного потенциала мембран при введении этих модифика торов, являются тип и локализация галогеновых за местителей в молекуле красителя. Можно думать, что выраженное уменьшение величины дипольного потенциала мембран при введении эритрозина об условлено наличием в его молекуле атомов йода. Отсутствие последних во флуоресцеине или замена йода на бром в эозине У приводит к потере дипольмо дифицирующих свойств этих соединений. Сходным образом замена йода на бром во флоксине В снижает эффективность модификатора по сравнению с эф фективностью бенгальского розового. В этом случае выраженность дипольмодифицирующих свойств флоксина В следует отнести к присутствию в его структуре хлора. Присутствие как атомов йода, так и атомов хлора в молекуле бенгальского розового делает его самым эффективным дипольным моди фикатором среди изученных ксантеновых красите лей. Замена гидроксильной группы в молекуле флу оресцеина на аминогруппу в молекулах родаминов не влияет на способность модификаторов изменять величину дипольного потенциала бислоев. Ранее мы показали, что за уменьшение дипольного потенциала мембраны ответственна анионная форма ксантенового красителя [44]. Сравнивая величины K можно отметить, что ксан теновые красители характеризуются на порядок большим сродством к фосфолипидным мембранам, чем флавоноиды и тиреоидные гормоны (табл. 1). Стирилпиридиновые красители Согласно [28] величина увеличения дипольного по тенциала ДФФХ-мембран прямо пропорциональ на концентрации стирилпиридиновых красителей в омывающих растворах в диапазоне от 0 до 15 мкМ. В табл. 1 представлены величины γ, характеризую щие относительные изменения дипольного потенци ала мембраны при введении 5 мкМ красителя. Эти результаты позволяют построить ряд эффективно сти стирилпиридиновых красителей: di-8-ANEPPS не обладает дипольмодифицирующим действием, RH 160 и RH 237 характеризуются «средней», а RH 421 - наибольшей эффективностью в отношении ди польного потенциала ДФФХ-мембран. Полученные результаты согласуются с данными для красителей серии RH [28]. Способность увеличивать φd зависит от ориен тации и глубины погружения красителя в мембра ну. Согласно [45] глубина погружения в ДФФХ бислой возрастает в ряду RH 160 < RH 421 < RH 237. Минимальное среди тестируемых красителей по гружение RH 160 в мембрану, по всей вероятно сти, обусловлено его наименьшей гидрофобностью. Наибольшая эффективность RH 421 в отношении ДФФХ-мембран при промежуточной плоскости его адсорбции может быть связана с наиболее близкой ориентацией к нормали этого красителя в мембране [45]. RH 421 и di-8-ANEPPS должны характеризо ваться близким по величине дипольным моментом, поскольку имеют пиридиновые комплексы одина ковой длины. По этой причине отсутствие влияния di-8-ANEPPS на величину дипольного потенциала ДФФХ-мембран можно связать не со структурными различиями в пиридиновом комплексе, а с бóльшей длиной углеводородных «хвостов» по сравнению с RH 421, которые определяют погружение и ориен тацию красителя в бислое. На рисунке Б представлены зависимости величин увеличения дипольного потенциала ДФФХ-, ДОФХ-, ДОФЭ-, ДОФС- и ДОФС/ДОФЭ-бислоев от концен трации RH 421 в омывающих растворах. В табл. 2 показаны величины γ, характеризующие относи тельное увеличение дипольного потенциала мембра ны при введении 5 мкМ RH 421 в околомембранные растворы. Зависимость дипольмодифицирующе го действия RH 421 от вида мембранообразующего липида (ДФФХ, ДОФХ и ДОФС) может указывать на влияние профиля латерального давления на ори ентацию красителя в бислое. Кроме того, RH 421 мало эффективен в отношении отрицательно заряженных мембран из ДОФС. Это может быть результатом рас талкивания одноименно заряженных сульфонат ных групп модификатора и сериновых фрагментов. По всей вероятности, это способствует увеличению положительной спонтанной кривизны монослоя при адсорбции RH 421 и изменению ориентации ди польного момента красителя по сравнению с ДФФХ-, ДОФХ-, ДОФЭ- и ДОФС/ДОФЭ-мембранами. К по добному заключению пришли и при изучении кана лообразующей активности антимикробных пептидов в присутствии RH 421 [15]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Количественно охарактеризовано дипольмодифи цирующее действие некоторых флавоноидов, сте роидных миорелаксантов, тиреоидных гормонов, ксантеновых и стирилпиридиновых красителей в отношении фосфолипидных бислоев различного состава. Выявлены структурные особенности мо дификаторов, ответственные за их способность из менять величину дипольного потенциала мембран. Как правило, более гидрофобные соединения обла дают более выраженными дипольмодифицирую щими свойствами. В случае флавоноидов значение также имеют конформация молекулы и локализация гидроксильных групп, а для ксантеновых красите лей - тип и локализация галогеновых заместителей. Варьирование фосфолипидного состава мембран позволило предсказать плоскость адсорбции наиболее эффективных соединений в каждой группе модифи каторов. Изменение профиля латерального давления в бислое влияет на адсорбцию флоретина, бромидов панкурония и векурония, а также RH 421.

Об авторах

С. С. Ефимова

Автор, ответственный за переписку.
Email: ssefimova@mail.ru
Россия

O. С. Остроумова

Email: ssefimova@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы