Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки гибридов полёвок Microtus levis × Microtus arvalis: условия, необходимые для получения и поддержания

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время, помимо традиционного спосо ба выделения плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) из ранних эмбрионов млекопитающих, появи лась возможность индуцировать плюрипотентность с помощью репрограммирования разных типов тер минально дифференцированных соматических кле ток [1-4]. Репрограммирование соматических клеток к плюрипотентному состоянию дает возможность получать неограниченное количество аутологичных ИПСК любого млекопитающего, в том числе и чело века. Технология репрограммирования открывает широчайшие перспективы не только для персонифи цированного подхода к лечению различных заболеваний, но и служит инструментом для генетического моделирования множества биологических процессов, в том числе для изучения раннего эмбрионального развития, сигнальных путей и факторов, участву ющих в поддержании плюрипотентности и запуске дифференцировки. Репрограммирование дифференцированных кле ток различных видов млекопитающих к плюрипо тентному состоянию возможно за счет повышенной экспрессии в них генов четырех транскрипционных факторов: Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc (OSKM). У мле копитающих эти гены эволюционно консервативны [5, 6], а их продукты имеют существенно перекры вающийся спектр ключевых генов-мишеней, по этому зачастую при репрограммировании клеток разных видов удается использовать генетические конструкции, экспрессирующие OSKM челове ка или мыши [7-10]. В настоящее время получены ИПСК мыши, человека, макаки, крысы, собаки, мно гих сельскохозяйственных животных и ряда других видов млекопитающих, включая степную полёвку Microtus ochrogaster. Условия, в которых происхо дит индукция и поддержание плюрипотентности, имеют межвидовые различия [11-19]. Отчасти это обусловлено видоспецифичностью сигнальных ка скадов, участвующих в активации и поддержании недифференцированного состояния in vitro, а также связано с различными требованиями к составу сре ды для культивирования, например, к присутствию или отсутствию в среде сыворотки крупного рогатого скота. Индукции и поддержанию плюрипотентности способствует наличие в среде ингибиторов различ ных сигнальных путей, ингибиторов деацетилаз ги стонов, метилтрансфераз гистонов и ДНК, а также антиоксидантов. В представленной работе подобраны условия получения и поддержания клеток с индуцирован ной плюрипотентностью видов группы обыкно венных полёвок рода Microtus. Четыре близкород ственных криптических вида M. arvalis, M. levis, M. transcaspicus и M. kirgisorum, выделяемых в группу обыкновенных полёвок, являются объек том исследования молекулярно-генетической орга низации генома и механизмов процесса инактивации Х-хромосомы [20-28]. Для этих видов изучены гены, вовлеченные в установление и поддержание плюри потентности, показана их консервативность, включая паттерн экспрессии [5, 6, 29]. Наличие плюрипотент ных клеток обыкновенных полёвок могло бы стать подходящим инструментом для проведения молеку лярно-генетических работ на видах данной группы. Ранее нами предпринимались многочисленные попытки по получению ПСК видов группы обыкно венных полёвок рода Microtus из ранних предым плантационных бластоцист и герминальных клеток [30]. Были получены мультипотентные линии клеток предымплантационного эмбриона, такие, как трофо бластные стволовые клетки и клетки экстраэмбрио нальной энтодермы [25, 31-33]. Однако ПСК обыкно венных полёвок получены не были. В представленной работе в экспериментах по репрограммированию со матических клеток нам впервые удалось подобрать условия, в которых возможно получение и поддер жание ПСК обыкновенных полёвок. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Культуры клеток и состав сред для их культивирования Из эмбрионов гибридов M. levis × M. arvalis на 19 день эмбрионального развития (Е19) выделяли и куль тивировали фибробласты кожи и клетки головно го мозга. Фибробласты растили в среде DMEM/F12 (F12, Nutrient Mixture/Dullbecco’s Modified Eagle Medium; Gibco) в соотношении 1 : 1, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Fetal Bovine Serum, FBS; Gibco), 1× Non-Essential Amino Acids (NEAA; Gibco), 1× Pen Strep (100 ед./мл пеницилли на, 100 мкг/мл стрептомицина; Gibco), 1× GlutaMAX (Gibco). Клетки мозга первые 3 дня культивирова ли в среде DMEM/F12 (1 : 1), 10% FBS, 1× NEAA, 1× Pen Strep, 1× GlutaMAX, далее переводили их в среду Снайдера: DMEM/F12 (1 : 1), 10 нг/мл bFGF (StemCell), 10 нг/мл EGF (Sigma), 2 мкг/мл гепари на (Sigma), 1× N2 Supplement (Gibco), 1× Pen Strep, 1× GlutaMAX. В первом эксперименте для индукции плюрипо тентности в клетках гибридов M. levis × M. arvalis использовали две среды, позволившие получить ИПСК полевки M. ochrogaster [16]. Среды готовили на основе Advanced DMEM/F12 (1 : 1) (Gibco), содер жащей 15% заменителя сыворотки (Knockout Serum Replacement, KSR; Gibco), 1× NEAA, 0.1 мM 2-мер каптоэтанол, 1× Pen Strep, 1× GlutaMAX. В первую среду добавляли ингибиторы сигнальных путей 3iR: CHIR99021 (3 мкМ, StemRD), PD0325901 (1 мкМ, StemRD), A83-01 (0.5 мкМ, Stemgent) и ROCK ингибитор (Y-27632, 10 мкМ, StemRD), второй вари ант среды не содержал ингибиторов. Обе среды со держали 1000 ед./мл LIF мыши (mLIF, Invitrogen) и 2 мкг/мл доксициклина (Sigma), который добав ляли лишь на начальных этапах культивирования. Для получения и культивирования ИПСК полёвки в качестве фидерной подложки использовали эмбри ональные фибробласты мыши, митотически инакти вированные раствором митомицина С (10 мкг/мл, Sigma) в течение 2 ч. Пересадку первичных инди видуальных колоний на первом пассаже проводили при помощи стеклянного капилляра, а в дальней шем - с использованием TrypLE (Gibco). В дальнейших экспериментах по репрограммиро ванию в среде на основе Advanced DMEM/F12 (1 : 1), дополненной 1× NEAA, 0.1 мM 2-меркаптоэтанолом, 1× Pen Strep, 1× GlutaMAX, варьировали содержа ние 3iR, mLIF, PKCi (Gö6983,Tocris, 5 мкМ), bFGF, аскорбиновой кислоты, KSR и FBS. В состав культу ральной среды, в которой были получены ИПСК ги бридов M. levis × M. аrvalis, входили следующие ком поненты: Advanced DMEM/F12 (1 : 1), 7% KSR (Gibco), 7% FBS (Gibco), 0.1 мM 2-меркаптоэтанол, 1× Pen Strep, 1× GlutaMAX, 1000 ед./мл mLIF (Invitrogen), 10 нг/мл bFGF (StemCell), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Wako). Первоначально данная среда содер жала 2 мкг/мл доксициклина (Sigma), который отме няли на 14-й день репрограммирования. ИПСК полёв ки замораживали в 90% FBS и 10% DMSO. Плазмидные конструкции, получение лентивирусов, схема трансдукции В экспериментах использовали три плазмиды: 1) TetO-FUW-OSKM (Addgene Plasmid 20321), кодиру ющую репрограммирующие факторы OSKM мыши; 2) FUdeltaGW-rtTA (Addgene Plasmid 19780), не сущую кДНК тетрациклинового трансактиватора, необходимого для регуляции транскрипционной ак тивности конструкции с OSKM, путем добавления в культуральную среду доксициклина; 3) pGpur, содержащую ген зеленого флуоресцентного белка EGFP, для контроля эффективности трансдукции. Лентивирусы получали путем котрансфекции ука занных плазмид с плазмидами pxPAX2 (Addgene Plasmid 12260) и pMD2.G (Addgene Plasmid 12259), которые кодируют белки, необходимые для упаков ки вирусных частиц, в клетки линии 293FT [34, 35]. Клетки 293FT рассаживали с плотностью 6 × 106 на культуральные флаконы Т75 и инкубировали в течение ночи. Трансфекцию осуществляли каль ций-фосфатным методом [36]. Среду с вирусными ча стицами собирали через 48, 72 и 96 ч после трансфек ции и пропускали через фильтр 0.45-мкм (Millipore). Вирусы концентрировали на ультрацентрифуге (Beckman Coulter, Optima XE-90 Ultracentrifuge) в течение 90 мин при 70000 g. Осадок вирусных ча стиц растворяли в 200 мкл F12/DMEM и хранили в аликвотах при -70оС. За 1 сут до трансдукции фибробласты и клетки, выделенные из мозга, рассаживали на 12-луночные планшеты с плотностью 50 и 75 тыс. клеток на лунку соответственно. Трансдуцировали клетки 4-6 пас сажа. В день трансдукции к клеткам на 14-16 ч до бавляли среду с лентивирусами, полученными на ос нове плазмид TetO-FUW-OSKM, FUdeltaGW-rtTA или pGpur, с титром около 3 × 107 инфицирующих единиц в 1 мл (MOI 5-7.5) для каждого из лентивиру сов и 4 мкг/мл полибрена (Hexadimethrine bromide, Sigma). Клетки, трансдуцированные лентивирусами с репрограммирующими факторами и тетрацикли новым трансактиватором, через 4 сут пересажива ли с использованием TrypLE в разведении от 1 : 10 до 1 : 20 (в зависимости от плотности клеток в лунке) на митотически инактивированные эмбриональные фибробласты мыши в культуральные среды, разли чающиеся по составу. Для определения эффектив ности трансдукции использовали клетки, трансду цированные лентивирусами, содержащими pGpur, подсчитывая через 4 сут долю «зеленых» клеток, при помощи флуоресцентного микроскопа и/или проточной цитометрии. Гистохимическое выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы Активность эндогенной щелочной фосфатазы (ЩФ) выявляли гистохимически согласно [37]. Клетки фиксировали, высушивая на воздухе, и инкубировали в растворе красителя: 100 мкМ Tрис-HCl pH 9.0; 100 мкМ NaCl; 5 мкМ MgCl2; 0.4 мкг/мл нафтол фосфата (Sigma); 1 мкг/мл Fast Violet B Salt (Sigma), в течение 15-20 мин в темноте при комнатной тем пературе. Иммунофлуоресцентный анализ Клетки фиксировали 4% формальдегидом в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Промывали PBS и инкубировали с 0.1% Triton Х-100 и 2.5% FBS (или бычьим сывороточным альбумином), растворен ными в PBS, в течение 30 мин при комнатной тем пературе. Иммунопреципитацию с первыми анти телами проводили в течение ночи при 4оС. Список первых антител, использованных в работе, приведен в табл. 1. Локализацию первых антител визуализи ровали при помощи вторых антител к иммуноглобу линам кролика или мыши, конъюгированных с флу оресцентными красителями Alexa 488 и Alexa 568 (Life Technologies). Ядра окрашивали DAPI (Vector Laboratories). Дифференцировка линий клеток in vitro в эмбриоидных телах Колонии недифференцированных клеток механиче ски переносили на чашки Петри, покрытые тонким слоем 1% агарозы, в среду DMEM/F12 (1 : 1) с 10% FBS, 1× Pen Strep, 1× GlutaMAX. Образовавшиеся эмбриоидные тела культивировали в течение 7 дней в суспензии и переносили на чашки Петри, по крытые 0.1% желатином, где они распластывались. В распластанном состоянии эмбриоидные тела куль тивировали в течение 14-20 дней, после чего диффе ренцированные клетки анализировали иммунофлуо ресцентным способом либо дезагрегировали TrypLE, выделяли РНК и проводили ОТ-ПЦР. Выделение РНК, ОТ-ПЦР РНК выделяли при помощи реагента Trizol Reagent (Ambion). Образцы обрабатывали ДНК-азой I (Turbo DNA-free, Ambion), чтобы избавиться от контами нации ДНК. кДНК синтезировали с использовани ем Super-ScriptIII (Invitrogen). Последовательности праймеров и условия реакций, использованные в ОТ- ПЦР, приведены в табл. 2. Для анализа транскрип ции с привнесенных лентивирусов экзогенной кДНК OSKM мыши использовали праймеры и условия ОТ-ПЦР, приведенные в [34]. Для каждой пары прайме ров проводили реакцию негативного контроля (OТ-), в которой в качестве матрицы использовали реакци онную смесь, содержащую все компоненты, необхо димые для синтеза кДНК, за исключением обратной транскриптазы. Бисульфитное секвенирование ДНК промоторной области гена Oct4 полёвки Бисульфитную модификацию и очистку геномной ДНК (500 нг) проводили с помощью набора реагентов EZ DNA Methylation - Direct Kit (Zymo Research). Модифицированную ДНК использовали в реакции ПЦР с праймерами: Oct4_Reg2_f2 (5’-TAAGAGGATGGGGGGGTAGTGAAAG- 3’) Oct4_Reg2_r2 (5’-GAAATCTAAAACCAAATATCCAACCATAAA- 3’). Полученные продукты ПЦР клонировали с помо щью pGEM-T Easy Vector System I (Promega). С ис пользованием универсального праймера M13 Reverse секвенировали 10 случайно отобранных плазмидных клонов каждого образца ДНК. Нуклеотидные по следовательности анализировали с использованием программы QUMA (Quantification tool for Methylation Analysis, http://quma.cdb.riken.jp/, [38]). Цитогенетический анализ Клетки фиксировали по стандартной методике [39] с некоторыми модификациями: время инкубации с бромистым этидием (0.05%) - 3 ч, с колцемидом (10 мкг/мл, Gibco) - 2 ч, время гипотонии - 15-20 мин. Перед окрашиванием препараты инкубировали в течение ночи при 50оС. Hoechst 33258 (Sigma) в кон центрации 0.05 мкг/мл готовили на сбалансирован ном растворе Хенкса (HBSS, Gibco). Метафазные пластинки окрашивали в растворе Hoechst 33258 в течение 10 мин, после чего препараты промыва ли водой и заключали в ацетатный буфер рН 5.5. Метафазы визуализировали при помощи микроскопа Ni-E (Nikon), программа Lucia. Анализ клеток методом проточной цитометрии Число EGFP- и SSEA1-позитивных клеток оцени вали на приборах BD FACS Aria и BD FACSCanto II с использованием программы BD FACS Diva. Поверхностный антиген SSEA1 выявляли с помощью антител (sc-21702, Santa Cruz Biotechnology) по мето дике фирмы-производителя. РЕЗУЛЬТАТЫ Получение доксициклин-зависимых ИПСК подобных клеток полёвки и их характеристика ИПСК обыкновенных полёвок получали с исполь зованием лентивирусов, экспрессирующих кДНК четырех ключевых репрограммирующих факторов OSKM мыши под промотором, регулируемым док сициклином. Транскрипцией с данного промотора можно управлять, добавляя в среду антибиотик, однако для этого клетки необходимо дополнительно трансдуцировать лентивирусами, экспрессирующи ми кДНК тетрациклин-зависимого трансактивато ра. Эту систему, в которой экспрессию OSKM мыши контролировали, добавляя в среду доксициклин, успешно использовали ранее для получения ИПСК мыши и человека [34]. Мышь и полёвки входят в одно семейство мышевидных грызунов (Muridae) отряда Rodentia и имеют высокое сходство генов OSKM [40]. К достоинствам данной системы, по нашему мнению, относится то, что все четыре репрограммирующих фактора доставляются в клетку в составе одной ви русной частицы. Лентивирусными конструкциями трансдуцирова ли клетки, выделенные из эмбрионов гибридов обык новенных полёвок M. levis × M. arvalis, которые слу жат моделью для изучения феномена неслучайной инактивации Х-хромосомы [27, 28]. Использовали два типа клеток гибридов: фибробласты кожи и клетки, выделенные из головного мозга. Трансдукцию прово дили по следующей схеме (рис. 1А). Эффективность трансдукции, оцененная с помощью лентивирусов, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, методами проточной цитометрии и флуоресцент ной микроскопии составляла 86.5% в фибробластах (рис. 1Б) и 75% - в клетках мозга (рис. 1В). Плюрипотентность в клетках обыкновенных по лёвок индуцировали с использованием двух вариан тов среды, в которых ранее успешно получили ИПСК из фибробластов степной полевки M. ochrogaster [16]. В состав первого варианта входили Advanced DMEM/F12 с добавлением 15% KSR и mLIF, вто рой вариант содержал те же компоненты, однако включал также коктейль ингибиторов, названный 3iR. В состав коктейля 3iR входят ингибиторы киназ MEK/ERK и GSK3b (PD0325901 и CHIR99021 со ответственно), антагонист рецептора I типа TGF-ß (A83-01), используемые для получения и поддержа ния в недифференцированном состоянии ПСК мыши и крысы, а также ингибитор ROCK, повышающий выживаемость одиночных клеток в культуре [41-46]. На 4-е сутки после трансдукции клетки гибридов M. levis × M. arvalis пересаживали на митотически инактивированные эмбриональные фибробласты мыши и добавляли выбранную для получения ИПСК среду с 3iR или без 3iR. Через 24 ч после этого появ лялись первые морфологические изменения клеток, усилилась интенсивность их пролиферации. Через 5-8 дней трансдуцированные клетки, выделенные из мозга, начинали сливаться в однородные первич ные колонии (рис. 1Г), тогда как трансдуцированные фибробласты не давали ПСК-подобных первичных колоний (табл. 3). Первичные колонии, полученные при репро граммировании клеток мозга, на 10-13-е сутки от начала эксперимента пересаживали в индиви дуальные лунки, дезагрегируя их стеклянным капил ляром. Морфология колоний клеток была такой же, как у мЭСК - объемные плотные колонии с тесны ми межклеточными контактами (рис. 1Д,Е). Клетки в таких колониях имели большое ядерно-цитоплаз матическое соотношение, что характерно для ЭСК. После пересадки первичных колоний большинство клеток дифференцировалось уже на первом пасса же, однако около 40% сохранили ЭСК-подобную мор фологию. С помощью гистохимического окрашивания в отобранных колониях клеток обнаружен разный уровень эндогенной ЩФ (рис. 1Ж). Линии, в которых активность ЩФ не детектировалась, из дальнейшего анализа исключали. Таким образом, по результатам анализа активности ЩФ на ранних пассажах куль тивирования отобрали 11 линий клеток, получен ных в присутствии ингибиторов (viBr; vole inhibitor Brain) и 10 - в их отсутствие (vBr). Следует отметить, что в основной массе клеток не экспрессировался один из основных ранних маркеров плюрипотентно сти, характерный для ПСК мыши - поверхностный антигена SSEA1. ИПСК-подобные клетки интенсив но пролиферировали в среде, содержащей доксици клин, без изменения морфологии около 40 пассажей (более 120 дней). Эти клетки пересаживали через 2-3 дня в разведении от 1 : 8 до 1 : 10, они хорошо пере носили многократное замораживание в жидком азо те с последующим размораживанием без изменения фенотипических характеристик. Мы неоднократно пытались культивировать линии клеток в отсутствие доксициклина, прекращая экс прессию трансгенных OSKM, однако пухлые колонии ИПСК-подобных клеток уплощались и дифференци ровались уже на 2-е сутки. Таким образом, условия культивирования, по зволившие успешно получать ИПСК M. ochrogaster, не привели к индукции плюрипотентности в клетках гибридов M. levis × M. arvalis. При репрограммиро вании в этих средах фибробласты гибридов обыкно венных полёвок не формировали даже первичных колоний, а клетки, выделенные из мозга, хотя и об разовывали первичные колонии, но не обнаруживали запуска механизмов самообновления, которые позво ляли бы им поддерживать ИПСК-подобную морфо логию при отсутствии в них экспрессии трансгенных факторов OSKM. В дальнейшем мы сосредоточились на подбо ре компонентов культуральной среды, которые бы сделали возможной индукцию и поддержание плю рипотентности в клетках обыкновенных полевок in vitro. С этой целью варьировали в различных соче таниях такие компоненты среды, как mLIF, PKCi, bFGF и аскорбиновую кислоту, которые применяют для получения и поддержания культур плюрипо тентных клеток других видов млекопитающих [7, 9, 13, 47-55]. Компоненты среды тестировали на двух ИПСК-подобных доксициклин-зависимых лини ях, одна из которых получена и культивировалась в среде с добавлением ингибиторов (линия viBr3), а вторая (vBr3) - без ингибиторов. Интересный эф фект обнаружен при добавлении в среду вещества Gö6983 - ингибитора протеинкиназы С (PKCi), спо собного запускать и поддерживать самообновле ние плюрипотентных клеток грызунов без актива ции сигнальных путей LIF/STAT3 или подавления ERK/GSK3 [48, 50]. В присутствии PKCi на 9-й день культивирования в обеих ИПСК-подобных линиях клеток отмечено появление 3-5% SSEA1-позитивных клеток (рис. 1З), доля которых к 19-му дню уве личилась до 80-90% (рис. 1И). Однако, несмотря на экспрессию SSEA1, одного из маркеров культи вируемых in vitro плюрипотентных клеток мыши, крысы и М. ochrogaster [16, 56, 57], ИПСК-подобные клетки гибридов M. levis × M. arvalis по-прежнему дифференцировались в отсутствие доксициклина. Более значимый для репрограммирования клеток обыкновенных полёвок результат получен при ис пользовании среды, содержащей одновременно три компонента: mLIF, bFGF и аскорбиновую кислоту, что впервые позволило нам культивировать ИПСК подобные культуры гибридов M. levis × M. arvalis без видимых изменений в морфологии на протяже нии шести пассажей в отсутствие доксициклина. При этом в культурах обнаружен запуск экспрессии собственных генов плюрипотентности Oct4 и Nanog (рис. 1К). При добавлении mLIF, bFGF и аскорбино вой кислоты в культуральную среду для viBr3 и vBr3 по одному или попарно подобного эффекта не наблю далось. Однако, поскольку viBr3 и vBr3, культивиру емые без доксициклина с добавлением mLIF, bFGF и аскорбиновой кислоты, все же начинали дифференцироваться после шестого пассажа, мы решили провести второй эксперимент по репрограммирова нию клеток обыкновенных полёвок, используя с са мого начала те условия, в которых нам удавалось некоторое время поддерживать ИПСК гибридов M. levis × M. arvalis без доксициклина. Успешное получение доксициклин-независимых ИПСК полёвки Новое репрограммирование гибридов M. levis × M. arvalis провели по ранее описанной схеме (рис. 1А), используя эмбриональные фибробласты кожи. Эффективность трансдукции составляла 32.9% (рис. 2А). Учитывая опыт, полученный в предыду щем эксперименте, после трансдукции лентивиру сами, экспрессирующими OSKM и тетрациклин-за висимый трансактиватор, фибробласты переводили на среды для репрограммирования, содержащие mLIF, bFGF и аскорбиновую кислоту. Как и в пре дыдущем эксперименте, мы использовали среды с коктейлем ингибиторов 3iR и без него. Кроме того, мы варьировали содержание KSR и FBS в средах: одни среды, как и ранее, содержали 15% KSR, тогда как в состав других сред входила смесь 7% FBS и 7% KSR. Уже на 3-й день после начала культивирования (7-й день от начала трансдукции) фибробластов на средах для репрограммирования, содержащих смесь FBS и KSR, появились первичные колонии. В средах, содержащих 15% KSR, не наблюдалось об разования первичных колоний (табл. 3). На 10-14 день от начала трансдукции из культур, репрограм мируемых в присутствии KSR и FBS, было переса жено шесть первичных колоний из чашки со средой 3iR и восемь колоний из чашки со средой без 3iR. Доксициклин отменили через 14 дней после начала репрограммирования, т.е. на первом пассаже после пересадки первичных колоний в индивидуальные лунки. В результате культивирования без доксици клина большая часть колоний дифференцировалась либо была отсеяна в результате первичного анализа активности ЩФ. Таким образом, были отобраны два клона 14vf2 и 14vf7, экспрессирующие ЩФ и куль тивируемые на среде без ингибиторов. Полученные в данном эксперименте две линии клеток культи вировали в среде, содержащей 7% FBS, 7% KSR, mLIF, bFGF и аскорбиновую кислоту, без измене ния морфологии на протяжении по крайней мере 28 пассажей (более 4 мес.) без добавления доксицикли на. Отмена любого из компонентов среды, а именно mLIF, bFGF или аскорбиновой кислоты, а также снижение концентрации FBS ниже 7% приводило к постепенной дифференцировке полученных линий ИПСК. Характеристика доксициклин-независимых линий клеток полёвки Клетки полученных линий растут уплощенными ко лониями с плотными межклеточными контактами и четким краем, напоминая ПСК человека (рис. 2Б). Колонии клеток растут, раздвигая клетки фидера и прикрепляясь к пластику, как ЭСК/ИПСК чело века, а не поверх фидера, как мЭСК. Интенсивность пролиферации линий ИПСК обыкновенных полёвок и ПСК человека была сопоставимой. Обнаружено, что добавление ингибитора ROCK в среду для куль тивирования существенно увеличивает выжива емость клеток при их пересадке как механической (с помощью капилляра), так и с использованием TrypLE. Более 70% клеток в обеих линиях ИПСК имеют ожидаемое число аутосом, равное 50; X-хромосому M. levis и Y-хромосому M. arvalis (рис. 2В). По результатам гистохимического анализа актив ность ЩФ выявлена в линиях клеток в недифферен цированном состоянии (рис. 2Г) и не обнаружена по сле дифференцировки. В стабильных линиях ИПСК гибридов M. levis × M. arvalis, в отличие от докси циклин-зависимых линий, не детектируется транс крипция привнесенной конструкции с репрограмми рующими факторами (рис. 2Д). Более того, в обеих линиях клеток произошло деметилирование CpG динуклеотидов в промоторе гена Oct4 полёвки, что свидетельствует о его реактивации (рис. 3А). Иммунофлуоресцентным анализом показано, что полученные линии клеток в недифференциро ванном состоянии на ранних пассажах экспресси ровали один из основных маркеров плюрипотент ности - поверхностный антиген SSEA1 (рис. 2Е), что характерно для мЭСК/ИПСК. На рис. 2Е отчет ливо видно, что совместная локализация окраски на ЩФ и SSEA1 наблюдается в более пухлой плотной недифференцированной части колонии, тогда как ле вый верхний край колонии, содержащий распластан ные дифференцированные клетки, не окрашивает ся ни на ЩФ, ни на SSEA1. Однако через несколько пассажей нам не удалось обнаружить клетки, экс прессирующие SSEA1. Также в ИПСК гибридов M. levis × M. arvalis выявлена экспрессия ключевых генов плюрипотентного состояния Oct4 и Sox2, кото рая устойчиво сохранялась в течение культивирова ния клеток (рис. 2Ж). Методом ОТ-ПЦР в обеих линиях ИПСК гибридов M. levis × M. arvalis обнаружена экспрессия собствен ных генов Nanog, Oct4, Sox2, Sall4, Esrrb, важных для поддержания плюрипотентного состояния клеток млекопитающих. В исходной линии эмбриональных клеток кожи транскрипты этих генов отсутствуют (рис. 3Б). Таким образом, учитывая ПСК-подобную морфологию колоний клеток, экспрессию ЩФ, деме тилирование промотора гена Oct4, экспрессию в них генов Nanog, Oct4, Sox2, Sall4, Esrrb, неограниченную пролиферацию в культуре без изменения морфоло гии в отсутствие доксициклина, можно утверждать, что нам удалось получить плюрипотентные ИПСК межвидовых гибридов M. levis × M. arvalis. Для исследования способности линий клеток к дифференцировке in vitro из них получили эмбри оидные тела, которые формировались в суспензи онной культуре уже на 2-е сутки (рис. 4А). Анализ дифференцированных производных с помощью им мунофлуоресцентного окрашивания антителами к маркерам специализированных клеточных типов выявил производные всех трех первичных зароды шевых листков: эктодермы (нестин, β-III-тубулин), энтодермы (SOX17, KRT18) и мезодермы (α-SMA, CD90) (рис. 4Б). Исследуя спонтанную дифференцировку прошед ших успешное репрограммирование ИПСК гибри дов M. levis × M. arvalis в культуре c использованием антител, которые выявляют исключительно эндо генные OCT4 и KLF4, мы обнаружили, что экспрес сия KLF4 отсутствует в плюрипотентных клетках, но появляется в начале их дифференцировки, корре лируя c утратой транскрипционного фактора OCT4 (рис. 4В). ОБСУЖДЕНИЕ Нами была предпринята попытка получить ИПСК гибридов от скрещивания между видами M. levis и M. arvalis, которые относятся к группе обыкновен ных полёвок рода Microtus. Первые опыты по полу чению ИПСК обыкновенных полёвок были выпол нены с использованием тех же культуральных сред и факторов, которые ранее позволили индуцировать плюрипотентность и получить ИПСК степной полёв ки M. ochrogaster [16]. ИПСК степной полёвки были получены в присутствии заменителя эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота KSR, а также ци токина LIF, который запускает ключевой сигнальный каскад плюрипотентных клеток мыши и крысы [57- 59]. Получение ИПСК M. ochrogaster возможно в при сутствии в составе среды ингибиторов CHIR99021, PD0325901 и A83-01. Тем не менее при репрограмми ровании клеток обыкновенных полёвок с помощью четырех факторов OSKM с использованием сред, со держащих LIF и KSR, индукции плюрипотентности не происходило. После тщательного подбора условий ИПСК гибридов M. levis × M. arvalis были получе ны в среде, содержащей mLIF, bFGF, аскорбиновую кислоту, а также смесь 7% FBS и 7% KSR. Интересно, что при репрограммировании клеток M. ochrogaster в средах, содержащих bFGF и FBS, в большинстве случаев не удавалось получать даже первичные ИПСК-подобные колонии. Наш опыт показывает, что OSKM мыши, с помо щью которых плюрипотентность индуцируют в со матических клетках различного типа и у разных ви дов, могут быть эффективны при получении ИПСК обыкновенных полёвок. Тем не менее присутствия в среде цитокина LIF, важнейшего фактора в ста новлении и поддержании недифференцированного состояния ЭСК и ИПСК у грызунов (мышь, крыса, а также степная полёвка) [16, 57-59], недостаточно для индукции и сохранения плюрипотентности in vitro в клетках обыкновенных полёвок. Этот резуль тат согласуется с сообщениями о безуспешных по пытках получить ЭСК видов группы обыкновенных полёвок из внутренней клеточной массы бластоцист в присутствии LIF мыши и полёвки M. levis [31]. В со вокупности эти данные позволяют предполагать, что сигнальный путь, запускаемый цитокином LIF, в силу каких-то видоспецифических особенностей обыкновенных полёвок не может самостоятельно обеспечивать плюрипотентность в условиях in vitro. Ключевой для индукции и поддержания плю рипотентности клеток обыкновенных полёвок ста ла комбинация факторов bFGF и mLIF. Известно, что bFGF участвует в запуске основного сигнально го каскада ПСК у таких видов, как человек, макака, собака, корова, лошадь, овца [7, 9, 13, 15, 17, 51-55, 60-62]. Комбинация bFGF и LIF также применяет ся для индукции и поддержания плюрипотентности у многих видов млекопитающих, включая человека [63], кролика [13], собаку [62], лошадь [7, 17], овцу [9]. Сравнение ПСК человека, полученных и культиви руемых в средах, содержащих только bFGF, а так же bFGF и LIF, показало, что именно у ИПСК и ЭСК, поддерживаемых с использованием двух факторов, характеристики транскриптома и эпигенома очень близки к характеристикам плюрипотентных клеток ранних эмбрионов [63]. Важный компонент среды, позволивший осуще ствить репрограммирование дифференцированных клеток обыкновенных полёвок к плюрипотентному состоянию, - аскорбиновая кислота. Ранее было по казано, что аскорбиновая кислота обладает анти оксидантными свойствами, а также активирует деметилазы гистонов и белки TET, ответственные за важнейшие эпигенетические преобразования при индукции плюрипотентности, что, в частности, необходимо для инициации в репрограммируемых клетках экспрессии собственных генов Oct4 и Nanog [47, 49]. На многих видах млекопитающих показано, что при работе с плюрипотентными клетками пред почтительнее использовать среду с добавлениемм KSR, а не FBS [10, 13, 15, 16, 60]. Однако при репро граммировании фибробластов обыкновенных полёвок к плюрипотентному состоянию получить первичные колонии клеток удалось только на средах, содержа щих не менее 7% FBS. Кроме того, замещение в куль туральной среде FBS на KSR вызывает дифферен цировку полученных ИПСК обыкновенных полёвок даже в присутствии факторов роста. Присутствие в культуральной среде mLIF, bFGF, аскорбиновой кислоты, а также FBS необходимо для поддержания самообновления и плюрипотентно сти ИПСК обыкновенных полёвок. Удаление любого из этих компонентов приводит к запуску дифферен цировки. Полученные стабильные линии ИПСК обыкновен ных полёвок имеют характерные свойства плюри потентных клеток. Они обнаруживают активность ЩФ и экспрессируют эндогенные транскрипцион ные факторы Nanog, Oct4, Sox2, Esrrb и Sall4, ко торые необходимы для поддержания ПСК в не дифференцированном состоянии [64-68]. При этом промоторная область гена Oct4 в ИПСК гипометили рована сильнее, чем в эмбриональных фибробластах. Полученные линии плюрипотентных клеток обык новенных полёвок способны неограниченное время самообновляться и дифференцироваться in vitro в производные трех первичных зародышевых лист ков. Тем не менее, в отличие от ИПСК M. ochrogaster, стабильные линии клеток обыкновенных полёвок с индуцированной плюрипотентностью не поддер живают в процессе культивирования экспрессию SSEA1, а также не экспрессируют KLF4. Вероятно, это может быть связано с тем, что в поддержании плюрипотентности в ИПСК M. ochrogaster и обык новенных полёвок участвуют разные сигнальные каскады. Экспрессия SSEA1 и KLF4 характерна для ПСК, в которых ключевой сигнальный каскад, обеспечивающий плюрипотентность, запускается цитокином LIF, и варьирует либо отсутствует в ПСК, плюрипотентность которых поддерживается с помо щью сигнального каскада, активируемого bFGF [61, 69-71]. Так, линии плюрипотентных клеток, полу чаемые из постимплантационных эмбрионов мыши, в присутствии bFGF не экспрессируют KLF4, в от личие от ЭСК и ИПСК, культивируемых с LIF [71, 72]. ПСК овцы, макаки и человека, получаемые в при сутствии bFGF, не обнаруживают поверхностного антигена SSEA1 [8, 15, 61, 69]. Отмечают, что плюри потентные клетки, поддерживаемые за счет bFGF, имеют более плоскую морфологию и медленнее де лятся [8, 72]. Эти два свойства bFGF-зависимых плю рипотентных клеток характерны для линий ИПСК обыкновенных полёвок. Судить же о том, насколько полно полученные ИПСК M. ochrogaster и обыкно венных полёвок отражают свойства плюрипотентных клеток своих видов, пока невозможно: как у степной, так и у обыкновенной полёвки отсутствуют линии ЭСК, служащие эталоном плюрипотентности. Ничего не известно также о свойствах плюрипотентных кле ток пре- и постимплантационных эмбрионов данных видов in vivo. Итак, технология репрограммирования с помощью повышенной экспрессии четырех транскрипционных факторов OSKM впервые позволила получить ИПСК обыкновенных полёвок, линии плюрипотентных кле ток которых до настоящего времени не удавалось ввести в культуру. Полученные линии планируется использовать для изучения процессов раннего раз вития и генов плюрипотентности у обыкновенных полёвок. Мы надеемся, что опыт, полученный в ходе данной работы, позволит в дальнейшем разработать более эффективные подходы к репрограммированию соматических клеток обыкновенных полёвок и выде лить ЭСК из ранних предымплантационных бласто цист и герминальных клеток данных грызунов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данном исследовании получены ИПСК гибридов обыкновенных полёвок M. levis × M. arvalis в сре де, содержащей цитокин LIF, bFGF, аскорбиновую кислоту и FBS. Полученные в этих условиях ИПСК обыкновенных полёвок способны к самообновлению, экспрессируют гены плюрипотентности Oct4, Nanog, Sox2, Sall4, Esrrb, при дифференцировке in vitro об разуют производные трех первичных зародышевых листков. Результаты нашей работы позволят оценить разнообразие и видоспецифические особенности спо собов индукции и поддержания плюрипотентных клеток у разных видов млекопитающих.

Об авторах

E. В. Григорьева

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения РФ

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

A. И. Шевченко

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения РФ

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

С. П. Медведев

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения РФ; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

Н. A. Мазурок

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения РФ

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

A. И. Железова

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН

Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

С. M. Закиян

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения РФ; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: zakian@bionet.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы