Фаговые пептидные библиотеки как источник адресующих лигандов

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Доставка лекарственных средств непосредственно к очагу поражения - одна из основных задач совре менной фармакологии. Особенно остро эта проблема стоит для онкологических заболеваний. Как правило, противоопухолевые препараты обладают значитель ной токсичностью, поражая наряду с малигнизиро ванными здоровые клетки и ткани. Поэтому создание принципиально новых противоопухолевых средств, эффективность которых обеспечивается избира тельным воздействием на опухоль, рассматривается как одно из ключевых направлений противоопухоле вой терапии. Появление таких направленных на опу холь препаратов позволит снизить эффективную терапевтическую дозу и минимизировать побочные эффекты. Известно, что раковые клетки обладают многими количественными и/или качественными признака ми, отличающими их от нормальных клеток. Так, экс прессия рецепторов факторов роста, таких, как ре цепторы эпидермального фактора роста (EGFR), рецепторы трансферрина и фолиевой кислоты, зача стую повышена на опухолевых клетках, что обеспе чивает их неконтролируемую пролиферацию и спо собствует процессам метастазирования [1]. Известно также, что рост опухоли сопровождается активными процессами ангиогенеза, которые во взрослом орга низме активируются в основном при регенерации поврежденных тканей. Процессы ангиогенеза могут активироваться, например, при повышении уровня экспрессии факторов роста сосудистого эндотелия (VEGF) [2]. Наконец, существуют физические от личия опухолевой ткани от нормальной: изменение температуры, низкая концентрация кислорода (ги поксия) и снижение pH [3]. Совокупность уникальных свойств раковых клеток позволяет находить специфические лиганды, взаи модействующие непосредственно с опухолью, и про водить направленную (таргетную) терапию злокаче ственных новообразований. Технология фагового дисплея - один из пер спективных подходов к поиску ткане- и/или орга носпецифичных молекул. Комбинаторные фаговые пептидные библиотеки позволяют получать высо коспецифичные пептиды, в том числе к различным типам опухолей. Поиск опухолеспецифических пеп тидов с помощью комбинаторных фаговых пептид ных библиотек можно осуществлять в системах in vitro и in vivo. В настоящее время такие опухолеспе цифические пептиды рассматриваются в качестве таргетных средств доставки терапевтических генов, цитокинов, агентов для визуализации, проапоптоти ческих пептидов и цитотоксических препаратов. В обзоре подробно рассмотрена технология фа гового дисплея как метода получения адресующе го агента, способного обеспечить специфичность взаимодействия лекарственного средства и органа или ткани-мишени. Приведены примеры использования органо- и тканеспецифических пептидов в био медицине. ТЕХНОЛОГИЯ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ Технология фагового дисплея, впервые предло женная в 1985 г. G.P. Smith, сыграла важную роль в разработке принципиально новых молекулярно биологических подходов и открыла новые возмож ности для развития фармацевтической индустрии. Концепция фагового дисплея заключается в кло нировании последовательности чужеродной ДНК в специфический сайт гена поверхностного белка бактериофага так, чтобы эта последовательность на ходилась в одной рамке считывания с белком. В ре зультате на поверхности бактериофага образуется (представляется) химерный белок, в состав которого включена чужеродная аминокислотная последова тельность (рис. 1). При этом физиологические свой ства и жизнеспособность вирусной частицы сохра няются [4, 5]. Технология фагового дисплея разработана для различных бактериофагов, например λ, T4, T7 [6-8]. Наиболее широкое применение при создании фагового дисплея получили нитчатые бактериофа ги [9], вирионы которых похожи на длинную тонкую нить. Нитчатые фаги имеют небольшие размеры и просто устроенный геном [10]. Наиболее изученные нитчатые фаги - M13, f1 и fd - входят в род Inovirus семейства Inoviridae и объединяются в группу Ff, поскольку инфицируют Escherichia coli, несущие F-пили [11]. Штаммы фагов Ff содержат кольцевую одноцепочечную ДНК, идентичность которой у раз ных штаммов этой группы составляет 98.5% [10]. Геном Ff-фагов представлен 11 генами, продукты, которые можно сгруппировать по их функциональ ному назначению: белки капсида - pIII, pVI, pVII, pVIII, pIX; белки, участвующие в репликации ДНК, - pII, pV, pX; и белки, отвечающие за сборку фаговой частицы, - pI, pIV, pXI (рис. 1) [12]. Как правило, нитчатые бактериофаги инфици руют грамотрицательные бактерии (Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Xanthomonas, Vibrio, Thermus и Neisseria). Бактериальная клетка, инфи цированная фагом, высвобождает новые вирусные частицы, но сама при этом не лизируется. В зависимости от того, в каком гене поверхностного белка клонирована чужеродная ДНК, различают не сколько типов фагового дисплея (таблица). Для представления чужеродной аминокислотной последовательности в технологии фагового дисплея наиболее часто используют белки pIII и pVIII (406 и 50 аминокислотных остатков соответственно), кото рые также называют минорными и мажорными. Оба белка имеют N-концевые сигнальные последователь ности, которые отщепляются сигнальной пептидазой в процессе созревания белка после переноса к вну тренней части бактериальной мембраны. Зрелые бел ки встраиваются в оболочку бактериофага в ходе ее сборки. Таким образом, чтобы чужеродный пептид был представлен на поверхности фаговой частицы, кодирующая его нуклеотидная последовательность должна быть клонирована между последовательно стью поверхностного белка и сигнальной последова тельностью в единой рамке трансляции [13]. Бактериофаг содержит от трех до пяти копий белка pIII. Вместе с pVI они образуют дистальную крышку вириона и необходимы для его стабилиза ции, а также для терминации сборки фаговой ча стицы при выходе из бактериальной клетки. Кроме того, pIII играет важную роль при инфицировании, прикрепляясь к бактериальной клетке через F-пили [14]. pIII состоит из трех доменов: N1, N2 и C, раз деленных глициновыми спейсерами (рис. 1). Домен С отвечает за сборку вириона, а N1 и N2 - за инфи цирование бактериальной клетки [15]. Если встроить короткую нуклеотидную последовательность в ген pIII, то чужеродную вставку будет нести каждая мо лекула белка pIII. Фаговый дисплей такого вида на зывается дисплеем типа 3 (таблица). Одна фаговая частица содержит около 2700 копий белка pVIII, который образует оболочку бактерио фага и имеет спиралевидную структуру. На С-конце белка находятся четыре положительно заряжен ных остатка лизина, которые взаимодействуют с от рицательно заряженными фосфатными группами вирусной оцДНК внутри фага. N-Конец располо жен на внешней стороне вирусной частицы [16, 17]. Максимальная длина чужеродной вставки, которая не приводит к значительным нарушениям сборки фа говой частицы и будет экспонирована в каждом белке pVIII, составляет 6-7 аминокислотных остатков (фа говый дисплей типа 8) [18, 19]. При экспозиции длинных чужеродных амино кислотных последовательностей происходит утрата функции химерного белка, что необходимо воспол нить белком pIII или pVIII дикого типа. Существуют системы, в которых фаговый геном содержит ген pIII (pVIII) двух типов: рекомбинантный и дикий. В ре зультате только часть белков pIII (pVIII) будет нести чужеродную последовательность, тогда как другая часть сохранит природные функции (тип 33 (88) фа гового дисплея) [20]. Восполнение утраченной функ ции белка может происходить в системах с исполь зованием фагмидных векторов и фагов-помощников [21, 22]. Фагмидный вектор в таких случаях содержит ориджины репликации плазмиды и фага, последова тельность, кодирующую ген устойчивости к антибио тику, и последовательность, кодирующую химерный белок. Фаг-помощник кодирует белок дикого типа, он необходим для правильной сборки вирусных ча стиц. При инфицировании ген дикого типа попадает в клетку E. coli вместе с фагом-помощником, а реком бинантный ген находится в плазмиде. В результате зрелые частицы высвобождаемого бактериофага бу дут устроены по мозаичному типу, т.е. будут содер жать белки дикого и рекомбинантного типа (тип 3+3 или 8+8 фагового дисплея) [20]. Первые работы с использованием технологии фа гового дисплея были направлены на получение пеп тидов и белков, способных специфически связывать ся с антителами. Smith G.P. в своей пилотной работе получил фаговый клон (fECO1), в белок pIII которого был встроен фрагмент рестриктазы EcoRI. Этот клон эффективно нейтрализовался антителами против рестриктазы [4]. В продолжение и развитие этих ра бот опубликовано множество других, в которых фа говые частицы с экспонированным антигеном служи ли иммуногенами, способными вызывать ответную реакцию иммунной системы [23-25]. Во второй части своей работы Smith исследовал возможность обогащения смешанной популяции бак териофагов специфическими фагами fECO1 путем аффинного связывания с антителами к EcoRI. К аб сорбированным антителам против EcoRI добавляли смесь фагов fECO1 и значительный избыток фага M13mp8 дикого типа. Не связавшиеся фаги отмыва ли средой, а абсорбированные элюировали кислым буфером, нейтрализовали и титровали. В результате трех последовательных экспериментов получили по пуляцию, обогащенную фагом fECO1 в 1500-7200 раз по сравнению с фагом дикого типа [4]. На этом эта пе возникла идея использовать антитела для отбора специфических клонов из популяции бактериофагов (комбинаторной фаговой библиотеки), где каждая отдельная фаговая частица экспонирует на своей поверхности случайную аминокислотную последо вательность. С 1988 г. процедуру аффинного обога щения популяции фагов специфическим бактерио фагом стали называть «биопэннингом» [26]. Типичный раунд биопэннинга включает в себя сле дующие стадии: 1) инкубация комбинаторной фаго вой библиотеки с мишенью (белки, культура клеток, опухолевая ткань и т.д.); 2) отмывка не связавшихся фагов; 3) элюция связавшихся фагов; 4) амплифика ция элюированного фага для последующих раундов (рис. 2). После нескольких раундов биопэннинга степень обогащения популяции бактериофагом определяют титрованием и/или иммуноферментными метода ми. Затем выделяют индивидуальные фаговые кло ны и определяют последовательность чужеродной вставки. Важно отметить, что простая физическая связь между экспонированным пептидом и клониро ванной в геном фага последовательностью позволяет легко анализировать первичную структуру вставки. Благодаря небольшим размерам нитчатых бактери офагов (диаметр 5 нм, длина 1 мкм) концентрация фаговых частиц может достигать 1014 частиц/мл, что позволяет проводить скрининг огромного количе ства вариантов. Представительность пептидной фа говой библиотеки достигает 109 различных вариантов вставки [27]. Сегодня комбинаторные фаговые библиотеки по лучили широкое распространение в качестве ин струмента, позволяющего решать различные задачи молекулярной биологии, биохимии и биомедицины. Библиотеки могут быть выполнены на основе случай ных комбинаций олигопептидов, антител, ферментов, а также фрагментов геномной ДНК, кДНК, открытых рамок считывания или других функциональных рай онов генома [28-30]. Скрининг библиотек позволяет отбирать молекулы со специфическими свойствами, изучать белок-белковые взаимодействия, искать субстраты различных ферментов, исследовать мар керы определенных тканей, органов и биохимиче ских процессов, проводить поиск эпитопов антигенов и паратопов антител и, наконец, получать высоко специфические молекулы с адресными свойствами [31, 32]. ОТБОР СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ ИЗ ФАГОВЫХ БИБЛИОТЕК Конструирование пептидной библиотеки - один из ключевых моментов успешного скрининга, по скольку вероятность отбора лиганда, который специфически свяжется с определенной мишенью, во многом зависит от разнообразия библиотеки и длины вставки. Одна из наиболее распространен ных стратегий конструирования комбинаторной библиотеки пептидов опирается на правила три плетности и вырожденности генетического кода. Эта стратегия заключается в генерировании раз личных комбинаций на основе кодона (NNK)n, где N - эквимолярное соотношение всех четырех ну клеотидов, а K - смесь только гуанина и тимина (1 : 1). Благодаря использованию кодона (NNK)n вме сто (NNN)n число возможных стоп-кодонов сокра щается с трех (TAA, TGA, TAG) до одного (TAG), а также выравнивается вероятность кодирования разных аминокислот. Таким образом, 32 возможных варианта кодона (NNK)n кодируют 20 канонических аминокислот и один стоп-кодон [13]. Число возмож ных вариантов аминокислотной последовательно сти длиной n будет равно 20n. Однако на практике на представительность библиотеки влияют и дру гие факторы, такие, как наличие стоп-кодона в по следовательности пептида и эффективность транс формации клеток E. coli фаговыми конструкциями. Обычно представительность коммерческой фаговой пептидной библиотеки составляет около 109 фаго вых частиц [33]. При этом пептидная вставка может быть как линейной, так и кольцевой за счет обра зования дисульфидных мостиков между остатками цистеина, фланкирующими вставку. Как уже сказано, чужеродная вставка мо жет экспонироваться либо белком pIII, либо pVIII. Библиотеки на основе pIII, который представлен всего тремя-пятью копиями на одном из концов вирусной частицы, используют для получения вы сокоспецифичных лигандов, обладающих высоким сродством к мишени. С помощью таких библиотек по лучают лиганды с константами диссоциации в преде лах 1-10 мкМ [34]. Наиболее часто столь специфиче ские пептиды используют для доставки различных веществ к мишени или визуализации специфических структур и биохимических процессов. Мажорный белок pVIII, покрывающий капсид, обеспечивает мультивалентное связывание и высо кую авидность, что отрицательно отражается на аф финности взаимодействия пептида с мишенью. С по мощью библиотек на основе белка pVIII отбирают лиганды с более низкой индивидуальной аффинно стью, константы диссоциации таких лигандов на ходятся в пределах 10-100 мкМ [34]. Однако такие библиотеки также находят широкое применение, по скольку отобранные фаговые частицы обладают вы соким сродством к мишени, стабильностью, их можно легко наработать в большом количестве. Например, Lang Q. и соавт. использовали иммуноферментный анализ для детекции простатспецифического антиге на (PSA) с помощью отобранного из библиотеки pVIII фагового клона [35]. Показана возможность таргетной доставки миРНК GAPDH в раковые клетки с исполь зованием способности фаговых белков к самосборке в присутствии какой-либо нуклеиновой кислоты [36]. Они использовали фаговую пептидную библиотеку на основе мажорного белка pVIII для отбора клонов, специфических к клеткам аденокарциномы молоч ной железы человека MCF-7. Рекомбинантные белки pVIII этого клона нарабатывали простой амплифи кацией фагового клона, отделяли от фаговой части цы и инкубировали с миРНК GAPDH с образованием так называемых нанофагов. Полученные частицы (нанофаги) защищали миРНК GAPDH от деградации нуклеазами плазмы крови, специфически доставля ли их к клеткам MCF-7, обеспечивали их интернали зацию внутрь клетки и при этом не влияли на функ циональность миРНК GAPDH. Скрининг фаговых пептидных библиотек можно проводить как в системе in vitro, так и in vivo. В си стеме in vitro скрининг проводят на самых различ ных объектах: инактивированных вирусах и бак териях, очищенных фракциях белков, ферментов, рецепторов, функциональных доменов и на культу рах клеток [37, 38]. К скринингу in vitro также отно сят отбор на неорганических молекулах (например, металлы) и на синтетических материалах [39]. Наиболее простой и прямой метод отбора специфических пептидов in vitro - селекция на очищен ной субстанции белка-мишени. Например, с помощью скрининга фаговой пептидной библиотеки, экспони рующей семизвенный пептид, с фактором роста фи бробластов 8 (FGF8b) был получен пептид HSQAAVP (Р12), специфически связывающийся с рецептором этого фактора. FGF8b является основной изоформой, которая продуцируется клетками рака предстатель ной железы. Отобранный пептид P12 ингибирует индуцируемую FGF8b пролиферацию клеток, при водит к остановке клеточного цикла в фазе G0/G1 путем супрессии циклина D1 и PCNA и блокирует активацию каскадов Erk1/2 и Akt как в клетках рака предстательной железы, так и в клетках эндотелия сосудов. Таким образом, P12, действующий как ан тагонист FGF8b, может быть потенциальным тера певтическим средством при раке предстательной железы [40]. Недостаток или скорее ограничение такого спо соба отбора состоит в том, что пептиды, полученные после скрининга на очищенной субстанции белков, могут не обладать таргетностью к мишени in vivo. Одной из причин этого могут быть специфические посттрансляционные модификации белков, про исходящие при различных процессах, в том числе при злокачественном перерождении клетки. Кроме того, получение растворимой субстанции очищен ного белка с сохранением его природной структуры и функции не всегда представляет тривиальную за дачу [41]. Cкрининг in vitro на культурах клеток позволяет успешно отбирать пептиды к различным поверхност ным структурам клетки, а также пептиды, способ ные интернализоваться внутрь клеток как рецеп тор-опосредованным, так и нерецепторным путем, так называемые CPP-пептиды - пептиды с высокой проникающей способностью (от англ. cell penetrating peptides). К преимуществам селекции на культурах клеток относится возможность получения пептидов, специфичных к определенному типу клеток, без зна ния конкретной мишени, с которой эти пептиды свя жутся. На основе уже полученных многочисленных дан ных конструируют фаговые пептидные библиотеки с дополнительными свойствами. Так, например, вы деляют новый класс фаговых пептидных библиотек (iPhage libraries), в которых экспонированный пептид способен интернализовать фаговую частицу внутрь клетки и обеспечивать специфическое связывание с клеточными органеллами и функциональными до менами внутриклеточных белков. Пептиды, отобран ные из такой библиотеки, позволяют изучать внутри клеточные сигнальные и метаболические пути [42]. Менее распространенным объектом для скринин га фаговой пептидной библиотеки являются различ ные биологические жидкости. Так, во внеклеточном матриксе опухоли обнаруживается большое коли чество фибрина, что обусловлено постоянным про никновением фибриногена в строму опухоли и его расщеплением. Pilch J. и соавт. провели биопэннинг со свернувшейся плазмой крови и отобрали два ци клических декапептида (CLT1 и CLT2), способных специфически связываться с фибрин-фибронектино выми комплексами. Внутривенное введение мышам с различными привитыми опухолями флуоресцентно меченных CLT1 и CLT2 приводило к их накоплению во внеклеточном пространстве опухоли. Отобранные пептиды также специфически связывались с участ ками повреждений в тканях. Таким образом, такие пептиды могут быть полезны при создании адресных лекарственных средств для диагностики и терапии опухолей и поврежденных тканей [43]. Впервые возможность отбора специфических пеп тидов скринингом фаговой пептидной библиотеки in vivo показали Pasqualini и Ruoslahti в 1996 г. [44]. При скрининге in vivo существует несколько спосо бов введения фаговой пептидной библиотеки экспе риментальным животным. Наиболее распространено внутривенное введение, которое позволяет практи чески моментально «представить» библиотеку ре цепторам кровеносных сосудов, органам и тканям. В процессе циркуляции фаговой пептидной библи отеки в кровяном русле часть популяции фагов свя зывается с белками плазмы и с другими нецелевыми органами и тканями. Эта часть библиотеки не попа дает в дальнейшие раунды селекции, поскольку ам плифицируется только та часть библиотеки, которая связалась с целевым органом. Однако внутривенный способ введения затрудняет проведение отбора пептидов, специфичных к струк турам головного мозга, поскольку проникновение фаговых частиц ограничено гематоэнцефалическим барьером. С этой целью разработан интраназаль ный способ введения фаговой пептидной библио теки. Установлено, что при интраназальном введе нии большая часть вещества всасывается в кровь, меньшая - при помощи периневрального транспор та по чувствительным нервам через нейроны обо нятельного тракта попадает непосредственно в мозг и распространяется по структурам головного мозга при помощи механизмов, не связанных с кровотоком [45, 46]. Тем не менее внутривенный способ введения фаговой пептидной библиотеки позволяет отбирать пептиды, специфичные непосредственно к гемато энцефалическому барьеру [47]. Такие пептиды по тенциально могут транслоцироваться на внутреннюю сторону гематоэнцефалического барьера и обеспечи вать доставку связанных с ними молекул к структу рам мозга. Альтернативой внутривенному и интраназаль ному способам является введение непосредственно в мишень (ортотопическое). Например, внутрибрю шинное введение фаговой пептидной библиотеки мы шам с раком желудка позволило отобрать пептиды, специфически связывающиеся с метастазами рака желудка [48]. Ортотопическое введение позволя ет представлять мишени все возможные варианты библиотеки и уменьшает вероятность захвата фа говых частиц другими органами. С другой стороны, при внутривенном введении пептидов, отобранных ортотопически, таргетность таких пептидов резко снижается. Наконец, существует трансдермальный способ введения, позволяющий отбирать пептиды, способ ные проникать через интактную кожу [49, 50]. Основные ограничения скрининга in vivo - неспецифическое распределение фаговых частиц по органам и тканям и время полужизни введенного фага. Показано, что при циркуляции в организме фаг накапливается в значительном количестве в печени и селезенке. В крови мышей с интактной иммунной системой (линия CF-1) максимальная концентра ция фага M13 дикого типа наблюдается через 5 мин с момента внутривенного введения и через 15 мин - в крови мышей с иммунодефицитом. Затем концен трация фаговых частиц в кровяном русле достаточно быстро снижается. Важно отметить, что концентра ция фаговых частиц в селезенке мышей с иммуно дефицитом гораздо ниже, чем у здоровых, что го ворит об участии иммунной системы, в частности, ретикулоэндотелиальной системы, в захвате фагов [51]. Время полужизни фага М13 дикого типа в кро вяном русле мыши составляет около 4.5 ч, при этом различные модификации фаговых частиц (например, гликозилирование или сукцинилирование) резко со кращают (до нескольких минут) время полужизни. Сокращение времени полужизни в кровяном русле и быстрая деградация модифицированных фагов связаны, по-видимому, с их взаимодействием с со ответствующими рецепторами и интернализацией внутрь клетки [52]. Эти нюансы необходимо учи тывать при построении и анализе экспериментов in vivo. В 2002 г. опубликовали результаты первого скри нинга фаговой пептидной библиотеки, проведенного in vivo на пациенте в коме [53]. После внутривенного введения такой библиотеки (один раунд скрининга) анализировали биопсийный материал нескольких органов. Показано, что распределение 47160 фаговых клонов между органами не случайно. Этот экспери мент стал первым шагом в создании «молекулярной карты» распределения рецепторов человека. Один из отобранных экспонированных пептидов обладал высокой тропностью к ткани предстательной железы и накапливался в ней в значительных количествах. Позже показали, что этот пептид является лигандом интерлейкина-11 [54]. В дальнейшем фаговые частицы, отобранные из биопсийного материала различных органов по сле первого раунда селекции, объединили в но вую библиотеку. С помощью этой библиотеки про вели еще два последовательных раунда селекции на двух больных раком предстательной железы. Биоинформатический анализ клонов, отобранных из различных органов, выявил 15 пептидов, кото рые потенциально могут служить лигандами опре деленных рецепторов. С помощью биоинформатиче ских методов (High-throughput analysis by similarity search, protein arrays) и аффинной хроматографии доказано, что четыре из этих 15 пептидов являются лигандами аннексинов А2 и А4, аполипопротеина Е3 и протеазы-3 лейкоцитов [55]. Таким образом, одно из главных преимуществ использования системы in vivo - то, что мишени, к которым отбирают специфические пептиды, пред ставлены в естественном микроокружении живого организма. ПРИМЕНЕНИЕ ОРГАНО- И ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ Развитие технологии получения органо- и тканеспе цифических пептидов с помощью фаговых библиотек и обнаружение новых свойств таких пептидов позво лило рассматривать их как перспективные диагно стические и терапевтические средства. Пептиды с противоопухолевой активностью В большинстве случаев скрининг фаговых пептид ных библиотек проводят с целью получения пепти дов, которые специфически связываются с рецеп торными структурами целевого органа или ткани и впоследствии могут служить адресным агентом для доставки различных веществ. С другой стороны, сами органо- и тканеспецифические пептиды обла дают определенными биологическими свойствами. В частности, некоторые пептиды проявляют проти воопухолевую активность. Например, пептид LyP-1, специфически свя зывающийся с лимфатическими сосудами некото рых опухолей, при систематическом внутривенном введении ингибирует рост рака молочной железы MDA-MB-435 человека в модельных мышах с тяже лым комбинированным иммунодефицитом (SCID). Показано, что LyP-1 вызывает апоптотическую ги бель только тех клеток, с которыми связывается [56]. Циклический пептид CIGB-300 блокирует фосфо рилирование серин-треониновой протеинкиназы CK2, синтез которой значительно повышен при различных видах рака. Нарушение функции этого фермента при водит к торможению роста и индукции апоптоза рако вых клеток в культуре. Показано также, что CIGB-300 обладает значительным противоопухолевым эффек том как при местном, так и при системном введении мышам с сингенными опухолями и с опухолями чело века и может служить основой для создания противо опухолевого препарата [57]. Пептид SMSIASPYIALE (пептид РIII), специфич ный к эндотелиальным клеткам GC9811-P рака же лудка, накапливающийся в метастазах этой опухоли, был отобран из фаговой пептидной библиотеки после четырех раундов селекции. Синтетический аналог РIII значительно ингибировал способность клеток GC9811-P к адгезии и инвазии, тормозил развитие метастазов и увеличивал продолжительность жизни мышей с привитой раковой опухолью желудка [58]. В дальнейшем получили пептид GMBP1, который специфически связывался с рецепторами клеток рака желудка, обладающих множественной лекар ственной устойчивостью, способствовал изменению фенотипа клеток и восстановлению чувствительно сти к лекарственным средствам [59]. Известно, что кислый фактор роста фибробластов (aFGF) продуцируется клетками рака молочной же лезы и, взаимодействуя с рецептором FGF (FGFR), способствует опухолевой прогрессии. Пептид AP8, полученный из фаговой пептидной библиотеки, спо собен специфически связывать aFGF и ингибировать пролиферацию клеток опухоли и новообразованных опухолевых сосудов, блокируя клеточный цикл [60]. Такие бифункциональные пептиды, специфичные к опухолевым клеткам и клеткам сосудов опухоли, могут быть как самостоятельными противоопухоле выми средствами, так и средствами доставки других лекарственных препаратов, усиливая их эффект соб ственным противоопухолевым действием. Wang H. и соавт. разработали стратегию совмест ного использования апоптотического пептида AVPI и ДНК гена, кодирующего белок р53, для адъювант ной терапии рака молочной железы. AVPI-пептид модифицировали, добавив к нему восемь остатков аргинина. Благодаря положительно заряженному «хвосту» из остатков аргинина AVPIR8 приобрел способность эффективно проникать в раковые клет ки, а также служить вектором для доставки генов за счет образования нанокомплексов с нуклеиновой кислотой. Использование комбинации AVPIR8/ДНК p53 значительно увеличивало чувствительность ра ковых клеток к доксорубицину в экспериментах in vitro, а также на мышиных моделях рака молочной железы с фенотипом множественной лекарственной устойчивости [61]. На основе опухоль-адресованных пептидов раз работан ряд перспективных противоопухолевых лекарственных средств. Можно привести несколько примеров противоопухолевых пептидов, находя щихся на различных стадиях клинических испы таний (www.clinicaltrials.gov). Так, например, ци клический пептид [Arg-Gly-Asp-Dphe-(NMeVal)], содержащий мотив RGD, является основой проти воопухолевого средства Циленгитид (Cilengitide). Циленгитид - высокоселективный ингибитор ин тегрина, подавляющий ангиогенез, рассматривают как препарат против опухолей центральной нервной системы, в частности глиобластом, а также мелко клеточного рака легкого, рака предстательной же лезы и метастазирующего и/или плоскоклеточно го рака головы и шеи. В клинических испытаниях (фаза I/II) циленгитида в комбинации со стандарт ной радиотерапией и темозоломидом, проводимых на пациентах с впервые диагностированной глио бластомой, показано достижение первичной конеч ной точки (69% выживаемость без прогрессирования в течение 6 месяцев) [62, 63]. Клинические испытания противоопухолевого лекарственного средства NGR-hTNF, состоящего из аминокислотного мотива NGR, мишенью которо го является аминопептидаза N (CD13), и человече ского фактора некроза опухолей (hTNF), начались после получения обнадеживающих результатов противоопухолевой терапии на животных моделях [64]. К настоящему времени проведены клиниче ские испытания (II фаза) NGR-hTNF как препарата монотерапии при мезотелиоме плевры и раке пече ни. Клинические испытания (I/II фаза) комбинации NGR-hTNF с такими препаратами, как доксоруби цин, оксалиплатин, капецитабин, гемцитабин и т.д., при рецидиве рака яичников, колоректального рака и мелкоклеточного рака легкого находятся на раз ных стадиях завершения [5, 63]. По результатам клинических исследований NGR-hTNF наиболее эффективен в комбинации с традиционными химиопрепаратами. В качестве средства от рака яичников и рецидивов глиобластомы проводятся клинические испытания (фаза II/III) онколитического аденовируса Ad5-Δ24- RGD, модифицированного RGD и способного репли цироваться в клетках, в которых отсутствует сиг нальный путь Rb/p16 [5]. Обнадеживающие результаты уже завершенных и проводимых в настоящее время клинических ис следований позволяют надеяться на то, что в бли жайшее время появятся лекарственные средства на основе опухолеспецифических пептидов. Использование пептидов в генной терапии Опухолеспецифические пептиды активно использу ются в качестве адресующих составляющих при соз дании направленных генно-терапевтических препа ратов. Например, встроенные в мембрану липосомы, «нагруженные» нуклеиновой кислотой пептиды обе спечивают дополнительную адресацию структур доставки. В работе Yang Z. и соавт. в состав липосом были включены два рецепторспецифичных пептида: Angiopep и tLyP-1. Angiopep специфичен к рецеп тору липопротеинов низкой плотности, экспрессия которого повышена на структурах гематоэнцефа лического барьера. tLyP-1 специфичен к рецептору нейролипина-1, он эффективно проникает в парен химу опухоли. Такие модифицированные липосомы, «нагруженные» миРНК, подавляющей экспрессию гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF siРНК), эффективно трансфицировали клетки глиобласто мы человека U87MG в системе in vitro и снижали экспрессию гена-мишени. В системе in vivo на глиобластоме U87MG в модели ксенографтов показана противоопухолевая активность созданных модифи цированных липосом [65]. Вектор на основе адено-ассоциированного вируса (AAV), в капсид которого встроен пептид, отобран ный из фаговой пептидной библиотеки и содержащий NGR-мотив, обладал способностью адресно достав лять генетическую информацию к CD13+ клеткам мишеням. Рецептор CD13 экспрессируется на клет ках эндотелия новообразованных сосудов и многих раковых клетках, таким образом, пептиды, содержа щие NGR-мотив, могут использоваться как опухо льадресующие агенты [66]. В качестве средства направленной генной терапии также могут применяться генетически модифици рованные бактериофаги, экспонирующие адресные пептиды в составе одного из своих поверхностных белков. К важным преимуществам бактериофагов от носятся их безопасность для человека, высокая ста бильность фаговых частиц и «пластичность» генома для конструирования [67, 68]. Одна из первых работ, доказавшая возможность направленной генной терапии с помощью модифи цированных бактериофагов, выполнена на нитчатом бактериофаге, в состав минорного белка pIII которого был введен фактор роста фибробластов (FGF2). В ка честве репортерного гена использовали ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) под ранним промото ром цитомегаловируса (CMV). Модифицированные бактериофаги специфически проникали только в те клетки, на поверхности которых экспрессиро вался рецептор FGF2, и интернализовались внутрь клетки. При этом наблюдалась экспрессия репортер ного гена и синтез GFP [69]. Таким образом, бактери офаг, несмотря на отсутствие тропизма к клеткам че ловека, может быть модифицирован таким образом, что приобретает специфичность к определенному типу клеток и способность доставлять чужеродный генетический материал. Бактериофаг М13, экспрессирующий опухолеспе цифический пептид RGD4C, использовали для до ставки трансгенной кассеты, регулируемой промо тором CMV и фланкированной инвертированными концевыми повторами ААV2. Для улучшения транс фекционных свойств фаговые частицы модифициро вали катионными полимерами. Модифицированные фаговые частицы обладали более высокой противо опухолевой активностью по сравнению с немодифи цированными [70]. Наконец, опухолеспецифический пептид мож но ковалентно присоединить к терапевтической нуклеиновой кислоте для ее доставки к мишени. Например, изучали возможность доставки миРНК VEGFR2, ковалентно связанной с адресным пепти дом cRGD. cRGD специфически связывается с αvβ3 рецепторами, которые экспрессируются с высокой плотностью на эндотелии опухолевых сосудов и са мих клетках опухоли. Показано, что ковалентный комплекс cRGD-миРНК специфически проникает в αvβ3-позитивные клетки HUVEC и вызывает «вы ключение» гена-мишени. В экспериментах in vivo на мышах с иммунодефицитом и привитой опухолью рака легкого A549 выявлен специфический противо опухолевый эффект рассмотренных конструкций [71]. Полученные положительные результаты позволя ют рассматривать опухолеспецифические пептиды в качестве перспективной платформы для создания средств направленной генной терапии. Адресные пептиды в диагностике заболеваний Пептиды, специфически связывающиеся с опреде ленными органами и тканями, клетками и сосудами опухолей, могут быть использованы для характери стики культур клеток, визуализации определенных структур (в том числе опухолей) in vivo и диагности ки заболеваний [72]. Например, RGD-пептид, конъюгирован ный с FITC, используют в экспериментах in vitro для оценки уровня экспрессии интегринов αvβ3 на различных раковых клетках в культуре. Окрашивание биоптатов опухолей человека, заклю ченных в парафин, с помощью FITC-RGD позволяет оценить αvβ3-профиль опухолевой ткани. Этот метод окрашивания гораздо проще и дешевле, чем окра шивание с помощью антител к αvβ3-рецепторам [73]. Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) - ра дионуклидный томографический метод диагности ческого исследования. В основе этого метода лежит детекция распределения в организме соединений (ра диопрепаратов), меченных позитронизлучающими радиоизотопами. В качестве белковых меток в ПЭТ применяют в основном природные пептиды (бом безин, соматостатин) [74]. Опухолеспецифические пептиды также могут использоваться в качестве на правляющих агентов для доставки радионуклидных меток при диагностике злокачественных новообра зований. В настоящее время клинические испытания проходят новые радиопрепараты, созданные на осно ве RGD-пептида [75]. Другой радиопрепарат для ПЭТ создан на основе меченного 64Cu NGR-содержащего пептида, специ фичного к рецептору CD13. Этот препарат связывал ся с CD13+ клетками HT-1080 и не проявлял тропно сти к CD13¯ клеткам MCF-7 в экспериментах in vitro. Результаты опытов in vitro подтверждены в системе in vivo с использованием ксенографтов опухолей HT- 1080 и MCF-7 [76]. Опухолеспецифические пептиды могут быть конъ югированы не только с радионуклидами, но и с дру гими диагностическими препаратами, например, с парамагнетиками для проведения МРТ (магнит но-резонансная томография) или ОФЭКТ (одно фотонная эмиссионная компьютерная томография) или с флуоресцентными красителями в случае ФОТ (флуоресцентная оптическая томография) [74]. Такие конъюгаты избирательно накапливаются в опухоли в концентрациях, значительно превышающих их концентрацию в других органах, тем самым усиливая сигнал, детектируемый прибором. Таким образом, опухолеспецифические пептиды обладают значительным потенциалом для усовер шенствования уже существующих технологий диа гностики и визуализации опухолевых структур. Пептиды - адресные агенты для доставки лекарственных препаратов Один из примеров использования опухолеспецифи ческих пептидов для доставки проапоптотических белков - белок, объединяющий проапоптотический пептид KLAK и адресный пептид RGD. RGD-мотив в составе пептида узнает интегриновые рецепторы, которые в большом количестве экспрессируются на новообразованных сосудах и раковых клетках [77]. Полученный бифункциональный белок специфиче ски связывается с клетками-мишенями (клетки эн дотелия опухоли), проникает внутрь клеток и инду цирует в них апоптоз по митохондриальному пути [78]. В качестве адресного агента для доставки про апоптотического белка KLA был предложен также пептид M2pep, который специфически связывается с опухоль-ассоциированными макрофагами и макро фагами M2 мыши [79]. Опухоль-ассоциированные макрофаги играют важную роль в развитии опухо ли, стимулируя рост опухолевых клеток, ангиоге нез и метастазирование, и способствуют развитию лекарственной устойчивости [80]. Полученный ре комбинантный белок M2pepKLA тормозил развитие опухоли и сокращал популяцию опухоль-ассоцииро ванных макрофагов [79]. При селекции пептидов с помощью пептидной фаговой библиотеки на основе фага T7 был отобран пептид CRGDKGPDC (iRGD), объединяющий свойства двух мотивов - RGD (интегринсвязывающий) и R/KXXR/K (нейропилин (NRP)-связывающий) [81, 82]. RGD направляет пептид к опухоли, а R/KXXR/K увеличивает проницаемость сосудов опухоли и повы шает эффективность доставки лекарственных аген тов в паренхиму опухоли через сосудистый барьер. Кроме того, iRGD ингибирует спонтанное метастази рование у мышей. При этом антиметастатическая ак тивность обеспечивается нейропилинсвязывающим RXXK, а не интегринсвязывающим RGD-мотивом [83]. Такие пептиды, обладающие адресующими свойствами и одновременно способные глубоко про никать в паренхиму опухоли, образуют отдельный класс пептидов - CPHP (cell penetrating homing peptides) [84]. Показано, что конъюгат iRGD с противоопухоле вым препаратом абраксаном (стабилизированный альбумином паклитаксел) увеличивает эффектив ность действия абраксана и значительно снижает общую токсичность препарата [85, 82]. Кроме того, оказалось, что совместное введение iRGD-пептида с различными лекарственными препаратами (док сорубицин, абраксан, липосомы с доксорубицином, трастузумаб) увеличивает эффективность проникно вения лекарственных средств в паренхиму опухоли и их терапевтический индекс [86]. Таким образом, короткие адресные пептиды, ото бранные из фаговых библиотек, находят все большее применение как в диагностике, так и в клинической практике. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Скрининг фаговых пептидных библиотек - быстрый и удобный метод получения органо-, ткане- и опухо леспецифических пептидов. Безопасность бактерио фагов для человека и простота манипуляций с ними позволили получить огромное количество разнообразных адресных пептидных лигандов. Некоторые из них проходят клинические испытания, причем как в качестве самостоятельных терапевтических средств, так и в качестве агентов, доставляющих ле карственные препараты к органам и тканям-мише ням. Большой интерес вызывает возможность приме нения опухоль-адресованных пептидов в диагно стике и терапии злокачественных новообразований. Небольшие размеры адресных пептидов позволяют им глубоко проникать в паренхиму опухоли, что важ но для таргетной терапии [87, 88]. Короткие пептиды практически неиммуногенны, что делает их безопас ными для клинического применения [89]. Пептиды можно легко модифицировать, например, защитой N- и C-концов от протеолитической деградации [87]. Химический синтез коротких пептидов гораз до дешевле производства моноклональных анти тел и рекомбинантных белков, а конечный продукт не требует дополнительной очистки от компонентов клеточной стенки бактерий или плазматической мембраны эукариот [90]. Опухолеспецифические пептиды являются «клю чами» к огромному массиву информации об изме нениях, происходящих в клетке при канцерогене зе, о механизмах, обеспечивающих выживаемость, пролиферацию и метастазирование раковых клеток. Идентификация мишеней таких пептидов представ ляет очень важную, но часто достаточно нетривиаль ную задачу. При этом опухолеспецифический лиганд может быть использован для адресной доставки диа гностических и лекарственных средств даже при от сутствии информации о мишени.

Об авторах

A. A. Немудрая

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: kuligina@niboch.nsc.ru
Россия

В. A. Рихтер

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: kuligina@niboch.nsc.ru
Россия

E. В. Кулигина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: kuligina@niboch.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы