Правила выживания: Escherichia coli в стационарной фазе

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В природе бактериальная популяция редко находит ся в благоприятных условиях, сходных с лаборатор ными условиями культивирования в богатой среде при оптимальной температуре. Влияние неблагопри ятных факторов окружающей среды, накопление токсичных отходов метаболизма при голоде, анти биотики - все это угрожает выживанию Escherichia coli и других бактерий. Для защиты от агрессивного влияния окружающей среды бактериальная куль тура способна переходить в состояние стационарной фазы, в которой происходит активация внутрен них систем защиты от стресса. Чтобы выжить в не благоприятных условиях бактериальная культура способна кардинально изменять свою организацию как на молекулярном уровне, так и на уровне клетки. Понимание процессов, происходящих в стационар ной фазе, необходимо не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения. В стационарной фазе клетки становятся на порядки более устойчи выми к воздействию антибактериальных препаратов, приобретают способность выживать даже в неверо ятно агрессивных условиях. Данный обзор посвящен основным процессам, характерным для стационарной фазы. СТАДИИ РОСТА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ Рост бактериальной культуры представляет собой процесс последовательного деления клеток, состав ляющих эту культуру, с образованием двух идентич ных дочерних клеток. Изучение выживаемости клеток E. coli при куль тивировании в течение нескольких дней выявило характерную форму кривой роста, которую можно разделить на пять фаз. Несмотря на различия в ус ловиях культивирования, измерения и даже видовых особенностей, общая форма этой кривой, за исключе нием некоторых параметров, всегда остается неиз менной (рис. 1) [1]. В момент, когда клетки попадают в питательную среду после пребывания в стационарной фазе, мож но наблюдать то, что принято называть лаг-фазой. Особенность этой фазы состоит в практическом от сутствии роста бактериальной культуры в течение некоторого времени, что можно объяснить необхо димостью в адаптации клеточного метаболизма к но вым условиям окружающей среды. Длительность этой фазы определяется не только видом бактерии, но и тем, насколько долго культура находилась в ус ловиях голода [2]. После адаптации метаболизма к новым условиям культивирования клетки начинают активное деление и входят в так называемую логарифмическую фазу роста. Так как бактериальные клетки размножаются бинарным делением, увеличение количества клеток в среде за единицу времени хорошо аппроксимиру ется экспоненциальной функцией. Характеристикой роста культуры в логарифмической фазе является время удвоения количества клеток. Стоит отме тить, что этот параметр напрямую зависит от среды культивации и сильно увеличивается при переходе от богатой среды к более бедной. Для стандартного лабораторного штамма E. coli MG1655 K-12 время уд воения при 37°С составляет около 30 мин. После исчерпания питательных веществ в окру жающей среде бактериальная культура переходит в стационарную фазу, которая характеризуется равновесием между количеством делящихся и гиб нущих клеток и выглядит как плато на кривой роста. Стоит отметить, что термин стационарная фаза от носится именно к участку на кривой роста, который характеризуется равновесием между делящимися и гибнущими клетками, а не к механизму защиты при голоде. Стационарная фаза наступает в попу ляции клеток не только из-за обеднения внешней среды, но и из-за различных стрессов. Со временем в окружающей среде культуры, находящейся в ста ционарной фазе, начинают накапливаться токсичные продукты катаболизма, что приводит к уменьшению количества клеток. Этот этап роста бактериальной культуры принято называть фазой смерти. В основе этого процесса могут лежать процессы программиру емой и случайной гибели клеток. Конец фазы смерти наступает после того, как большая часть популяции клеток погибает, и остатки питательных веществ из мертвых клеток попадают в окружающую среду. Уцелевшие клетки могут использовать эти вещества для своего выжива ния, что приводит бактериальную культуру в состо яние долговременной стационарной фазы, которая может поддерживаться в течение нескольких недель и даже месяцев. Одна из характерных особенностей долговременной стационарной фазы - циклическое увеличение и снижение титра жизнеспособных кле ток в популяции. Этот феномен, названный GASP фенотипом (Growth Advantage in Stationary Phase), объясняется появлением мутантных клеток, более приспособленных к росту в данных условиях, чем ро дительский штамм [3]. ИЗМЕНЕНИЯ В СТРУКТУРЕ И ТОПОЛОГИИ ДНК Геномная ДНК E. сoli представлена одной кольце вой хромосомой, которая образует в цитоплазме бактерии структуру, называемую нуклеоидом. В со став нуклеоида входят также белки (регуляторные и структурные) и РНК [4]. За поддержание структуры нуклеоида отвеча ет множество белков, экспрессия которых зависит от фазы роста бактериальной культуры. Наиболее значимыми структурными белками нуклеоида счи таются IHF, HU, Dps, Fis и H-NS. Активная форма H-NS представляет собой димер, для которого характерно наличие двух противопо ложно направленных ДНК-связывающих доменов, что позволяет белку служить «мостиком» между двумя дуплексами ДНК. H-NS не обладает специфичностью к определенным нуклеотидным после довательностям, но проявляет большее сродство к изогнутой, нежели к линейной ДНК [4]. В логариф мической фазе роста в клетке на 1 молекулу H-NS приходится 1400 п.н. ДНК [5]. Клеточный фактор интеграции (IHF) представ ляет собой гетеродимерный белок, проявляющий специфичность к консенсусным участкам ДНК дли ной примерно 30 п.н. Связывание IHF с ДНК приво дит к ее изгибу, который стабилизируется взаимо действием отрицательно заряженного остова ДНК и преимущественно положительно заряженной по верхностью белка. Показано, что связывание IHF мо жет приводить к снижению длины ДНК на 30% [4]. Экспрессия IHF максимальна в стационарной фазе, когда на 1 молекулу белка приходится 335 п.н. геном ной ДНК [5]. Вероятно, IHF отвечает за организацию структуры нуклеоида в ранней стационарной фазе. Гистон-подобный гомодимерный белок HU со стоит либо из двух субъединиц HUα, либо из двух HUβ. HU проявляет высокое (40%) структурное сходство с белком IHF. HU неспецифично связы вает ДНК, но при этом имеет предпочтение к су перскрученным и неупорядоченным формам ДНК. Похоже, что HU способен вызывать и стабилизиро вать изгиб двойной спирали ДНК с самыми разнообразными углами поворота. Случайное связывание HU приводит к большому числу «подвижных» из гибов ДНК (с углами изгиба до 180°), что, в конечном счете, способствует уменьшению длины линейной ДНК на 50% [4]. Содержание HU наиболее велико в клетке во время логарифмической фазы, где оно составляет примерно 1 молекулу белка на 550 п.н. ДНК [5]. Фактор стимуляции инверсии (Fis) представля ет собой гомодимерный ДНК-связывающий белок, способный распознавать определенные консенсус ные последовательности длиной 15 п.н., однако может эффективно связывать ДНК и в случайных участках. Связывание Fis приводит к изгибанию ДНК на 50-90°. Многие сайты связывания Fis находятся в промотор ных участках оперонов, связывание белка в которых играет регуляторную роль. Предполагается, что Fis служит «сенсором» суперскрученности ДНК. В зави симости от топологии ДНК Fis проявляет способность к ингибированию экспрессии гена ДНК-гиразы [4]. Fis - один из наиболее представленных в логариф мической фазе структурных белков нуклеоида, со держание которого достигает 1 молекулы на 450 п.н. ДНК [5]. В стационарной фазе нуклеоид становится бо лее конденсированным, что позволяет защищать ДНК от повреждений. Этот механизм реализуется при помощи белка Dps (ДНК-связывающий белок из голодающих клеток), который способен неспецифично связывать ДНК и активен именно в периоды голода [6]. При окислительном стрессе в логариф мической фазе экспрессия гена, кодирующего этот белок, находится под контролем σ70-субъединицы РНК-полимеразы и белка OxyR, в периоды голода - регулируется σ38-субъединицей [7]. После индукции синтеза в стационарной фазе Dps становится наи более представленным белком в клетках E. coli [7]. Мономеры Dps способны образовывать додекамеры в форме колец, которые связываются с ДНК в при сутствии ионов магния и способствуют образованию высокоупорядоченного и стабильного нуклеопро теидного комплекса, названного «биокристалл» [8]. Именно образование этого комплекса приводит к конденсации нуклеоида. Похоже, что глобальная защитная роль Dps в отношении различных стрес сов (голод, окислительный стресс, УФ-излучение и радиоактивность, тепловой стресс и экстремальные значения pH) осуществляется за счет комбинации нескольких его свойств - способности конденсиро вать ДНК, хелатировать ионы железа и проявлять ферроксидазную активность, а также за счет способ ности регулировать экспрессию генов [6, 9]. Еще один белок, способствующий защите ДНК от повреждений в стационарной фазе, - CbpA (Curved DNA binding protein). В логарифмической фазе CbpA отсутствует в клетках, однако при насту плении стационарной фазы его количество возрас тает до 10000 копий на одну клетку. Транскрипция гена cbpA также зависит от σ38-субъединицы РНК полимеразы [5]. CbpA связывает ДНК в форме димера, что приво дит к ее компактизации. В комплексе с этим белком ДНК защищена от деградации эндодезоксирибону клеазами in vitro [10]. Структурные белки нуклеоида прямо влияют не только на структуру бактериальной хромосомы, они активно участвуют в регуляции экспрессии ге нов. Стоит отметить, что эти белки выполняют сход ные функции по компактизации и защите ДНК от по вреждений, и преобладание каждого из них в клетке зависит от фазы роста (рис. 2). Однако за счет раз личий в механизмах и способах компактизации ис пользование того или иного структурного белка ну клеоида позволяет клетке адаптироваться, облегчая доступ к ДНК в благоприятных условиях и макси мально защищая генетический материал при стрессе. Недавно было показано, что метилирование остат ков цитозина в бактериальной ДНК может вли ять на регуляцию синтеза белков в стационарной фазе. При изучении штамма с нокаутом гена ДНК метилтрансферазы Dcm установлено, что в нем заметно повышен синтез белков стационарной фазы и, в частности, белка σ38-субъединицы РНК полимеразы [11]. РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ В СТАЦИОНАРНОЙ ФАЗЕ σ38 - сигма-фактор стационарной фазы Транскрипция - один из центральных и жизненно необходимых процессов, в ходе которого на ДНК матрице происходит синтез РНК. Эта реакция ката лизируется РНК-полимеразой. У бактерий инициацию транскрипции осущест вляет холофермент РНК-полимеразы, в состав ко торого входит кор из субъединиц α2ββ’ω, содержа щий активный центр и выполняющий функцию синтеза РНК, и фактор инициации - σ-субъединица, или σ-фактор. Для образования активного холо фермента, способного синтезировать РНК, к РНК полимеразе должна присоединиться σ-субъединица, которая отвечает за распознавание промотора [12]. Известно, что геном E. coli кодирует семь различных σ-факторов (таблица), каждый из которых способен распознавать лишь определенную группу промото ров. Именно σ-субъединица является главным кле точным регулятором транскрипции. Использование различных σ-факторов позволяет клетке кардиналь но изменить свой транскриптом в ответ на различные сигналы. В условиях стационарной фазы бактериальная клетка оказывается перед необходимостью регули ровать транскрипцию таким образом, чтобы акти вировать экспрессию генов, требующихся для вы живания в условиях стресса и голода, и подавить транскрипцию «лишних» генов. С этой целью в клет ках E. coli используется σ38(σS)-фактор, кодируемый геном rpoS, который выступает в роли главного регу лятора транскрипции в ответ на различные стрессы. Полногеномный анализ экспрессии генов, зависимых от σ38-фактора, показал, что σ38 прямо или косвен но регулирует транскрипцию примерно 10% генов E. coli [20]. σS-фактор отвечает за транскрипцию генов, уча ствующих в стрессовом ответе и вторичном ме таболизме. Большая часть генов, регулируемых σ38-субъединицей, подвержена дополнительной ре гуляции. Именно этот фактор необходим для пере хода бактериальной культуры в стационарную фазу. Известны некоторые σ38-зависимые гены, экспрес сия которых максимальна в момент перехода куль туры из экспоненциальной в стационарную фазу ро ста [14]. σS-фактор является гомологом основного кле точного сигма-фактора - σ70, который отвечает за транскрипцию генов домашнего хозяйства и об ладает наибольшим сродством к РНК-полимеразе. Показано, что σ38-субъединица способна узнавать те же консенсусные последовательности, что и σ70, самые значимые из которых - элементы -10 и -35. Предполагается, что различие между промоторами, которые узнаются этими сигма-факторами, состо ит в одиночных заменах оснований в районе кон сенсусных гексамеров, т.е. специфичность σ38 может определяться именно незначительным отклоне нием последовательности гексамера от консенсус ной [21]. Сообщается также о предпочтении σ38-РНК полимеразой промоторов с неоптимальными для σ70 последовательностями в области между элементами -10 и -35 [22]. Основываясь на известных последо вательностях промоторов, показали, что узнавание промотора σ38-РНК-полимеразой улучшается в при сутствии AT-богатого участка в положениях -10…+1 от точки начала транскрипции [14]. Экспрессия σ38-субъединицы подвержена сложной регуляции на всех уровнях (транскрипции, транс ляции, активности фактора, стабильности самого σ38 и его мРНК), что, очевидно, позволяет усилить чув ствительность ответа клетки на самые разнообраз ные стрессовые сигналы (рис. 3). Транскрипция rpoS репрессируется фосфорили рованной формой регулятора ArcA [23], комплекс сАМР-CRP также репрессирует транскрипцию [24]. Белок BarA необходим для индукции экспрес сии в логарифмической фазе роста [25]. Сигнальная молекула ppGpp позитивно влияет на базальный уровень синтеза σS [26]. При переходе из логариф мической в стационарную фазу экспрессия rpoS уве личивается на порядок [24]. Показано, что на вторичную структуру, стабиль ность и способность мРНК rpoS к трансляции вли яет множество факторов. мРНК гена rpoS содер жит длинную 5’-НТО [27], которая играет важную роль в регуляции трансляции и стабильности этой мРНК. Регулятор H-NS связывается с мРНК и спо собствует ее деградации [28]. В свою очередь, малая РНК DsrA стабилизирует ее и способствует инициа ции трансляции за счет разворачивания вторичной структуры мРНК в районе сайта посадки рибосо мы [29]. Белок Hfq необходим для трансляции мРНК rpoS [30], а малая РНК OxyS репрессирует транс ляцию σS-субъединицы, скорее всего, за счет изме нения активности Hfq [31]. Малая РНК RprA и бе лок HU стимулируют трансляцию σ38-субъединицы. При недостатке фосфора наблюдается аккумуляция σS вследствие увеличения количества мРНК rpoS. Белок LrhA совместно с Hfq способен репрессиро вать трансляцию мРНК rpoS [32]. Известно, что 6S РНК активирует транскрип цию с некоторых σS-зависимых промоторов, никак не влияя на уровень экспрессии rpoS [33]. Сигнальная молекула ppGpp усиливает способность σS вытеснять σ70 из минимального фермента РНК-полимеразы [34]. Показано, что белок Rsd выполняет сходную функ цию [35]. Нехватка азота приводит к экспрессии ге нов, регулируемых σS, однако, уровень экспрессии самой субъединицы возрастает при этом лишь в 2 раза, т.е., по-видимому, азотный голод влияет скорее на активность самого сигма-фактора, а не на его экс прессию [36]. Фактор сборки РНК-полимеразы Crl увеличивает активность σS, влияя на его способность к связыванию с РНК-полимеразой [37]. В логарифмической фазе роста действует систе ма деградации σS-субъединицы, основанная на энер гозависимой протеазе ClpXP, которая моментально расщепляет фактор σS при избытке энергии в клет ке [38]. В качестве фактора-помощника ClpXP высту пает белок RssB, необходимый для быстрого протео лиза σS. RssB отводится роль узнавания σS-фактора. Поли(А)-полимераза, белки IraP, IraM, H-NS и Crl усиливают эффект RssB [37, 39-41]. Транскрипция rssB находится под контролем σS. Нехватка источни ков углерода приводит к накоплению сигма-фактора из-за увеличения его стабильности. Молекулярный механизм этого процесса не исследован [42]. Подводя итог, следует отметить, что активная экс прессия rpoS наблюдается в ответ на резкие неблаго приятные изменения условий окружающей среды. При этом сложная система регуляции экспрессии этого гена и моментальная деградация σS в опти мальных условиях роста позволяют клетке опера тивно изменить транскрипционный профиль в ответ на стресс и быстро вернуться к использованию σ70 по окончании неблагоприятных условий. Некоторые регуляторы транскрипции в стационарной фазе Регуляция транскрипции в стационарной фазе не ограничивается сменой сигма-фактора. Для изме нения экспрессии отдельных генов в бактериальной клетке существует большое количество регуляторов, специфичных для стационарной фазы. Один из таких регуляторов - высококонсерватив ный бактериальный белок Lrp (leucine-responsive regulatory protein), который может действовать и как репрессор, и как активатор транскрипции. Этот белок является одним из главных регуляторов ста ционарной фазы, воздействующим более чем на 400 генов E. coli, причем около 75% этих генов активны именно в стационарной фазе роста. Среди них встре чаются гены, продукты которых ответственны за био синтез аминокислот, катаболизм, систему транспорта питательных веществ, синтез пилей, использование различных источников углерода [43]. Основная задача Lrp - адаптация клеточного метаболизма к условиям окружающей среды. Интересно, что Lrp увеличива ет уровень анаболизма аминокислот, снижая, вместе с тем, уровень их катаболизма [44]. Экспрессия гена lrp позитивно регулирует ся при помощи сигнальной молекулы ppGpp. Связывание лейцина также может влиять на его активность. Lrp способен активировать экспрессию генов, необходимых во время голода, и репрессиро вать гены, активные в логарифмической фазе роста. Предполагается, что механизм чувствительности к голоданию основан на связывании молекул лейци на, снижение внутриклеточной концентрации кото рого может быть признаком этого состояния [45]. Мутации, нарушающие функцию ДНК связывающего домена Lrp, усиливают эффект GASP-фенотипа, в частности из-за того, что клетки с подобной мутацией способны более эффективно ус ваивать некоторые аминокислоты [3]. Не только белковые регуляторы, но и малые РНК влияют на экспрессию генов в стационарной фазе. Подобные РНК способны стимулировать трансляцию и влиять на стабильность специфичных мРНК. В ге номе E. coli обнаружено более 60 генов малых РНК, часть из которых отвечает за регуляцию стрессово го ответа. Бактериальные малые РНК представляют собой короткие РНК размером 80-100 нуклеотидов. Для активности многих из них требуется связыва ние с шапероном Hfq [46], способным образовывать комплекс с AU-богатыми участками РНК, за счет чего он может стабилизировать мРНК или, наоборот, ускорять ее гидролиз и ингибировать трансляцию. Малые РНК DsrA и RprA стимулируют трансляцию σS-фактора. В оптимальных условиях роста 5’-НТО мРНК rpoS обладает вторичной структурой, бло кирующей сайт посадки рибосом. Малые РНК DsrA и RprA способны взаимодействовать с 5’-НТО мРНК rpoS за счет комплементарных участков, что приво дит к изменению вторичной структуры мРНК и от крытию сайта посадки рибосом [47]. Другая малая РНК, OxyS, появляется при окисли тельном стрессе и репрессирует трансляцию RpoS за счет конкурентного связывания РНК-шаперона Hfq [31]. Из других малых РНК, активных в стацио нарной фазе, можно упомянуть MicA и RybB, кото рые вовлечены в регуляцию проницаемости внеш ней мембраны. Именно внешняя мембрана служит первой линией обороны при контакте с окружающей средой. Для защиты клетки от повреждений изме няется состав мембран, что позволяет клетке пере живать периоды стресса. Предполагается, что MicA и RybB вместе с Hfq являются компонентами систе мы антисмыслового ингибирования трансляции. РНК RybB контролирует экспрессию двух белков, компо нентов внешней мембраны - OmpC и OmpW. В свою очередь, малая РНК MicA вызывает деградацию мРНК белка внешней мембраны OmpA [48]. СТРОГИЙ ОТВЕТ Одним из первых механизмов регуляции экспрес сии генов у бактерий, описанных на молекулярном уровне, стало ингибирование синтеза рРНК при ами нокислотном голодании. Генетический анализ позво лил обнаружить мутацию, приводящую к отсутствию снижения синтеза рРНК в ответ на аминокислотное голодание. Эту мутацию охарактеризовали как «ос лабляющую строгость» влияния количества амино кислот на биосинтез РНК [49]. Позже было показано, что эта мутация инактивирует ген relA, кодирую щий (p)ppGpp-синтазу [50]. В дальнейшем показали, что синтез этого нуклеотидного регулятора является ответом клетки на стресс. Эта регуляторная система контролирует репликацию, трансляцию, транскрип цию и активность ферментов стрессового ответа [51]. Синтез ppGpp осуществляется двумя белка ми со сходными функциями - RelA и SpoT. RelA, или ppGpp-синтаза I, выполняет лишь функцию синтеза гуанозинтетрафосфата, тогда как SpoT про являет двойную каталитическую активность - спо собность синтезировать ppGpp (ppGpp-синтаза II) и деградировать его (ppGpp-гидролаза). Активность RelA и SpoT регулируется различными механизма ми. RelA отвечает за передачу сигнала о нехватке од ной или нескольких аминокислот, а SpoT распозна ет нехватку источников углерода, фосфора, железа или жирных кислот [3]. При обилии питательных веществ RelA находится в ассоциированной с 70S рибосомами форме. В слу чае аминокислотного голодания в клетке накаплива ется деацилированная тРНК. Такая тРНК, находясь в избытке, может попасть в А-сайт рибосомы, тогда рибосомы останавливаются, что приводит к диссоци ации комплекса RelA с рибосомой. В свободном виде RelA способен катализировать перенос пирофосфата от АТР к GTP или GDP [52]. Одна из особенностей подобного механизма состоит в том, что RelA реаги рует на недостаток одной аминокислоты, даже если другие аминокислоты присутствуют в достаточных количествах [50]. Известно, что одна бактериальная клетка содер жит очень мало молекул RelA, что долго не соотно силось с экспериментально наблюдаемой скоростью аккумуляции ppGpp при аминокислотном голоде. Был предложен механизм, согласно которому при по явлении «застрявших» рибосом, RelA теряет с ними связь. Единичный акт диссоциации сопровождается синтезом одной молекулы ppGpp. После этого сво бодный RelA способен «перепрыгнуть» на соседнюю рибосому, транслирующую мРНК. Если она также не способна вести синтез из-за деацилированной тРНК в А-сайте, то цикл повторяется, если же она активна, то RelA остается связанным на этой рибосо ме в неактивной форме (рис. 4) [52]. В благоприятных условиях роста SpoT обладает лишь гидролитической активностью по отношению к ppGpp, что приводит к отсутствию в клетке гуанозинтетрафосфата. Гидролитическая активность SpoT репрессируется при связывании с деацилиро ванными тРНК. Из-за подобного механизма актива ции SpoT обладает достаточной активностью лишь при недостатке большого числа различных амино кислот. SpoT, как полагают, ассоциирован с ацилпе реносящим белком, что позволяет ему контролиро вать количество жирных кислот в клетке. Вероятно, этот механизм позволяет ему «чувствовать» и угле родный голод [53]. При понижении концентрации жирных кислот происходит индукция синтеза ppGpp. При помощи белка-партнера DksA ppGpp способен связываться с β-субъединицей РНК-полимеразы, не посредственно влияя на сродство к различным про моторам, чем изменяет уровень экспрессии более 80 генов. Особенно важно подавление экспрессии всех компонентов системы биосинтеза белка: рРНК, рибо сомных белков и факторов трансляции [54]. ppGpp вместе с антисигма-фактором Rsd помогает σ38-субъединице конкурировать за ферментативную основу РНК-полимеразы за счет снижения сродства к ней σ70. Когда условия окружающей среды стано вятся благоприятными, восстанавливается гидроли тическая активность SpoT, уровень ppGpp снижает ся, что означает окончание строгого ответа [34]. ПРОЦЕСС ТРАНСЛЯЦИИ В СТАЦИОНАРНОЙ ФАЗЕ РОСТА E. coli Один из важнейших процессов в клетке - синтез белков, ключевым участником которого является ри босома, сложный нуклеопротеидный комплекс, спо собный синтезировать белок согласно информации, закодированной в мРНК. В стационарной фазе бак териальной культуры происходит сильное снижение уровня синтеза белка, что не вызывает удивления, поскольку трансляция считается наиболее энерго затратным процессом в клетке, и в условиях нехват ки аминокислот и других ресурсов бактериальной клетке нужно подавить трансляцию. Необходимо отметить, что процессы, влияющие на трансляцию в стационарной фазе, сильно зависят от длитель ности и глубины состояния голода. В ответ на голод активируются самые разные механизмы спасения отдельной клетки, а позже и всей бактериальной по пуляции. Механизмы защиты при незначительном голоде При исчерпании питательных веществ в клетке на капливаются деацилированные тРНК и укорочен ные мРНК. На подобных мРНК рибосомы могут «за стревать», поскольку в процессе синтеза рибосома доходит до конца мРНК и не находит стоп-кодона. Такая рибосома остается связанной с мРНК и не мо жет освободиться из-за того, что механизм терми нации трансляции зависит от наличия стоп-кодона. Подобные рибосомы могут быть «спасены» при по мощи механизма транс-трансляции. Транс-трансляция осуществляется комплексом необычной тмРНК (транспортно-матричной РНК) с небольшим белком SmpB. тмРНК состоит из двух доменов: тРНК-подобного домена (TLD) и мРНК подобного домена (MLD). Сходство TLD-домена и тРНК не только структурное, но и функциональ ное. Этот домен узнается аланин-тРНК-синтетазой, и 3’-конец тмРНК «заряжается» остатком алани на [55]. В случае появления «застрявших» рибосом со вместная работа тмРНК, SmpB и фактора элонга ции EF-Tu позволяет распознать их [56], после чего комплекс SmpB и тмРНК попадает в А-сайт рибо сомы, где SmpB принимает форму, мимикрирую щую под структуру антикодона аланиновой тРНК. Затем за счет гидролиза молекулы GTP происходит перенос пептида с тРНК в P-сайте на остаток алани на тмРНК в А-сайте, и трансляция возобновляется на матрице MLD-домена тмРНК [56]. В MLD закоди рован C-концевой пептид, сигнализирующий о необ ходимости деградации данной полипептидной цепи. В результате транс-трансляции освобождается «за стрявшая» рибосома, и потенциально вредный поли пептид деградирует под действием протеаз [57]. Другой путь спасения рибосом, дошедших до 3’-конца мРНК и не встретивших стоп-кодон, - использование белков ArfA и ArfB. Ген arfA кодиру ет короткий полипептид, состоящий из 72 аминокис лотных остатков. Функциональная форма этого белка состоит из 55 аминокислот и транслируется с укоро ченного рибонуклеазой III фрагмента мРНК. Из-за отсутствия стоп-кодона появление такого полипеп тида возможно лишь в случае нарушения механиз ма транс-трансляции. ArfA способен связываться с «застрявшей» рибосомой и рекрутировать к ней фактор терминации RF2, что приводит к отщепле нию полипептидной цепи с пептидил-тРНК и высво бождению рибосом [58]. Сходным образом действует и фактор ArfB, который способен связываться с пу стым А-сайтом рибосом и катализировать гидролиз пептидил-тРНК независимо от факторов терминации трансляции [59]. Гибернация рибосом как ответ на усиливающийся голод Синтез рибосом относится к чрезвычайно энергети чески и ресурсозатратным процессам. Именно поэто му должны существовать механизмы, позволяющие подавить трансляцию, непосильную для голодающих клеток, но сохранить при этом имеющиеся рибосомы до лучших времен. Оказалось, что механизм хранения неактивных рибосом действительно существует и представляет собой временное «выключение» рибосом. Этот про цесс, названный гибернацией рибосом, реализуется в рамках строгого ответа, когда при нехватке ами нокислот в клетке накапливаются деацилированные тРНК, что служит сигналом к синтезу молекулы ppGpp при помощи ассоциированного с рибосомами фермента RelA [52]. Именно ppGpp регулирует экс прессию генов, кодирующих белки гибернации ри босомы. Основной путь гибернации состоит в образовании из активных 70S рибосом «спящих» 100S димеров и неактивных 70S мономеров, а к основным гиберна ционным белкам E. coli относятся HPF, RMF и YfiA (рис. 5). Первые два белка отвечают за образование не активных 100S димеров. На первой стадии белок RMF связывается с областью 16S рРНК, которая взаимодействует с последовательностью Шайна-Дальгарно мРНК. Именно этот участок критически важен для инициации трансляции в клетках про кариот, и само связывание этого белка ингибирует трансляцию. Особенно важно то, что RMF не мо жет связываться с транслирующими рибосома ми, что предотвращает образование недосинтези рованных белков, которые могут быть токсичными для клетки. Связывание гибернационного фактора в этом районе приводит к повороту головы малой субчастицы. Подобное изменение конформации спо собствует образованию рибосомных димеров 90S. После димеризации двух рибосом и образования 90S димера происходит связывание гибернационного фактора HPF, который дополнительно стабилизи рует данную структуру и закрывает доступ тРНК в A- и P-cайты рибосом. Образовавшийся комплекс двух 70S рибосом вместе с белками HPF и RMF имеет коэффициент седиментации 100S. Димеризация ри босом обратима. Когда клетка попадает в богатую пи тательными веществами среду, комплекс факторов гибернации и рибосом диссоциирует с образованием двух активных 70S рибосом [55, 60]. Другой путь гибернации рибосом - связывание 70S рибосомами белка Y (YfiA), что приводит к образова нию неактивных мономеров 70S. N-Концевая часть белка Y сходна с белком HPF, она также связывается в районе сайта посадки тРНК. При этом C-конец бел ка препятствует посадке белка RMF в районе после довательности анти-Шайна-Дальгарно на 16S рРНК. Связавшись с рибосомой, YfiA ингибирует ее актив ность и препятствует диссоциации на отдельные субчастицы. Когда клетка попадает в благоприятные условия, белок Y покидает рибосому, и трансляция возобновляется [60]. Литературные данные свидетельствуют о ком плексном влиянии строгого ответа на биосинтез бел ка в бактериальной клетке. Под действием ppGpp не только подавляется экспрессия аппарата биосин теза, но через гибернационные факторы ингибирует ся сама трансляция. Трансляция в условиях длительного голодания. Фаза смерти и запрограммированная клеточная гибель Когда в окружающей среде практически полностью исчезают питательные вещества и накапливаются критические количества токсичных отходов метабо лизма, активируется система программируемой кле точной гибели (ПКГ), цель которой состоит в унич тожении большей части популяции при сохранении небольшого количества живых клеток. Таким «са мопожертвованием» популяция снижает нагрузку на оставшиеся бактерии, которые при появлении но вых ресурсов смогут продолжить свой род. Именно система трансляции особенно чувстви тельна к усиливающемуся голоданию. Как уже сказано, при помощи компонентов аппарата транс ляции, в частности, рибосом, сигнал о голоде пере дается всем компонентам бактериальной клетки [55]. Механизм ПКГ основан на системе токсин-анти токсин (ТА), суть которого заключается в наличии двух генов, кодирующих белок, токсичный для клет ки, и белок, позволяющий нейтрализовать действие токсина. Деградация антитоксина и выключение его экспрессии приводят к накоплению активной формы токсина и гибели клетки. Наиболее изученный и важный модуль ТА - си стема mazEF, выявленная у множества прокариот. Этот модуль состоит из двух генов, находящихся в одном опероне - mazF и mazE. Первый ген коди рует стабильный цитотоксический белок, а второй - лабильный белок-антитоксин, легко разрушаемый АТР-зависимой протеазой ClpAP. В нормальных условиях экспрессируются гены обоих белков, что не позволяет токсину влиять на клетку из-за образования комплекса токсин-антитоксин. В усло виях голода активируется синтез ppGpp, который ингибирует транскрипцию оперона mazEF. После этого происходит быстрая деградация mazE и высво бождение mazF. Токсичность mazF обуславливается его эндорибонуклеазной активностью, специфичной к последовательности ACA в мРНК, а также 3’-кон цевой части 16S рРНК [61]. Отщепление 3’-конца 16S рРНК приводит к «потере» рибосомами последо вательности анти-Шайна-Дальгарно, необходимой для трансляции канонических мРНК. Ранее было показано, что подобные рибосомы проявляют высо кую селективность к синтезу малых белков, среди которых оказались как белки «смерти», убивающие клетку, так и белки, необходимые для сохранения малой популяции клеток. Предполагается, что таким образом система mazEF осуществляет программиру емую клеточную гибель, статистически уничтожая большую часть клеток в культуре, сохраняя при этом нетронутой малую популяцию [62]. Позже показали, что эта система ПКГ регулирует ся при помощи сигнального пептида, названного EDF (Extracellular Death Factor) и имеющего последова тельность NNWNN. Этот пептид входит в систему межклеточной связи в культуре, названной Quorum Sensing (QS). При критической плотности популя ции в бактериальной культуре появляется пептид EDF, способный легко проникать в клетки. Этот пеп тид значительно повышает активность mazE, сни жая при этом способность mazF ингибировать ток син. Таким образом, во всех клетках, в которые попал EDF, активируется путь программируемой клеточ ной гибели, и лишь малая популяция клеток остает ся нетронутой и способной к дальнейшему выжива нию [63]. Структурные особенности клеток в стационарной фазе роста Переход в стационарную фазу роста, как сказа но выше, сопровождается накоплением фактора σ38. Переход к σ38 влияет не только на метаболические и регуляторные пути, но и кардинально изменяет фи зиологию бактериальной клетки. Показано, что гены, экспрессия которых контролируется σ38, участвуют в изменении морфологии клетки, стрессовом ответе, адаптации метаболизма к голоданию и выживаемости в долговременной стационарной фазе. Бактерии в стационарной фазе подвергаются кри тически важной для выживания адаптации морфоло гии. Клетки становятся меньше, как следствие двух процессов, редукционного деления и образования карликовых клеток [64]. Редукционное деление вызывается тем, что про цессы репликации ДНК и деления клеток иниции руются в момент перехода клеток в стационарную фазу, когда из-за нехватки ресурсов дальнейший рост клетки заблокирован на всех уровнях регу ляции. В стационарной фазе клетки не могут де литься, и из-за возможной случайной инициации репликации ДНК появляются клетки с удвоенным количеством хромосом. В результате, бактериаль ная культура в стационарной фазе становится чрез вычайно гетерогенной по своему хромосомному со ставу. Бактериальные клетки могут содержать даже больше двух хромосом [65]. Причиной гетерогенно сти клеток по содержанию хромосом может быть то, что в некоторых клетках в ходе роста не было достиг нуто необходимое расстояние между нуклеоидами, что не позволило произвести деление клетки. Другой причиной может быть то, что в стационарной фазе роста в клетках нарушены процессы терминации ре пликации или декатенации ДНК [65]. При рассмотре нии выживаемости клеток, частоты мутаций и ста бильности генома необходимо учитывать, что клетки в стационарной фазе содержат различное число хро мосом. Клетки, образованные в результате редукци онного деления, имеют форму кокков. Эта морфоло гическая особенность может объясняться влиянием гена bolA, который активно экспрессируется в стаци онарной фазе под контролем RpoS. Наиболее вероятно, что влияние BolA на морфо логию клеток обусловлено регуляцией транскрип ции генов dacA (ген, кодирующий пенициллинсвя зывающий белок 5, PBP5), dacC (ген, кодирующий пенициллинсвязывающий белок 6, PBP6) и ampC (ген, кодирующий β-лактамазу). Эти белки облада ют D,D-карбоксипептидазной активностью и уча ствуют в процессе образования предшественников пептидогликанового слоя мембраны, влияя на сте пень сшивания пептидогликанов клеточной оболочки за счет регуляции количества доступных для сшивок компонентов [66]. Редукционное деление - это форма адаптации клеток к агрессивным внешним условиям. Редукционное деление позволяет клеткам получать преимущества в условиях голодания из-за увели чения соотношения поверхности к объему клетки. Стоит отметить, что редукционное деление не индуцируется голоданием, а обусловлено наступлением голода в момент активного деления клеток. Образование карликовых клеток, в отличие от редукционного деления, активируется голода нием. Этот процесс характеризуется постоянным уменьшением размера клеток вследствие деграда ции не только эндогенных ресурсов, но и клеточной оболочки, особенно цитоплазматической мембраны и клеточной стенки. У некоторых грамотрицатель ных бактерий, например E. coli, в стационарной фазе наружная мембрана не деградирует и не сжимается, подобно внутренней, что приводит к увеличению об ласти периплазмы [67]. Отличительная особенность адаптации к стаци онарной фазе - образование клеточной оболочки, способной эффективно противостоять агрессивной внешней среде. Образование подобного усиленно го барьера включает в себя обширные изменения на всех уровнях структуры бактериальной оболочки: внутренней и внешней мембран, периплазмы и пеп тидогликанов. Во внешней мембране увеличивается концентрация липосахаридов, снижается количество белков, а также увеличивается количество молеку лярных сшивок между липопротеидами внешней мембраны и слоем пептидогликанов. В периплазме накапливаются олигосахариды, например трегало за, которые выполняют функцию осмопротекторов. Слой пептидогликанов (пептидогликаны - класс прочных и эластичных полимеров, которые служат неким «амортизатором» стрессового воздействия на клеточную оболочку) уширяется. Недавно было показано, что в стационарной фазе происходит син тез D-аминокислот, способных модифицировать слой пептидогликанов за счет включения в состав полиме ра. В структуре внутренней мембраны происходит ряд значительных изменений. Снижается количество мононенасыщенных жирных кислот с попутным уве личением доли полиненасыщенных жирных кислот. Ненасыщенные жирные кислоты также превраща ются в циклопропильные производные, увеличива ется отношение количества фосфоглицерина к ко личеству фосфоэтаноламина при переходе клетки к стационарной фазе роста. Следствием всех этих изменений является образование жесткой структу ры внутренней мембраны и уменьшение ее текуче сти [64]. Микроэволюция бактерий в стационарной фазе Бактериальная популяция может адаптироваться к неблагоприятным условиям самыми неожиданными способами. Во время наблюдения за выживаемостью клеток в стационарной фазе обнаружили, что при до статочно длительной инкубации культуры без смены питательной среды на кривой роста появляется ха рактерное циклическое увеличение и уменьшение количества жизнеспособных клеток. Этот феномен был назван GASP-фенотипом, что можно перевести как «фенотип преимущества роста в стационарной фазе». Подобное поведение культуры объясняется появлением в популяции мутантных клеток, более приспособленных к таким условиям, нежели роди тельский штамм [1]. GASP-фенотип опосредуется несколькими ключе выми мутациями, которые получают преимущество в стационарной фазе. Одна из таких мутаций при водит к снижению активности σ38, при этом штамм с делецией гена rpoS не имеет характерного фено типа. Предполагается, что преимущества, которые дает эта мутация, обусловлены ее плейотропными эффектами. Возможно, этот эффект обусловлен на рушением равновесия в конкуренции сигма-факто ров за РНК-полимеразу [3]. Другая мутация, а точнее группа мутаций, при водящих к GASP-фенотипу, - мутации в генах lrp и sgaC, а также геномная перестройка, инактивиру ющая ген cstA и активирующая оперон ybeJ-gltJKL. Подобные мутанты проявляют повышенную способ ность использовать аминокислоты, поступающие в окружающую среду из погибших клеток. Геномная перестройка приводит к деактивации гена, кодиру ющего пермеазу олигопептидов, и активации оперо на, кодирующего аннотированные белки-транспор теры глутаминовой и аспарагиновой кислот. Таким образом, за счет потери способности деградировать олигопептиды клетка получает повышенную спо собность использовать мономерные аминокислоты, поступающие в среду из мертвых клеток. После дополнительной инкубации в клетках с мутацией в гене rpoS активируется оперон bgl, что приводит к появлению популяции, способной использовать в качестве ресурса арил-β-гликозиды салицин и ар бутин [3]. Интересно, что в стационарной фазе появля ется популяция клеток, способных к выживанию, но не поддающихся культивированию в лаборатор ных условиях (VBNC-фенотип). Этот фенотип про является как ответ на самые разнообразные стрес сы и встречается у многих бактерий. Молекулярная природа механизма VBNC-фенотипа не установле на, однако ясно, что за ним стоит не одиночный ре гуляторный путь, а глобальная смена метаболизма клетки. Особенностью VBNC-фенотипа являются колоссальное снижение метаболизма и изменение морфологии клеток. Вероятно, таким образом клетка пытается пережить стресс, перейдя в состояния «ги бернации» и отгородившись от неблагоприятной сре ды непроницаемым барьером. Мало известно и о ме ханизме выхода из этого состояния [68]. Устойчивость к антибиотикам в стационарной фазе Вслед за стремительным ростом частоты использо вания антибиотиков при бактериальных инфекциях столь же стремительно появляются штаммы бак терий, устойчивых к антибиотикам. Поэтому одной из важнейших проблем современной медицины стала «гонка вооружений» с бактериями. Необходимо на ходить все больше новых антибиотиков, способных на время преодолеть проблему резистентности. Одно из направлений этой «гонки» предполагает изучение клеточных механизмов, приводящих к резистентно сти, вместо поиска новых антибиотиков, поскольку ингибируя эти механизмы, можно преодолеть про блему устойчивости бактерий к антибиотикам. Давно замечено, что устойчивость бактериальной популяции к воздействию различных классов анти биотиков значительно увеличивается при голодании. В стационарной фазе, как уже сказано, происходит ингибирование клеточного цикла и всех этапов реа лизации генетической информации. Исходя из этого, основным объяснением антибиотикорезистентности стало отсутствие роста бактерий в условиях голода ния [69]. Относительно недавно установили молекулярный механизм резистентности бактерий к различным классам антибиотиков именно в стационарной фазе роста, когда происходит задержка клеточного цикла. Показано, что при деактивации генов relA и spoT (что приводит к невозможности формирования строгого ответа) значительно снижается резистентность бак терий к воздействию антибиотиков и увеличивает ся внутриклеточная концентрация гидроксильных радикалов. Поскольку известно, что летальное дей ствие практически всех классов антибактериальных препаратов обусловлено, в конечном итоге, накопле нием в клетке активных форм кислорода [70], авторы данного исследования решили проверить уровень каталазной активности в клетках, которая оказа лась заметно снижена. Таким образом, показано, что не отсутствие роста, а именно активный клеточ ный ответ на стресс важен для возникновения устой чивости к антибиотикам в стационарной фазе [71]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Клетка подходит к решению вопроса выживания в неблагоприятных условиях с самых разных сторон. Для защиты от механических повреждений и воз действия факторов стресса укрепляется и перестра ивается клеточная оболочка, изменяется сама форма клеток. В свою очередь, нуклеоид подвергается кон денсации и включается в состав нуклеопротеидного комплекса, защищающего его от повреждений. Для экономии ресурсов происходит ингибирование процесса трансляции, в частности, через выключение экспрессии генов, кодирующих компоненты аппарата биосинтеза белка. Особенно интересно разнообразие регуляторных путей, через которое происходит ин гибирование трансляции. Именно трансляционный аппарат, как наиболее энергозатратный процесс, является ключевым участником передачи сигнала о стрессе другим компонентам клетки. В зависимости от степени голода клетка проходит путь от снижения экспрессии рибосомных оперонов до полного пода вления трансляции и деградации рибосом. Важна также способность клетки использовать альтернативный сигма-фактор для регуляции экс прессии генов стрессового ответа. Сложная система регуляции синтеза и стабильности сигма-фактора позволяет незамедлительно реагировать на возник новение стресса и также быстро возвращаться к нор мальному росту. Становится ясным, что переход к стационарной фазе роста является естественным механизмом за щиты бактериальной культуры от стресса и голода. В этих условиях происходит изменение структуры клетки на всех уровнях организации, направленное на выживание не только отдельных клеток, но и по пуляции в целом.

Об авторах

Ф. И. Плетнёв

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: philippletnev@gmail.com
Россия

И. А. Остерман

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: philippletnev@gmail.com
Россия

П. В. Сергиев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: philippletnev@gmail.com
Россия

A. А. Богданов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Email: philippletnev@gmail.com
Россия

O. А. Донцова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Email: philippletnev@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы