Human Interleukin-2 and Hen Egg White Lysozyme: Screening for Bacteriolytic Activity against Various Bacterial Cells

P. A. Levashov; Левашов П. A.; E. D. Ovchinnikova; Овчинникова E. Д.; O. A. Morozova; Морозова O. A.; D. A. Matolygina; Матолыгина Д. A.; Ye. E. Osipova; Осипова Е. Э.; T. A. Cherdyntseva; Чердынцева T. A.; S. S. Savin; Савин С. С.; G. S. Zakharova; Захарова Г. С.; A. A. Alekseeva; Алексеева A. A.; N. G. Belogurova; Белогурова Н. Г.; S. A. Smirnov; Смирнов С. A.; V. I. Tishkov; Тишков В. И.; A. V. Levashov; Левашов A. В.

doi:10.32607/20758251-2016-8-1-98-102

Скрининг бактериолитической активности интерлейкина-2 человека и лизоцима куриного яйца на клетках различных микроорганизмов

Авторы: Левашов П.A.¹, Овчинникова E.Д.¹, Морозова O.A.², Матолыгина Д.A.¹, Осипова Е.Э.¹, Чердынцева T.A.¹, Савин С.С.¹, Захарова Г.С.¹^,3, Алексеева A.A.¹^,3, Белогурова Н.Г.¹, Смирнов С.A.¹, Тишков В.И.¹^,3, Левашов A.В.¹
Учреждения:
1. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
2. Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России
3. Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН
Выпуск: Том 8, № 1 (2016)
Страницы: 98-102
Раздел: Экспериментальные статьи
Дата подачи: 17.01.2020
Дата публикации: 15.03.2016
URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10466
DOI: https://doi.org/10.32607/20758251-2016-8-1-98-102
ID: 10466

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Изучена бактериолитическая активность интерлейкина-2 и лизоцима куриного яйца в отношении 34 видов микроорганизмов. Установлено, что в присутствии интерлейкина-2 лизису подвергаются шесть видов из трех семейств: Enterobacteriaceae, Bacillaceae и Lactobacillaceae. Выявлено также 12 видов микроорганизмов, подверженных лизису в присутствии лизоцима, и 16 видов, лизируемых додецилсульфатом натрия (ДСН). Исследована pH-зависимость бактериолитической активности интерлейкина-2 и лизоцима в отношении разных клеток-субстратов.

Ключевые слова

бактериолитическая активность, интерлейкин-2, лизоцим куриного яйца

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Интерлейкин-2 (IL-2) - один из важнейших регуля торов жизнедеятельности организма. Этот лимфокин участвует в регуляции таких процессов, как проли ферация и дифференцировка Т-лимфоцитов; увели чение цитолитической активности NK-клеток; проли ферация В-лимфоцитов, секреция иммуноглобулинов и др. Недавно нами было показано, что IL-2 челове ка способен проявлять бактериолитическую актив ность [1-3]. В результате сравнительного тестирова ния на нескольких штаммах бактерий установлено, что IL-2 имеет более узкую субстратную специфич ность, чем лизоцим куриного яйца. IL-2, как и ли зоцим, способен лизировать клетки Escherichia coli и Lactobacillus plantarum, но, в отличие от лизоцима, не действует на клетки Micrococcus luteus и Bacillus subtilis [1-3]. Обнаружение активности интерлей кина-2 в отношении E. coli и L. plantarum оказалось неожиданным. Механизм бактериолитического дей ствия интерлейкина-2 на сегодняшний день не изве стен, для его выяснения необходимо изучить влияние интерлейкина-2 на другие виды бактерий. Поскольку интерлейкин-2 играет важную роль в развитии им мунного ответа, а также является лекарственным средством, то, в первую очередь, актуально проверить его действие на тех бактериях, которые часто контак тируют с человеком, включая компоненты симбиоти ческой микрофлоры. Основной задачей исследования стал скрининг бактериолитической активности интер лейкина-2 на микроорганизмах, которые встречаются на коже и слизистых человека, могут обнаруживать ся в биоматериале раны. Для сравнения было решено на тех же микроорганизмах проверить действие ли зоцима, а также изучить лизис клеток в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), который входит в со став медицинских препаратов интерлейкина-2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использованы следующие материалы: ронколейкин (раствор 0.25 мг/мл очищенного ин терлейкина-2 для внутривенного и подкожного вве дения, «Биотех», Россия); MES, трис (“extra pure”, Amresco, США); лиофилизированный лизоцим ку риного яйца (95% чистоты, Sigma Aldrich, США); NaOH (98% чистоты, AppliChem Panreac, Германия); CH3COOH («ч. д. а.», «Реахим», Россия); HCl (Germed, Германия); 10% водный раствор ДСН (BioRad, США). Выделенные из клинического материала (моча, мо крота, кал, раневое отделяемое и т.д.) штаммы микро организмов были любезно предоставлены Первым МГМУ им. И.М. Сеченова. Видовую принадлежность микроорганизмов определяли методом прямого бел кового профилирования с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии (серия FLEX, Bruker Daltonic GmbH, Германия). В качестве среды для культи вирования использовали твердую агаризованную среду - 5% кровяной колумбийский агар (Oxoid, Великобритания) pH 7.3. Культуру клеток выращи вали в течение 24 ч при 35°С в атмосфере 5% СО2. В работе также были использованы штаммы из музейной коллекции кафедры микробиоло гии МГУ им М.В. Ломоносова (обозначены как КМ МГУ). L. acidophilus КМ МГУ 146, L. casei КМ МГУ 153 и Lactococcus lactis КМ МГУ 165 выращивали на жидкой среде MRS при 37°C в анаэробных усло виях [4]. Clostridium butiricum КМ МГУ 19 выращи вали на среде следующего состава: глюкоза 10 г/л; пептон 10 г/л; К2НРО4 1 г/л; СаСО3 5 г/л; вода во допроводная, при 37°C в анаэробных условиях [5]. Alcaligenes faecalis КМ МГУ 82, B. megaterium КМ МГУ 17, B. mycoides КМ МГУ 31, B. cereus КМ МГУ 9, Pseudomonas aeruginosa КМ МГУ 47, P. fluorescens КМ МГУ 71, Serratia marcescens КМ МГУ 208 и Staphylococcus aureus КМ МГУ 144 выращивали на мясо-пептонном бульоне при 30°C в аэробных ус ловиях [6]. В работе использовали препарат лиофилизиро ванных бифидобактерий Bifidobacterium bifidum («Микроген», Россия), из которого перед началом ра боты готовили суспензию (10 мл воды на одну ампу лу). Предполагалось, что лиофилизированный препа рат бактерий в эксперименте по измерению скорости лизиса мало отличается от свежевыращенных кле ток по аналогии с препаратом лиофилизированных клеток L. plantarum [7]. Препарат клеток Thermus aquaticus любезно пре доставлен А.А. Белогуровым. Клетки выращива ли по стандартной для данной культуры методике при температуре 75°С в аэробных условиях [8]. Перед началом измерений все препараты бактери альных клеток центрифугировали при 3500 об/мин в течение 4 мин на центрифуге Minispin (Eppendorf, Германия), затем ресуспендировали в буферном растворе, используемом для измерения активности. Раствор лизоцима куриного яйца готовили непосред ственно перед экспериментом, используя тот же бу ферный раствор, что и для измерения активности. В качестве стандартного раствора интерлейкина-2 использовали готовый препарат без дополнительной обработки, ампулу вскрывали непосредственно пе ред экспериментом. Поскольку в исходном растворе интерлейкина-2 присутствует ДСН (2.5 мг/мл), про ведены эксперименты по влиянию данного компонен та на фоновый лизис клеток. Для определения изме нений поглощения при лизисе клеток использовали двухлучевые спектрофотометры UV-1800 или UV- 1601PC (Shimadzu, Япония). Измерения проводили в кюветах с длиной оптического пути 1 см объемом 0.5 мл. Бактериолитическую активность определяли турбидиметрически по скорости падения поглоще ния суспензии клеток [7, 9] при длине волны 650 нм и температуре 37°С. В качестве начальной скорости лизиса клеток использовали изменение поглощения (A650) в интервале времени от 5 до 20-30 с от начала реакции. Если в условиях эксперимента наблюдался фоновый самопроизвольный лизис клеток в отсут ствие бактериолитических факторов, то его величи ну вычитали из значения активности в присутствии бактериолитических добавок. В случае лизиса кле ток в присутствии ДСН учитывали также поправку на величину скорости лизиса в присутствии интер лейкина-2 соответственно содержанию ДСН в пробе. При определении скорости лизиса использовали су спензию клеток с начальным поглощением A650 = 0.4. Активность измеряли в буферном растворе 10 мМ MES-трис-CH3COOH при разных значениях pH. В качестве условного показателя активности приве дены значения начального изменения поглощения - dA/dt (ед. погл./мин), которые (с соответствующими для различных клеток коэффициентами) пропорци ональны скоростям изменения числа живых клеток или колониеобразующих единиц (-dKOE/dt), соот ветственно пропорциональны изменениям степени лизиса dΘ/dt (Θ = 0, если все клетки целы, и Θ = 1 в случае 100% разрушения клеток препарата) [7, 9]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В таблице приведены данные о воздействии ин терлейкина-2, лизоцима и ДСН на клетки 37 штам мов 34 различных видов бактерий. Как видим, 12 видов бактерий подвержены лизису в присутствии лизоцима, 16 лизируются в присутствии ДСН и только шесть видов чувствительны к интерлей кину-2: L. acidophilus, B. megaterium (подтверждено для двух штаммов данного вида), B. mycoides, B. cereus, S. marcescens и Enterobacter aerogenes. При этом на клетки L. acidophilus и B. mycoides дей ствуют и лизоцим, и интерлейкин-2, и ДСН. На клет ки B. megaterium, B. cereus и S. marcescens действу ют лизоцим и интерлейкин-2, но не ДСН. На Ent. aerogenes действует только интерлейкин-2. В целом, спектры микроорганизмов, на которые действует ли зоцим и интерлейкин-2, не совпадают, хоть и имеют пересечение. Вероятно, механизм действия лизоцима и интерлейкина-2 в значительной степени различа ется. На рис. 1 и 2 представлены pH-зависимости ско рости лизиса клеток лизоцимом и интерлейки ном-2. Видно, что значения pH-оптимума актив ности интерлейкина-2 и лизоцима в отношении клеток B. megaterium совпадают и составляют 8.7. В случае клеток L. acidophilus pH-оптимумы актив ности лизоцима и интерлейкина-2 также сходны (6.5-7.0 и 6.7-7.3). Оптимумы активности лизоцима и интерлейкина-2 близки и в случае B. mycoides, и B. cereus (на графиках зависимости не представлены из-за сходства с зависимостями для B. megaterium). Явление схожего смещения оптимумов активности лизоцима и интерлейкина-2, зависящего от выбора субстрата - вида бактерий, наблюдали также в слу чае клеток E. coli и L. plantarum [3]. На рис. 3 представлена pH-зависимость скоро сти лизиса клеток в присутствии ДСН. На графике приведены данные только для пяти из 16 микро организмов, чувствительных к ДСН. У остальных 11 микроорганизмов зависимости скорости лизиса от pH в присутствии ДСН имеют аналогичный вид. Как видим, ДСН лучше действует на клетки в ще лочной среде, что присуще самым различным микро организмам. Действие ДСН обнаруживается при pH выше 7.3-8.0. Возможно, что подобный характер pH зависимости каким-то образом связан c диапазоном значений pK фосфатных групп фосфолипидов кле точных мембран. Вполне вероятно также, что на ха рактер pH-зависимости могут влиять и компоненты буферной смеси, например, трис. Выяснение точной молекулярной причины подобной зависимости дей ствия ДСН от pH выходит за рамки нашей работы. Интерлейкин-2 действует на отдельных пред ставителей грамотрицательного семейства Enterobacteriaceae, в том числе на Ent. aerogenes и S. marcescens, что показано в нашей работе, а также, как установлено ранее, на E. coli [1-3]. Интерлейкин-2 активен в отношении таких грам положительных представителей семейства Lactobacillaceae, как L. acidophilus (данная работа) и L. plantarum [3]. Обнаружено также, что интер лейкин-2 действует на B. megaterium, B. mycoides и B. cereus - грамположительные спорообразую щие палочки семейства Bacillaceae, которые от личаются по строению и составу клеточной стен ки как от бактерий семейства Enterobacteriaceae, так и от Lactobacillaceae. Можно предположить, что в клеточной стенке E. coli, Ent. aerogenes, S. marcescens, L. plantarum, L. acidophilus, B. mycoides, B. megaterium и B. cereus есть некие схо жие структуры. Действительно, в клеточной стенке B. megaterium, B. cereus и L. plantarum обнаруже ны структуры, содержащие диаминопимелиновую кислоту [10-13], что не характерно для многих грамположительных микроорганизмов, но доста точно распространено у представителей семейства Enterobacteriaceae [13, 14]. Считается, что кле точная стенка L. acidophilus не содержит значи тельных количеств диаминопимелиновой кислоты [15]. Однако по аналогии с L. plantarum мы можем предположить, что диаминопимелиновая кислота может входить в состав клеточной стенки отдель ных штаммов L. acidophilus. Нами не обнаружены публикации, в которых приведены точные данные о присутствии и количестве диаминопимелиновой кислоты у B. mycoides, однако мы можем предпола гать, что строение клеточной стенки у этой бактерии и у B. megaterium и B. cereus может быть частично схожим. По-видимому, сходную восприимчивость к интерлейкину-2 у столь неродственных микроор ганизмов можно объяснить наличием общих струк тур, содержащих диаминопимелиновую кислоту. Ранее мы показали, что интерлейкин-2 не действу ет на клетки B. subtilis [1, 2], которые также вхо дят в семейство Bacillaceae. Однако опубликованы сведения, согласно которым у B. subtilis, в отличие от многих других представителей этого семейства, диаминопимелиновая кислота находится в амиди рованной форме [16]. Таким образом, устойчивость B. subtilis к действию интерлейкина-2 фактически подтверждает нашу гипотезу. В целом, на данном этапе исследования преждевременно делать точ ные выводы о том, какие типы микроорганизмов чувствительны к интерлейкину-2. Кроме того, чувствительность к бактериолитическим агентам может изменяться в зависимости от наличия и со става капсулы у бактерии, а также различаться даже у разных штаммов одного и того же вида [17]. Следует отметить, что продолжаются дискуссии относительно механизмов действия даже давно из учаемого лизоцима на различные микроорганиз мы. Есть основания полагать, что лизоцим может действовать на бактериальные клетки не только как фермент, но и как антибактериальный катион ный белок [18]. В результате нашей работы установ лен некий спектр микроорганизмов, чувствитель ных к интерлейкину-2, что поможет дальнейшему изучению молекулярных механизмов восприим чивости или невосприимчивости микроорганизмов к данному бактериолитическому фактору.

Список литературы

Levashov P.A., Sedov S.A., Belogurova N.G., Shipovskov S.V., Levashov A.V. // Biochemistry (Moscow). 2012, V.77, №11, P.1312-1314
Sedov S.A., Belogurova N.G., Shipovskov S.V., Semenova M.V., Gitinov M.M., Levashov A.V., Levashov P.A. // Rus. J. Bioorg. Chem. 2012, V.38, №3, P.274-281
Levashov P.A., Matolygina D.A., Osipova H.E., Savin S.S., Zaharova G.S., Gasanova D.A., Belogurova N.G., Ovchinnikova E.D., Smirnov S.A., Tishkov V.I., Levashov A.V. // J. Moscow Univ. Chem. Bull. 2015, V.70, №6, P.257-261
de Man J.D., Rogosa M., Sharpe M.E. // J. Appl. Bacteriol. 1960, V.23, P.130-135
Galynkin V.A., Zaikina N.A., Kocherovets V.I., Kurbanova I.Z. // Nutrient media for microbiological quality control of medicines and food products. Reference book, St.P.: Prospekt Nauki,2006 2006
Netrusov A.I., Egorova M.A., Zakharchuk L.M. // Praktikum po mikrobiologii. M.: Akademiya,2005 2005
Matolygina D.A., Osipova H.E., Smirnov S.A., Belogurova N.G., Eremeev N.L., Tishkov V.I., Levashov A.V., Levashov P.A. // Moscow Univ. Chem. Bull.. 2015, V.70, №6, P.262-267
Brock T.D., Edwards M.R. // Journal of Bacteriology 1970, V.104, P.509-517
Levashov P.A., Sedov S.A., Shipovskov S.V., Belogurova N.G., Levashov A.V. // Anal. Chem. 2010, V.82, P.2161-2163
Bricas E., Ghuysen J.M., Dezélée P. // Biochem. 1967, V.6, №8, P.2598-2607
Okada S., Suzuki Y., Kozaki M. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1979, V.25, P.215-221
van Heijenoort J., Elbaz L., Dezelee P., Petit J.F., Bricas E., Ghuysen J.M. // Biochem. 1969, V.8, №1, P.207-213
Day A., White P.J. // Biochem J. 1977, V.161, №3, P.677-685
Berges D.A., DeWolf W.E. Jr., Dunn G.L., Grappel S.F., Newman D.J., Taggart J.J., Gilvarg C. // J. Med. Chem. 1986, V.29, №1, P.89-95
Ikawa M., Snell E.E. // J. Biol. Chem. 1960, V.235, P.1376-1382
Warth A.D., Strominger J.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969, V.64, №2, P.528-535
Campos M.A., Vargas M.A., Regueiro V., Llompart C.M., Albertí S., Bengoechea J.A. // Infection Immunity. 2004, V.72, №12, P.7107-7114
Ginsburg A., Koren E., Feuerstein O. // SOJ Microbiol. Infect. Dis. 2015, V.3, №1, P.1-8

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

Имя пользователя
Пароль
Запомнить меня

Забыли пароль?	Регистрация

Имя пользователя
Пароль
Запомнить меня

Забыли пароль?	Регистрация

Скрининг бактериолитической активности интерлейкина-2 человека и лизоцима куриного яйца на клетках различных микроорганизмов

Полный текст

Аннотация

Ключевые слова

Полный текст

Об авторах

П. A. Левашов

E. Д. Овчинникова

O. A. Морозова

Д. A. Матолыгина

Е. Э. Осипова

T. A. Чердынцева

С. С. Савин

Г. С. Захарова

A. A. Алексеева

Н. Г. Белогурова

С. A. Смирнов

В. И. Тишков

A. В. Левашов

Список литературы

Дополнительные файлы

Данный сайт использует cookie-файлы