Молекулярный механизм действия Ноопепта - замещенного Pro-Gly-дипептида

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Ноопепт (этиловый эфир N-фенилацетил-L пролилглицина) разработан в качестве лекар ственного средства в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова. Синтез препарата основан на оригиналь ной гипотезе пептидного дизайна, согласно которой с использованием соответствующих аминокислот воспроизводятся структуры, близкие к известным психотропным средствам [1]. Непептидным про образом Ноопепта был ноотропный препарат Пирацетам. Фармакологическая активность нового соединения оказалась в целом сходной с активностью Пирацетама, однако она проявлялась в дозах в 1000 раз более низких [2, 3]. Кроме того, у Ноопепта более выражены анксиолитические [4] и нейропротектив ные свойства [5-7]. Клиническое изучение Ноопепта (ЛС 015770) под твердило обнаруженные в эксперименте его ноотропные эффекты. У больных с мягкими когнитивными нарушениями цереброваскулярного и посттравма тического генеза препарат ослаблял когнитивные на рушения, проявлял анксиолитическое и вегетостаби лизирующее действие (www.noopept.ru). Механизм действия Ноопепта изучается со вре мени его синтеза. Установлено, что препарат уси ливает экспрессию NGF и BDNF в гиппокампе [8], проявляет холино-позитивные свойства на по веденческом и нейрональном уровне [9], ослабля ет окислительный стресс и усиливает активность антиоксидантных систем [7, 10], вызывает угнете ние индуцируемых стрессом киназ pSAPK/JNK и pERK1 [11]. Однако изучение первичных взаимо действий Ноопепта более чем со 100 известными ре цепторными образованиями, выполненное согласно нашему протоколу компанией CEREP (Франция), не привело к ожидаемому выявлению первичных мишеней. Вместе с тем, обнаруженный широкий спектр нейрохимических и фармакологических эф фектов Ноопепта определил необходимость даль нейшего поиска его мишеней. С целью получения более полной информации о мишенях Ноопепта мы проанализировали in vitro влияние препарата на ДНК-связывающую актив ность фармакологически значимых биомишеней - транскрипционных факторов (ТФ) CREB, NFAT, NF- κB, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1, HIF-1. Выявив избирательное влияние Ноопепта на HIF-1, мы из учили эффект препарата на активность этого транс крипционного фактора в условиях моделируемой ги поксии in vitro. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Культивирование клеток В работе использовали клетки линии HEK293 (пе ревиваемые клетки почки эмбриона человека; Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки культи вировали при 37°С, 5% CO2 в среде DMEM («Биолот», Россия), содержащей 10% эмбриональной теля чьей сыворотки (Sigma, США), 2 мM L-глутамин, 50 мкг/мл гентамицина сульфата, 2.5 мкг/мл амфо терицина B («ПанЭко», Россия). Влияние Ноопепта на ДНК-связывающую актив ность транскрипционных факторов изучали с ис пользованием люциферазных репортерных кон струкций, содержащих сайты связывания CREB, NFAT, NF-κB, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1 и HIF-1 в соответствии с [12]. Для проведения трансфекций клетки линии HEK293 рассаживали по 4 × 103 клеток в лунки 96-луночных планшетов в 100 мкл среды DMEM без антибиотика, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM L-глутамин. Репортерные векторные конструкции, содержащие сайты связы вания транскрипционных факторов CREB, NFAT, NF-кB, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1 и HIF-1, по лучены на основе плазмидного вектора pTL-Luc (Panomics, США; несет ген люциферазы Photinus pyralis) [13]. Клетки HEK293 транзиентно трансфи цировали данными конструкциями с помощью ре агента Липофектамин 2000 (Invitrogen, США) со гласно рекомендациям изготовителя. Через 6 ч после трансфекции среду заменяли средой с антибиоти ком (DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворот ки, 2 мM L-глутамин, 50 мкг/мл гентамицина суль фата) и через 18 ч добавляли изучаемые препараты (Ноопепт, 10 мкМ; Пирацетам, 1 мМ). Клетки инку бировали в присутствии Ноопепта или Пирацетама в течение еще 24 ч. Люциферазную активность в клеточных лизатах определяли с помощью набо ра Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, США) на планшетном анализаторе 2300 EnSpire® Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, США). В ка честве внутреннего контроля трансфекции приме няли котрансфекцию с плазмидой pRL-TK (Promega, США), кодирующей ген люциферазы Renilla reniformis. Значения люминесценции P. pyralis нор мировали по люминесценции R. reniformis в каждом измерении. Экспериментальное моделирование гипок сии осуществляли с использованием СоCl2, кото рый вызывает стабилизацию HIF-1, т.е. является фармакологическим индуктором гипоксии [14]. Люциферазная конструкция для анализа актив ности HIF-1 содержит четыре копии консенсусной последовательности 5’-ACGTG-3’ - сайта связыва ния белка HIF-1 (конструкция HIF-1-Luc). Клетки, трансфицированные плазмидным вектором HIF- 1-Luc, предварительно инкубировали с Ноопептом в течение 8 ч (конечные концентрации 1, 10, 100 мкМ; двукратное внесение через каждые 4 ч), да лее вносили индуктор гипоксии CoCl2 в рабочей концентрации 50 мкМ и продолжали совместную инкубацию Ноопепта и CoCl2 в течение 16 ч, по сле чего люциферазную активность определяли как описано выше. Статистический анализ Среднее арифметическое значений, полученных по двум повторам в трех независимых эксперимен тах, и стандартную ошибку среднего рассчитывали с помощью программы Statistica 6.1 (StatSoft. Inc., США). Экспериментальные группы сравнивали с ис пользованием парного t-критерия Стьюдента для за висимых выборок. Молекулярный докинг Для построения и валидации модели докинга ис пользовали данные о трехмерной структуре белка мишени - пролилгидроксилазы 2 (PHD2; hypoxiainducible factor-L-proline, 2-oxoglutarate:oxygen oxidoreductase [КФ 1.14.11.29]; код PDB: 2G19) - в комплексе с «нативным» ингибитором (код ZINC: 24800213; IC50 1.4 мкМ) [15, 16]. В качестве лигандов рассматривали: Ноопепт и его D-энантиомер (коды ZINC: 1542824 и 3812682 соответственно); метабо лит Ноопепта L-N-фенилацетилпролин (код ZINC: 76075), а также стереоизомеры описанного ранее [31] ингибитора пролилгидроксилазы (шифры РА2L и РА2D) (таблица). Геометрические параметры большинства молекул извлечены из базы данных ZINC [17] или смоделированы с помощью програм мы ChemCraft v1.7 [18] и оптимизированы методом HF/6-311G(d,p) в программе GAUSSIAN 09 C.01 [19]. Подготовка структур мишени и лигандов к докингу, как и все процедуры докинга, проведены с помощью программы LeadIT 2.1.8 [20]. Все квантово-химиче ские расчеты проведены на кластерном суперком пьютере Уфимского института химии РАН. Область окружения «нативного» ингибитора (ZINC: 24800213) соседними аминокислотными остат ками составляет 6.5 Å и содержит Arg383, Tyr310, Tyr303 и Fe2+. Анализ активного центра фермента 2G19 показал, что Arg383 и Tyr329 образуют водо родные связи с карбоксильной группой «нативного» ингибитора ZINC 24800213; Tyr310 и Tyr303 форми руют π-π-электронное взаимодействие с аромати ческими кольцами этого лиганда. Аминокислотные остатки Trp389, Trp258, Met299 и Ile256 образуют гидрофобный карман (рис. 1). При подготовке струк туры фермента к процедуре докинга из активного центра удалили все молекулы воды. Редокинг «на тивного» лиганда в активный сайт фермента PHD2 точно воспроизводит способ связывания лиганда и фермента, определенный кристаллографически. Среднеквадратичное отклонение составляет 0.44 Å. Подпрограмма FlexX [21] позволяет провести проце дуру докинга лигандов (таблица) и оценить энергию связывания лиганда и рецептора в активном сайте. Количество докинг-решений может быть большим, и выбор оптимального решения основывается на ми нимальном значении энергии связывания в совокуп ности с минимальным значением среднеквадратич ного отклонения (RMSD) позиции лиганда в сайте связывания. Далее выбранная позиция подвергается еще одному этапу расчета: оценке энергии сродства лиганда с сайтом связывания (ΔGHYDE, кДж/моль) и оценке эффективности лиганда [22, 23]. Подробный алгоритм расчета описан в работе [22]. Отмечается, что оптимальным является использование двух по следовательных этапов выбора соединения-лидера среди лигандов. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Данные, представленные на рис. 2А, свидетель ствуют о том, что инкубация с Ноопептом в кон центрации 10 мкМ в течение 24 ч увеличива ла ДНК-связывающую активность HIF-1 на 43% и не вызывала статистически значимых изменений ДНК-связывающей активности факторов CREB, NFAT, NF-κB, p53, STAT1, GAS, VDR и HSF1. Как следует из данных, представленных на рис. 3, Ноопепт в концентрации 10 и 100 мкМ увеличивал уровень индукции люциферазы. С использовани ем препарата сравнения показано, что Пирацетам ни в эквимолярной (10 мкМ, данные не представ лены), ни в более высокой концентрации (1 мМ) не вызывает статистически значимых изменений ДНК-связывающей активности изученных транс крипционных факторов (рис. 2Б). На следующем этапе работы анализировали влияние Ноопепта на ДНК-связывающую актив ность HIF-1 в присутствии фармакологического миметика гипоксии СоCl2. В полном соответствии с опубликованными данными на фоне действия CoCl2 наблюдали повышение активности HIF-1. Добавление Ноопепта в концентрации 10 и 100 мкМ приводило к дополнительному увеличению HIF-1 зависимой люциферазной активности (рис. 3). Таким образом, впервые установлено, что Ноопепт обладает способностью увеличивать как базальную, так и ин дуцированную фармакологическим миметиком ги поксии активность HIF-1 in vitro. Фактор, индуцируемый гипоксией (HIF-1), яв ляется гетеродимером, состоящим из двух субъе диниц - чувствительной к кислороду субъединицы HIF-1α и конститутивно экспрессирующейся HIF-1β. Гипоксия способствует возрастанию уровня HIF-1α, его димеризации с HIF-1β, мобилизации коактива торов (р300/СВР) и связыванию этого комплекса с элементом HRE (hypoxia-response element) в ре гуляторных областях генов-мишеней. В нормокси ческих условиях зависимое от кислорода гидрок силирование остатков пролина в молекуле HIF-1α пролилгидроксилазами необходимо для связывания компонентом убиквитин-протеин-лигазы Е3 - бел ком Гиппеля-Линдау (VHL). Убиквитинилированный HIF-1α становится мишенью для деградации 26S протеасомами. В присутствии кислорода остаток аспарагина в С-концевом трансактиваторном домене (C-TAD) HIF-1α гидроксилируется аспарагингидрок силазой (FIH1, factor inhibiting HIF-1), что блокирует его взаимодействие с коактиватором транскрипции p300/CBP. Таким образом, при нормоксии PHD и FIH инактивируют HIF-1α, подавляя зависимую от HIF-1 экспрессию генов-мишеней. В условиях гипоксии активность PHD и FIH снижается, что приводит к уменьшению деградации HIF-1α и запуску транс крипции зависимых от него генов [24]. Показано [25], что HIF-1 активирует в общей сложности до 100 ге нов. На рис. 4 представлены основные мишени HIF-1, к числу которых относятся гены, вовлеченные в про цессы ангиогенеза за счет активации фактора роста эндотелия сосудов, усиления синтеза эритропоэтина, активации систем транспорта глюкозы через мем браны, цитопротекции нейротрофическими фактора ми, нормализации клеточного цикла и метаболизма на уровне митохондрий, в том числе активности ан тиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы и каталазы. Совокупность этих эффектов обеспечи вает осуществление адаптивной реакции на гипок сическое воздействие. Наряду с этим HIF-1 влияет на состояние многих нейротрансмиттерных систем - он активирует белок, контролирующий рецепторы ГАМК (GABARBP) [26], повышает активность тиро зингидроксилазы [27]. Описаны тесные взаимоотно шения HIF-1 с холинорецепторами [28]. Как показано в нашей работе, Ноопепт вызывает зависимое от концентрации увеличение базальной ДНК-связывающей активности HIF-1. При стаби лизации HIF-1 с помощью СоCl2, химического ин дуктора этого транскрипционного фактора [29, 30], Ноопепт обеспечивает дополнительное нарастание ДНК-связывающей активности HIF-1. Эффект в отношении HIF-1 специфичен для Ноопепта: класси ческий ноотропный препарат Пирацетам не влияет на активность данного транскрипционного фактора. Ноопепт увеличивает ДНК-связывающую актив ность только HIF-1, тогда как активность других транскрипционных факторов (CREB, NFAT, NF-κB, p53, STAT1, GAS, VDR и HSF1) не повышается. Поскольку пролилгидроксилаза непосредственно участвует в деактивации HIF-1, а аналоги пролина описаны как эффективные ингибиторы этого фер мента [31], можно предположить, что увеличение ДНК-связывающей активности HIF-1 при действии Ноопепта связано с ингибированием этого фермента. Сопоставление структуры ингибиторов пролил гидроксилазы, представленных в работе Ma и соавт. [31], и метаболитов Ноопепта позволяет сделать вы вод о сходстве соединения РА2 (бензилоксикарбо нилпролин) с N-концевым фрагментом молекулы Ноопепта - N-фенилацетилпролином (таблица) [32, 33]. Следует принять во внимание, что диапазон кон центраций, в которых РА2 угнетает пролилгидрок силазу (Ki = 2.38 мкM, EC50 = 3.17 мкM) [31], близок к выявленному нами уровню эффективных концен траций для Ноопепта. Согласно результатам молекулярного докинга Ноопепт и L-изомер N-фенилацетилпролина свя зываются с активным центром пролилгидроксилазы с эффективностью, сопоставимой с эффективностью L-изомера РА2L (таблица). Качественная оценка эффективности лиганда оценивается как высокая. L-стереоизомер N-фенилацетилпролина в актив ном сайте фермента формирует водородные связи с Arg383 и Tyr329, а молекула PA2L координирует ся атомами кислорода вокруг атома железа (рис. 5). Интересно отметить, что фармакологически не активный D-изомер Ноопепта имеет более низкую энергию связывания. Таким образом, можно пред положить, что Ноопепт и его метаболит - L-изомер N-фенилацетилпролина, могут связываться с ак тивным сайтом пролилгидроксилазы 2 и, возмож но, ингибировать ее ферментативную активность. Очевидно, что для окончательного заключения требуется экспериментальное изучение действия Ноопепта и его метаболита на активность пролилги дроксилазы. Дополнительного изучения также тре бует возможное взаимодействие Ноопепта с аспара гингидроксилазой. Возвращаясь к вопросу о взаимодействии Ноопепта с HIF-1 (при отсутствии такого взаи модействия у Пирацетама), следует отметить, что Ноопепт сконструирован в качестве дипеп тидного аналога Пирацетама. Однако эффектив ные дозы Ноопепта на три порядка меньше, чем у Пирацетама [2]. Новый препарат и его непептидный прообраз различаются и по спектру фармакологи ческой активности. Так, Ноопепт облегчал все фазы процессинга информации, а Пирацетам влиял пре имущественно на начальные фазы [1]. Ноопепт про являет выраженные нейропротективные свойства, тогда как у Пирацетама они, в зависимости от оце ниваемого показателя, либо слабо выражены [7, 34], либо отсутствуют [35]. С фармакологических позиций такие различия должны иметь в своей основе осо бенности механизма действия, к которым можно от нести обнаруженный нами эффект взаимодействия Ноопепта с HIF-1. Независимо от деталей указанного взаимодей ствия важно, что этот пролинсодержащий дипеп тид повышает активность HIF-1. Известно, что ак тивация системы HIF рассматривается в настоящее время как один из основных механизмов нейропро текции при гипоксии, ишемии мозга, нейродегене ративных заболеваниях [24, 36]. В ходе многолет него изучения именно эти состояния определили в качестве фармакологических мишеней действия Ноопепта на широком наборе соответствующих экс периментальных моделей. Вслед за способностью Ноопепта повышать вы живаемость животных в условиях гипербарической гипоксии [37], выявленной в самом начале изучения этого дипептида, было показано, что он уменьшает величину очага ишемического повреждения моз га на моделях циркуляторной гипоксии, например, кортикального фотоиндуцированного тромбоза [6] и перевязки среднемозговой артерии [5]. Способность Ноопепта ослаблять выраженность окислительного стресса установлена как на нейрональных культу рах различного типа: зернистых клетках мозжеч ка [35], культуре кортикальных нейронов аборти рованных плодов с диагностированным синдромом Дауна [7], культуре PC12 [38] и культуре SH-SY5Y [39], так и в условиях целого организма в экспери менте на мозговой ткани и плазме крови крыс [40]. Рис. 5. Результаты мо лекулярного докинга: расположение лигандов в активном сайте про лилгидроксилазы (водо родные связи показаны пунктирной линией) 76075 PA2_L Tyr310 Tyr303 Arg383 Tyr329 Tyr310 Tyr303 Arg383 Tyr329 Fe2+ Fe2+ Способность усиливать активность супероксиддис мутазы и каталазы показана как в эксперименте [10], так и в клинических условиях [34]. На моделях болезни Альцгеймера выявлена спо собность Ноопепта не только устранять проявления когнитивного дефицита [41], но и оказывать нейро протективное действие, приводящее к ослаблению нарушений окислительных процессов и кальциево го гомеостаза, усилению нейрогенеза, предупреж дению агрегации тау-белков, вызванной фрагмен том β-амилоида25-35 [38], устранению дефицита NGF и BDNF на фоне введения в желудочки мозга диа бетогенного токсина стрептозотоцина [42]. Ноопепт способен уменьшать цитотоксический эффект агре гированного α-синуклеина на клеточной модели пар кинсонизма [39]. Все эти многочисленные эффекты могут быть объяснены активацией транскрипцион ного фактора HIF-1. За последние годы нами показано, что Ноопепт оказывает антидиабетическое действие на модели стрептозотоцинового диабета [43]. Этот факт трак товался нами как результат многофакторного ме таболического действия препарата - ослабления свойственного диабету дефицита антиоксидант ных систем и нейротрофических факторов, уси ленной продукции провоспалительных цитокинов [44]. Полученные в настоящей работе результаты привлекли наше внимание к данным о роли HIF-1 в развитии патологических процессов при сахарном диабете. Так, сообщается о способности инсулина на рушать образование HIF-1 и о роли дефицита это го фактора в развитии сахарного диабета типа 1 и 2, а также его осложнений [45]. Нарушение функции систем транспорта глюкозы GLUT1 и GLUT3 через клеточные барьеры, наблюдаемое при дефиците HIF- 1, способствует развитию резистентности к инсулину как при болезни Альцгеймера, так и при сахарном диабете [46]. Доказано участие HIF-1 в экспрессии инкретинов - важнейших факторов цитопротекции β-клеток поджелудочной железы [47]. Совокупность этих данных позволяет предположить, что в реали зации антидиабетического эффекта Ноопепта, в том числе в выявленной нами недавно способности этого препарата повышать уровень инкретина - глюкаго ноподобного пептида-1 (ГПП-1) [44], участвует его HIF-1-позитивный эффект. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные в настоящей работе данные о способ ности эффективного ноотропного и нейропротек тивного препарата Ноопепт вызывать увеличение ДНК-связывающей активности HIF-1 позволяют по-новому трактовать широкий спектр его действия, а именно, считать, что HIF-1-позитивный эффект препарата можно рассматривать как первичный ме ханизм его действия. Уточнение молекулярных ме ханизмов, лежащих в основе HIF-1-позитивного дей ствия Ноопепта, безусловно, требует дальнейшего исследования, но наличие этого эффекта, несомнен но, имеет важное значение, поскольку позволяет объяснить практически все известные на сегодняш ний день эффекты Ноопепта и, возможно, других биологически активных Pro-Gly-пептидов. Эти дан ные предоставляют дополнительные доказательства в пользу современных представлений о важной роли компонентов HIF-1-зависимого сигнального пути и запускаемых этим транскрипционным фактором компенсационных процессов в механизмах нейро протекции.

Об авторах

Ю. В. Вахитова

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова; Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: juvv73@gmail.com
Россия

С. В. Садовников

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Email: juvv73@gmail.com
Россия

С. С. Борисевич

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН; Уфимский институт химии РАН

Email: juvv73@gmail.com
Россия

Р. У. Островская

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова

Email: juvv73@gmail.com
Россия

T. A. Гудашева

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова

Email: juvv73@gmail.com
Россия

С. Б. Середенин

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова

Email: juvv73@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы