Клеточные белки Ku и HMGA1 как участники транскрипции ВИЧ-1

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Прошло уже более 30 лет после открытия вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), но вызывае мую им инфекцию до сих пор не удалось победить. Высокоактивная антиретровирусная терапия, при меняемая при ВИЧ-инфекции, позволила значи тельно уменьшить смертность больных СПИДом, однако прерывание терапии неизбежно приводит к возобновлению репродукции вируса и повышению его титра в крови. Одной из причин этого является присутствие в организме человека клеток, содержа щих интегрированный в их геном «спящий» прови рус. «Спящее» состояние, типичное для латентной стадии вирусной инфекции, характеризуется отсут ствием полноценной транскрипции с вирусного про мотора. Однако «спящий» провирус может активиро ваться и при отсутствии терапии вызвать развитие СПИДа [1]. В активной транскрипции с промотора ВИЧ-1 осо бую роль играет расположенная на 5’-конце синтезируемой мРНК шпилечная структура, называемая TAR (trans-activation response). После интеграции вирусной кДНК в геном клетки-хозяина элонгация транскрипции вирусного генома происходит толь ко после связывания TAR с вирусным регулятор ным белком Tat (trans-activator of transcription) [2]. Формирование комплекса TAR-Tat обеспечивает фосфорилирование РНК-полимеразы II, необходи мое для снятия транскрипционного блока и перехода в стадию элонгации [3]. Однако в латентном состо янии вируса белок Tat в клетке не детектируется, и механизм процесса активации транскрипции «спя щего» интегрированного провируса при переходе из латентной в литическую фазу жизненного цикла ВИЧ-1 понятен не до конца. Изучение белков, уча ствующих в активации транскрипции с промотора ВИЧ-1 по Tat-независимому механизму, очень акту ально, поскольку в перспективе позволит понять ме ханизм перехода вируса из латентной фазы в лити ческую и найти подходы к регуляции этого процесса. Недавние исследования показали, что в регуляции уровня транскрипции с промотора ВИЧ-1 в латент ной фазе (базальной транскрипции) может прини мать участие клеточный белок HMGA1 [4, 5]. Еще одним участником регуляции транскрипции может быть клеточный ДНК-связывающий белок Ku - ком понент ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK) [6-10]. В представленном обзоре суммированы дан ные о влиянии белков Ku и HMGA1 на транскрипцию ВИЧ-1, приведены также возможные схемы участия этих белков на регуляцию транскрипции. РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ С ПРОМОТОРА ВИЧ-1 Вирус иммунодефицита человека первого типа при надлежит к роду лентивирусов семейства ретрови русов. Он поражает иммунную систему организма человека и вызывает синдром приобретенного им мунодефицита (СПИД). Геном ВИЧ-1, как и у других лентивирусов, представлен молекулой РНК, на осно ве которой вирусный фермент обратная транскрип таза синтезирует ДНК-копию генома, которая затем встраивается в геном клетки с образованием прови русной ДНК. Однако большая доля вирусной ДНК остается неинтегрированной [11]. Такая ДНК суще ствует главным образом в кольцевой форме. С коль цевых форм вирусной ДНК может осуществляться транскрипция, но основной матрицей для синтеза вирусных белков служит именно интегрированная форма провируса [12]. После интеграции в хромосому зараженной клет ки вирусная ДНК может оставаться в «молчащем» состоянии или активно транскрибироваться. Иными словами, транскрипция может идти малыми тем пами с образованием небольшого числа транскриптов без быстрого прогрессирования инфекции - это базальная, ничем не активируемая транскрипция. Другой вариант - активное протекание транскрип ции с образованием большого количества РНК и но вых вирусных частиц. Регуляция транскрипции ге нома ВИЧ-1, лежащая в основе изменения состояния провируса, зависит от большого набора различных факторов: цис-элементов вирусной ДНК, клеточных транскрипционных факторов, вирусного трансакти ватора Tat, степени конденсации хроматина. Вирусная ДНК, интегрированная в клеточный геном, содержит на своих концах длинные конце вые повторы (LTR). Каждый из них состоит из трех регионов: U3, R, U5 (рис. 1). Транскрипция начи нается на границе U3 и R в 5’-LTR; в регионе U3 располагаются вирусный промотор, узнаваемый РНК-полимеразой II (РНКП II), и некоторые ре гуляторные элементы. В 5’-LTR выделяют четыре функциональных региона, участвующих в регуля ции транскрипции генома ВИЧ-1: модуляторный регион, энхансер, промотор и лидерный регион (рис. 1) [13]. Они содержат множество сайтов свя зывания клеточных факторов транскрипции, в том числе наиболее важных для регуляции транскрип ции с вирусного промотора - NF-κB, NFAT, Sp1, AP-1 (рис. 1). Эти факторы участвуют в инициации транскрипции [1, 13]. Переход провируса из молчащего состояния в активное начинается с инициации транскрип ции. При этом синтезируются короткие абортивные транскрипты длиной около 60-80 нуклеотидов [14], которые образуют на 5’-конце стабильную шпиль ку, называемую TAR. После синтеза TAR РНК наступает пауза: РНКП II останавливается, по скольку с ней связаны факторы, репрессирующие элонгацию - NELF (negative elongation factor) и DSIF (5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole sensitivity-inducing factor) [15]. Для продолже ния транскрипции и перехода в стадию активной элонгации необходимо гиперфосфорилирование С-концевого домена (СКД) РНКП II по остаткам Ser2 в гептапептидных повторах YSPTSPS. Оно обеспе чивается фактором элонгации транскрипции P-TEFb (positive transcription elongation factor b), состоящим из циклинзависимой киназы 9 (Cdk9) и циклина Т1 (СусТ1). В клетках уровень P-TEFb регулируется связыванием с малым ядерным рибонуклеопротеи ном 7SK (7SK мяРНП), который ингибирует киназ ную активность фактора P-TEFb и препятствует элонгации транскрипции [16]. Главным регулятором на стадии элонгации вы ступает вирусный белок Tat, который на поряд ки увеличивает эффективность синтеза РНК [2]. Связывание Tat с синтезированной РНК TAR спо собствует диссоциации P-TEFb из комплекса с 7SK мяРНП и привлекает его к вирусному промотору. В результате P-TEFb обеспечивает гиперфосфори лирование РНКП II, а также факторов NELF и DSIF [17]. Фосфорилирование DSIF превращает его в акти вирующий фактор элонгации, а фосфорилированная форма NELF диссоциирует из транскрипционного комплекса, позволяя РНКП II вести эффективную элонгацию и синтезировать полноразмерные мРНК (рис. 2) [3]. Однако на латентной стадии инфекции Tat не де тектируется в клетке, его нет и в начале выхода провируса из «спящего» состояния. В ряде случа ев формирование комплекса TAR-Tat-P-TEFb невозможно из-за мутаций, нарушающих взаимо действие между компонентами комплекса [18]. Тем не менее все же существует возможность транс крипции с промотора ВИЧ-1. Известно несколько возможных механизмов Tat-независимой актива ции транскрипции. Во-первых, предполагается, что P-TEFb осуществляет необходимое для элон гации транскрипции фосфорилирование СКД РНКП II в отсутствие Tat [19]. При этом в привле чении P-TEFb на вирусный промотор участвуют, по-видимому, некоторые клеточные факторы (Sp1 [20], SEC [14], Brd4 [21, 22], NF-κB [14]) (рис. 2А,Б). Другая возможность - связывание с промото ром ВИЧ-1 другого клеточного белка, отличного от P-TEFb, который может фосфорилировать СКД РНКП II и репрессирующие факторы NELF и DSIF. Несмотря на большой объем информации о регу ляции транскрипции ВИЧ-1 и участии в ней различ ных клеточных факторов, остается много не до конца понятных моментов. В частности, есть два клеточных белка, участвующих в транскрипции ВИЧ-1, роль которых в этом процессе не вполне ясна. Это белки Ku и HMGA1. Существуют данные как об их положи тельной роли в регуляции транскрипции, так и об от рицательной. Тем не менее точные механизмы уча стия этих белков в транскрипции ВИЧ-1 до сих пор не установлены. УЧАСТИЕ Ku В ТРАНСКРИПЦИИ ВИЧ-1 Белок Ku - это гетеродимер, состоящий из двух субъединиц массой примерно 70 и 80 кДа, извест ных как Ku70 (p70) и Ku80 (Ku86, p80). Эти бел ки кодируются генами хrcc6 (Ku70) и хrcc5 (Ku80). Большинство своих функций в клетке Ku выполня ет именно в виде очень прочного гетеродимера [23]. Однако существуют исследования, показывающие, что в некоторых процессах могут действовать изо лированные субъединицы Ku70 и Ku80 [24]. Гетеродимер Ku70/Ku80 - ДНК-связывающий белок, взаимодействующий преимущественно со свободными концами двухцепочечной ДНК, био логические функции которого связаны, в основном, именно с этой его особенностью. Взаимодействие гетеродимера Ku с ДНК довольно прочное - вели чина Kd варьирует в пределах 1.5-4.0 × 10-10 M [25]. Судя по данным рентгеноструктурного анализа [26], Ku70 и Ku80 в составе гетеродимера образуют асим метричное кольцо с широким основанием и тонким мостиком, и в образуемый белком канал помещается ДНК (рис. 3). Канал состоит преимущественно из по ложительно заряженных аминокислотных остатков, взаимодействующих с отрицательно заряженным сахарофосфатным остовом молекулы ДНК, что объ ясняет способность Ku связываться с ДНК незави симо от ее нуклеотидной последовательности. После связывания с концом ДНК Ku может перемещаться («скользить») по ней, останавливаясь на некоторых последовательностях [25, 27]. Наиболее известная и изученная биологическая функция Ku - участие в репарации двухцепочечных разрывов в ДНК путем негомологичного объединения концов (nonhomologous end joining - NHEJ). Ku так же участвует в таких клеточных процессах, как V(D) J-рекомбинация, перестановка мобильных элементов генома, поддержание длины теломер, апоптоз, транс крипция [28, 29]. Одна из важных функций Ku - свя зывание с каталитической субъединицей DNA-PKcs и формирование ДНК-зависимой протеинкиназы DNA-PK. Важно отметить, что каталитическая функция DNA-PK активируется после связывания с ДНК, за которое отвечает гетеродимер Ku [25]. Возможные механизмы Ku-опосредованной регуляции транскрипции Одна из многих функций Ku - участие в регуляции транскрипции. Описано несколько механизмов, с по мощью которых Ku может активировать или пода влять транскрипцию. Первый из них - это прямое, специфичное к нуклеотидной последовательности, взаимодействие Ku с промоторной областью генов. Предполагается, что с помощью такого механизма регулируется транскрипция клеточных генов c-Myc, Hsp70 [30], U1 мяРНК [31], а также ретровирусов HTLV-1 (Human T-lymphotropic virus) [32] и MMTV (mouse mammary tumor virus) [33]. Механизм свя зывания Ku с промотором без участия концов ДНК пока непонятен, однако существуют некоторые дан ные о возможном специфичном к последовательно сти взаимодействии гетеродимера c определенным Ku-связывающим сайтом в ДНК [34]. В районе LTR ретровируса MMTV в области NRE-1 (negative regulatory element 1) идентифици рована последовательность, связывание Ku с которой считается истинно специфичным к последователь ности и более предпочтительным, чем связывание с концами ДНК (рис. 4) [34]. Взаимодействие Ku с этой последовательностью снижает эффективность транскрипции с вирусного LTR. Предполагается, что в этой регуляции участвует каталитическая субъединица DNA-PKcs [33, 35]. Показано, что два фактора транскрипции, связывающиеся с 5’-LTR MMTV и активирующие его транскрипцию, мо гут быть фосфорилированы DNA-PK in vitro: GR (глюкокортикоидный рецептор) [34] и Oct-1 [36]. Возможно, специфичное привлечение DNA-PK на промотор и последующее фосфорилирование фак торов транскрипции представляют собой один из ме ханизмов регуляции транскрипции. В работе [34] указаны все предложенные на тот момент участки связывания Ku в промоторах, го мологичные последовательности NRE-1 в промото ре GR-штамма вируса MMTV (рис. 4). Сообщается, что только эти последовательности способны прямо и специфически взаимодействовать с гетеродимером Ku в отсутствие свободных концов ДНК. Второй механизм, с помощью которого Ku влияет на транскрипцию, это его непосредственное взаимо действие с транскрипционными факторами, вклю чая Oct-1, Oct-2 [36], NF45/NF90 [37], AP-1 [38], Ese-1 [39], YY1 [40], p53 [41]. Некоторые из этих факторов вовлечены в регуляцию транскрипции ВИЧ-1. Кроме того, как уже упоминалось, некоторые транскрипци онные факторы могут служить субстратом для DNAPK in vitro. Способность DNA-PK взаимодействовать как с транскрипционными факторами, так и с целым рядом ядерных рецепторов (AR [42], GR [34], PR [43], ER-α [44]), возможно, предполагает существование некого общего пути участия Ku в передаче клеточ ных сигналов и регуляции транскрипции. Ku может опосредованно регулировать транс крипцию генов, влияя на экспрессию других факто ров транскрипции. Так, в клеточной линии AGS Ku действует как положительный регулятор экспрес сии гена субъединицы p50 фактора NF-κB [45]. Ku80 стимулирует также экспрессию гена c-jun, компо нента транскрипционного фактора AP-1 [38]. Стоит заметить, что NF-κB и AP-1 являются важнейшими регуляторами транскрипции генов ВИЧ-1. Субъединицы Ku70 и Ku80 могут по-разному вли ять на транскрипцию. Так, показано, что субъединицы гетеродимера Ku динамически связываются с промо тором гена интерлейкина 2 (IL-2) и взаимодейству ют c фактором NF45/NF90 в ответ на активацию Т-лимфоцитов [37]. Эта активация приводила к по вышению количества комплекса Ku80/NF90, связан ного с последовательностью ARRE (antigen receptor response element) в промоторе гена IL-2, а количе ство субъединицы Ku70, связанной с этим участком, при этом снижалось [37]. Однако в другой работе ре прессирующую роль Ku в транскрипции гена Hsp70 связывают с субъединицей Ku70, но не Ku80 [30]. Третий механизм транскрипционной регуля ции - прямое взаимодействие гетеродимера Ku или его субъединицы Ku80 с холоферментом РНКП II. Обнаружено, что в ядре Ku80 колокализуется с сайтами элонгации транскрипции [46, 47]. В экспе риментах по коиммунопреципитации показано вза имодействие Ku с элонгационной формой РНКП II, а также с факторами транскрипции, специфичны ми для стадии элонгации, в частности DSIF. Также установлено, что во взаимодействии с этими белка ми ключевую роль играет С-концевой домен Ku80 [48]. Отметим, что in vitro РНКП II может служить субстратом для DNA-PK [49], однако роль фосфори лирования в регуляции транскрипции пока неясна. Четвертый способ участия Ku в регуляции транс крипции связан с его основной функцией в репара ции двухцепочечных разрывов ДНК [50]. Для успеш ной инициации транскрипции с ряда промоторов, регулируемых связыванием с AP-1 и ядерными рецепторами (среди которых есть и взаимодейству ющие с Ku), необходимо внесение двухцепочеч ных разрывов с помощью ДНК-топоизомеразы IIβ. Тогда в присутствии комплекса белков PARP- 1 (poly[adenosinediphosphate (ADP)-ribose] polymerase-1), DNA-PKcs и Ku70/Ku80 происходит репарация этих разрывов и локальные изменения в структуре хроматина. Таким образом, в регуляции транскрипции мо гут участвовать разные субъединицы гетеродиме ра по отдельности, гетеродимер в целом, а также его комплекс с каталитической субъединицей DNAPKcs. Общего механизма действия Ku не выявлено, скорее всего, для каждого конкретного гена суще ствует свой способ Ku-зависимой регуляции. Стоит отметить еще раз, что Ku может выступать и как ак тиватор, и как супрессор; его действие часто зависит от набора субъединиц, вовлеченных в регуляцию. Очевидно, в Ku-зависимой регуляции транскрипции не всегда участвует каталитическая субъединица DNA-PK, однако в определенных случаях ее способ ность к ДНК-зависимому фосфорилированию фак торов транскрипции и самой РНКП II может быть ключевым элементом регуляции. Роль Ku в транскрипции ВИЧ-1 Важность Ku для поддержания жизненного цикла ВИЧ-1 показана в многочисленных исследованиях. Субъединица Ku70 является частью предынтегра ционного комплекса и взаимодействует с интегразой ВИЧ-1 [51, 52]. Субъединица Ku80 обнаружена в со ставе вириона [53], куда может включаться на стадии формирования новой вирусной частицы в ранее за раженной клетке. Известно, что для успешной ин теграции вирусной кДНК в геном клетки-хозяина необходимо репарировать одноцепочечные разры вы, которые образуются при встраивании вирусной ДНК в клеточную. Считается, что в этом процессе могут участвовать белки из системы NHEJ, в част ности, гетеродимер Ku70/Ku80 [54]. Так, в клетках, дефектных по Ku80, DNA-PKcs, Xrcc4 (X-ray repair cross-complementing protein 4) и ДНК-лигазе IV, су щественно снижена эффективность трансдукции лентивирусных векторов [55, 56]. Ku участвует так же в формировании кольцевой формы вирусной ДНК из неинтегрированной линейной ДНК [57-59]. Первые сведения об участии Ku в регуляции транскрипции ВИЧ-1 были получены в начале 2000-х гг. Однако до сих пор нет четкой картины того, как осуществляется эта регуляция. Получены дан ные в пользу как положительного, так и отрицатель ного влияния Ku на транскрипцию генома ВИЧ-1. Впервые роль Ku в транскрипции с вирусного 5’- LTR начали изучать на линии клеток xrs-6, вари анте клеток CHO-K1 (клетки яичников китайских хомячков), в которых не экспрессируется ген Ku80. В этих клетках наблюдали повышение экспрессии с плазмиды, содержащей ген CAT (хлорамфени кол-ацетилтрансфераза) под контролем вирусного промотора из 5’-LTR [6]. Стабильная трансфекция клеток xrs-6 вектором, несущим ген Ku80 челове ка, приводила к снижению экспрессии CAT. Таким образом, Ku80 негативно влияет на транскрипцию с 5’-LTR-промотора ВИЧ-1. Отрицательная роль Ku80 подтверждена на линии клеток U1 человека, содержащей в геноме интегрированный провирус и служащей моделью латентного состояния ВИЧ-1. Оказалось, что снижение количества эндогенного Ku80 в клетке приводит к повышению уровня транс крипции генов ВИЧ-1 - как базального, так и инду цированного воздействием TNFα. Учитывая, что Ku негативно влияет на транскрип цию с других ретровирусных промоторов (MMTV, HTLV-1) [32, 33], провели поиск Ku-связывающего сайта в 5’-LTR ВИЧ-1 и обнаружили в области NRE-1 участок (-217/-197), который обладает доста точно высоким сходством с Ku-связывающим сайтом в NRE-1 MMTV (рис. 5) [6]. Были предложены не сколько вариантов подавления транскрипции ВИЧ-1 с помощью Ku. Принимая во внимание, что Ku может связываться с факторами транскрипции Oct-1 и Oct- 2 [36], которые репрессируют и базальную, и Tat активированную транскрипцию ВИЧ-1, предполо жили [6], что связывание Ku в модуляторном регионе (рис. 5А) способствует привлечению этих факторов к промотору ВИЧ-1. Не исключена также возмож ность участия Ku в регуляции структуры хроматина. NRE-1 содержит сайт связывания ядерного матрикса [60], который перекрывается с предсказанным Ku связывающим сайтом. Возможно, взаимодействие Ku и ядерного матрикса на этом участке препятствует транскрипции, активируемой NF-κB. В следующей работе этой же группы [7] сообща лось об отрицательном влиянии Ku80 на транскрип цию с ретровирусных векторов. При этом оказалось, что независимо от использованного в лентивирусной системе промотора, транскрипция с него была ак тивнее в отсутствие Ku80. Иными словами, влияние Ku80 на экспрессию ретровирусных векторов оказа лось неспецифичным к последовательности и, следовательно, Ku-связывающий сайт, предложенный в [6], не мог полностью объяснить механизм отрица тельной регуляции транскрипции. Отмечено также, что Ku80 не влияет на эффективность трансдукции и интеграции лентивирусных векторов. Вместе с тем, Ku-зависимая регуляция не наблюдалась при ис пользовании в качестве матрицы не псевдотипиро ванного вируса, а плазмидных векторов с теми же промоторами. Предполагается, что Ku80 не прямо влияет на транскрипцию, а направляет интеграцию лентивирусных векторов в транскрипционно неак тивные регионы. В противоположность результатам, приведенным выше, в линиях клеток MAGI и CEM-T4 человека Ku играет положительную роль в регуляции транс крипции с промотора ВИЧ-1 [8]. Более того, введение в клетки siРНК, направленных против Ku80, приво дило к снижению эффективности интеграции вирус ного генома в ДНК зараженной клетки, а также к на рушению Tat-TAR-трансактивации. Положительное влияние гетеродимера Ku на транскрипцию генома ВИЧ-1 отмечено и в работе [9], в которой использовали клетки человека линии HCT 116 дикого типа и их вариант Ku80+/-, трансду цированные лентивирусными векторами на основе ВИЧ-1. Предварительно было показано, что в клет ках HCT 116 Ku80+/-, содержание Ku80 в которых снижено в 2 раза, понижен также уровень Ku70. Оказалось, что двукратное снижение уровня эндо генного Ku в клетках приводит к снижению эффек тивности вирусной транскрипции. Важно отметить, что, в отличие от данных [7], этот эффект был специфичен для вирусного LTR, поскольку изменение уровня гетеродимера Ku не влияло на транскрип цию с других промоторов. Кроме того, оказалось, что в опосредованной Ku регуляции транскрипции не участвуют вирусные белки, и эффект Ku не за висит от Tat-трансактивации. Влияние Ku на транс крипцию было заметно и в присутствии Tat, однако более ярко эффект Ku проявлялся при базальном уровне транскрипции с неактивированного провиру са, когда Tat в клетке не детектируется. Интересно, что Ku влияет на базальную транскрипцию ВИЧ-1 только на начальных сроках после интеграции ви русного генома, и снижение уровня Ku в клетках спо собствует установлению и поддержанию латентности вируса. Известно, что Ku80 включается в вирион при его сборке [53]. Следовательно, на транскрипцию про вируса в зараженной клетке может влиять как эн догенный Ku80, так и Ku80, пришедший из вирио на, поэтому, чтобы исключить влияние последнего, лентивирус собирали в клеточной линии с понижен ным содержанием гетеродимера Ku [9]. Оказалось, что на транскрипцию в клетке-мишени влияет имен но эндогенный Ku. Стоит отметить, что участие предсказанного ра нее Ku-связывающего сайта в 5’-LTR ВИЧ-1 в Ku опосредованной регуляции транскрипции провируса было опровергнуто также в работе [9]. Замена этого сайта на случайную последовательность не влияла на Ku-зависимую регуляцию транскрипции. Еще один важный момент данной работы - от сутствие влияния Ku на транскрипцию с кольцевых форм вирусной ДНК. Учитывая, что согласно [7], Ku не влиял на транскрипцию с промотора ВИЧ-1 в со ставе плазмидного вектора, можно сделать вывод, что Ku стимулирует транскрипцию только с прови руса, интегрированного в геном. Необходимо отдельно отметить работу [10], в которой изучено возможное участие в регуля ции транскрипции ВИЧ-1 не только гетеродимера Ku70/Ku80, а всей ДНК-зависимой протеинкиназы DNA-PK. Эксперименты проводили на клетках линии Jurkat-E4, ДНК которых несла интегрированный геном ВИЧ-1 и служила моделью лимфоцитов в ла тентной фазе инфекции. Оказалось, что на промоторе ВИЧ-1 присутствует DNA-PK, причем ее располо жение коррелирует с положением РНКП II. Также установлено, что при активации транскрипции зна чительно повышается количество DNA-PK и РНКП II не только на промоторе, но и в большей степени на транскрибируемой области генома. Показано также [10], что DNA-PK может фосфо рилировать С-концевой домен РНКП II. Более того, в экспериментах in vitro установлено, что DNA-PK фосфорилирует преимущественно Ser2, а не Ser5 или Ser7 в гептапептидных повторах YSPTSPS. Учитывая, что именно фосфорилирование Ser2 не обходимо для активации элонгации, предположили, что участие DNA-PK может быть важным, в пер вую очередь, на стадии элонгации транскрипции. Возможно, на промоторе ВИЧ-1 DNA-PK взаимодей ствует непосредственно с РНКП II, и именно DNAPK может действовать как фактор, который фос форилирует полимеразу и снимает элонгационный блок. Так или иначе, параллельное распределение DNA-PK и РНКП II вдоль провируса и их одновре менное рекрутирование в ответ на активацию транс крипции позволяют предположить, что DNA-PK (и Ku как ее составная часть) входит в состав большого транскрипционного комплекса, вовлеченного в экс прессию генов ВИЧ-1. Помимо этого, показано, что DNA-PK положитель но влияет на транскрипцию с 5’-LTR ВИЧ-1 и лен тивирусных векторов [10]. Нокдаун каталитической субъединицы DNA-PK в клетках Jurkat приводит к значительному снижению экспрессии генов, нахо дящихся под контролем LTR, и незначительно влия ет на экспрессию с другого промотора (CMV). Таким образом, нокдаун как DNA-PKcs [10], так и Ku80 [9] приводит к снижению уровня транскрипции именно с промотора LTR. Подводя итог описанию роли белка Ku в регуляции транскрипции ВИЧ-1, необходимо отметить, что по лученные к настоящему времени данные достаточно противоречивы. Возможно, это связано с использо ванием разных клеточных линий и разных вирус ных систем. Так, большинство данных о негативной регуляции получены на клетках грызунов, которые, очевидно, не могут служить полноценной моделью процессов, происходящих в клетках человека, ин фицированных ВИЧ-1. Тем не менее данные, полу ченные на клетках человека, позволяют сделать не сколько достоверных выводов. Первое общее наблюдение - зависимость Ku опосредованной регуляции транскрипции от вирус ного LTR. Механизм этой регуляции пока не понятен, но нельзя исключить возможности прямого связы вания гетеродимера и LTR, хотя предполагаемый в работе [6] Ku-связывающий сайт в составе LTR, по видимому, не является ключевым элементом в Ku зависимой регуляции транскрипции ВИЧ-1, в отли чие от MMTV и HTLV-1. Во-вторых, для Ku-опосредованной регуляции транскрипции ВИЧ-1 и лентивирусных векторов на его основе важен именно интегрированный про вирус. Хотя транскрипция ВИЧ-1 может осущест вляться и с кольцевых ДНК, очевидно, что Ku не уча ствует в ее регуляции. Возможно, это объясняется тем, что привлечение гетеродимера к провирусу про исходит в процессе интеграции или непосредственно после нее. Отметим еще раз, что остается много вопросов о механизме участия Ku в регуляции транскрипции ВИЧ-1. Так или иначе, даже если считать включе ние гетеродимера Ku70/Ku80 или целой DNA-PK в состав транскрипционного комплекса установлен ным фактом, способ их влияния на экспрессию ге нов ВИЧ-1 не выяснен, и выяснение их роли в транс крипции ВИЧ-1 остается важным и актуальным. РОЛЬ HMGA1 В ТРАНСКРИПЦИИ ВИЧ-1 Еще один клеточный белок, роль которого в жиз ненном цикле ВИЧ-1 мало изучена, - это HMGA1 (high mobility group protein A1, прежнее назва ние - HMG I[Y]), ДНК-связывающий белок хромати на негистоновой природы. HMGA1 имеет три ДНК связывающих мотива, которые предпочтительно связываются с малой бороздкой ДНК в AT-богатых участках (A/T hook) [61]. Вместе с тем, HMGA1 ско рее распознает пространственную структуру ДНК, нежели нуклеотидную последовательность: он пред почтительнее взаимодействует с изогнутыми и су перскрученными ДНК, с ДНК, структура которых отличается от классической В-формы. Этот белок в свободном состоянии имеет неупорядоченную про странственную структуру. При взаимодействии с ДНК он претерпевает конформационные измене ния, способствуя АТР-независимому расплетанию, суперскручиванию и изгибанию ДНК [62, 63]. Эта способность изменять структуру хроматина опре деляет широкий спектр функций, выполняемых HMGA1 в ядре клетки. Вообще, все белки, входящие в семейство группы с высокой подвижностью («high mobility group»), об ладают способностью хорошо связывать как ДНК, так и белки, что позволяет им участвовать в боль шом количестве процессов [64]. Изменение струк туры хроматина, вызываемое связыванием HMGA, стимулирует или подавляет такие ДНК-зависимые процессы, как транскрипция, репликация, репарация. HMGA1 считается архитектурным фактором транскрипции, что подчеркивает его значение в ор ганизации мультибелковых комплексов, собираю щихся на промоторе [62-64]. Способность HMGA1 взаимодействовать с коровыми гистонами и вытес нять с ДНК линкерный гистон H1 приводит к реор ганизации хроматина и открытию сайтов посадки транскрипционных факторов (рис. 6). HMGA1 игра ет важную роль в регуляции сборки или разборки энханосомы, тем самым влияя на транскрипцию. Неоднократно показано прямое взаимодействие HMGA1 с другими хроматинремоделирующими белками и факторами транскрипции (Sp1, TFIID, NF-κB, ATF-2, SRF, Oct2, c-Rel). [62, 63]. Способность HMGA1 изгибать ДНК при связывании, возможно, облегчает пространственное сближение энхансерного и промоторного участков генов. Участие HMGA1 в жизненном цикле ВИЧ-1 пока зано неоднократно. Этот белок обнаружен в составе предынтеграционного комплекса [65]. Установлено, что HMGA1 стимулирует интеграцию ДНК ВИЧ-1 в клеточный геном [66, 67]. Предполагается, что HMGA1 связывает и изгибает вирусную ДНК, что приводит к сближению ее концов и способству ет их связыванию с интегразой. При этом не наблю дали прямого взаимодействия HMGA1 и интегразы ВИЧ-1. Однако в других работах оспаривается уча стие HMGA1 в интеграции ретровируса, посколь ку отсутствие HMGA1 в инфицированных клетках не влияло на встраивание вирусного генома [68]. К настоящему времени получены некоторые, так же неоднозначные, свидетельства в пользу участия HMGA1 в транскрипции ВИЧ-1. С помощью футпринтинга ДНКазой I в области -187/+230 в составе 5’-LTR ВИЧ-1 обнаружены воз можные сайты связывания HMGA1 (R1-R5 на рис. 7) [69]. Изучено также взаимодействие HMGA1 и фак тора транскрипции AP-1, которые, как оказалось, имеют общий сайт связывания (R5 на рис. 7). Этот сайт находится на границе репрессирующей нукле осомы nuc-1, которая существует на провирусе ря дом с местом старта транскрипции в латентной фазе и разрушается при активации транскрипции вирус ного генома (рис. 7). Оказалось, что HMGA1 способ ствует связыванию AP-1, важного индуцируемого активатора транскрипции ВИЧ-1, с вирусной ДНК в ответ на внешние стимулы, активирующие экс прессию вируса. Вероятно, HMGA1 участвует в реорганизации nuc-1, конкурируя за этот сайт и тем самым освобождая его для AP-1. Таким образом, предполагается, что HMGA1 может быть положи тельным регулятором транскрипции ВИЧ-1 [69]. Подтверждена роль HMGA1 как архитектурного фактора транскрипции, участвующего в реоргани зации нуклеосомы nuc-1 [70]. Оказалось, что в ответ на индукцию вирусной транскрипции с помощью PMA (phorbol myristate acetate - активатор NF-κB) HMGA1 способствует связыванию субъединицы ATF-3 фактора AP-1 с сайтом R3 на границе nuc-1 (рис. 7). Это позволяет привлечь к репрессирующей нуклеосоме АТР-зависимый хроматинремоделирую щий комплекс SWI/SNF, что необходимо для эффек тивной активации вирусной транскрипции. Недавно был предложен еще один возможный спо соб участия HMGA1 в регуляции транскрипции [71]. Оказалось, что HMGA1 связывается с РНК-петлей L2 в 7SK мяРНП. Как отмечалось выше, главная функция 7SK РНК - регуляция количества свобод ного фактора P-TEFb, активирующего элонгацию транскрипции [17]. Этот фактор взаимодействует с петлей L1 и белком HEXIM1 в составе 7SK мяРНП. В результате может образоваться сложный комплекс HMGA1 с 7SK мяРНП и P-TEFb. Роль этого комплек са в регуляции транскрипции может быть двоякой (рис. 8) [72]. Во-первых, HMGA1 может связывать ся непосредственно с ДНК или каким-либо транс крипционным фактором на промоторе и привлекать P-TEFb к приостановленному элонгационному ком плексу РНКП II (рис. 8А). Во-вторых, связывание 7SK с HMGA1 регулирует количество свободного HMGA1, способного взаимодействовать с ДНК и вы полнять свои функции в разных процессах (рис. 8Б). Предполагается, что реализуемый механизм зависит от конкретного гена. В случае регуляции транскрипции ВИЧ-1 факто ром, взаимодействующим с HMGA1 и привлекаемым за счет этого к элонгационному комплексу, может быть Sp1. Известно, что этот фактор, с одной сторо ны, участвует в транскрипции ВИЧ-1 [1, 13], а с дру гой, взаимодействует непосредственно с HMGA1 [62]. Таким образом, при транскрипции с 5’-LTR ВИЧ-1 HMGA1 может участвовать в P-TEFb-зависимой ак тивации элонгации по схеме, приведенной на рис. 8А [72], и, следовательно, проявлять стимулирующий эффект. Еще один механизм влияния HMGA1 на транс крипцию ВИЧ-1 был найден при изучении экспрес сии репортерного белка с плазмиды, в которой его ген контролировался вирусным 5’-LTR [4]. В этом случае оказалось, что HMGA1 обладает репрессирующим действием. Детальное исследование механизма дей ствия HMGA1 показало, что HMGA1 способен свя зываться с TAR РНК, структура концевого участка которой похожа на структуру петли L2 в 7SK РНК в составе мяРНП (рис. 9), причем HMGA1 может конкурировать с вирусным белком Tat за связыва ние с TAR РНК. Это обуславливает отрицательное влияние HMGA1 на транскрипцию ВИЧ-1 как в при сутствии Tat, так и в его отсутствие. Изучено влия ние сверхэкспрессии и нокдауна гена HMGA1 и пет ли L2 из 7SK РНК на транскрипцию с промотора ВИЧ-1 в присутствии и в отсутствие Tat. Оказалось, что HMGA1 снижает и базальную, и активированную Tat транскрипцию с промотора ВИЧ-1, которая ча стично восстанавливается при сверхэкспрессии пет ли L2. На основании этого эксперимента предложена модель репрессии, опосредованной HMGA1 (рис. 10) [4]. Согласно этой модели, HMGA1 мешает связыва нию TAR РНК с Tat, а при отсутствии Tat с неким, пока не описанным, клеточным кофактором вирус ной транскрипции. Петля L2 в 7SK РНК конкурирует с TAR за HMGA1, разрушая их комплекс и забирая белок с промотора ВИЧ-1. Это способствует акти вации транскрипции. Однако вопрос о существова нии и природе клеточного кофактора, участвующего в этом процессе, остается открытым. Предложена и другая модель репрессирующе го действия HMGA1 на транскрипцию с промотора ВИЧ-1 [5]. В регуляции транскрипции ВИЧ-1 важное место занимают факторы, связанные с реорганиза цией хроматина и среди них такой белок, как CTIP2. Присутствие CTIP2 на промоторе приводит к репрес сии транскрипции интегрированного генома ВИЧ- 1 и характерно для латентного состояния вируса. CTIP2 осуществляет привлечение гистон-деацети лаз и гистон-метилтрансфераз и участвует таким образом в конденсации хроматина [73]. Кроме этого, CTIP2 взаимодействует с факторами Sp1 и COUPTF, репрессируя начальные стадии транскрипции ВИЧ-1 [74], а также участвует в делокализации Tat и связывании его с белком HP1, ассоциирован ным с гетерохроматином [75]. Недавно показали, что CTIP2 взаимодействует с 7SK мяРНП, связы ваясь с петлей L2 и белком HEXIM1. В составе это го комплекса CTIP2 участвует в репрессии киназы Cdk9, входящей в состав P-TEFb [76]. Установлено, что HMGA1 может связываться с CTIP2 [5]. Более того, транскрипция ряда клеточных генов негатив но регулируется обоими белками, при этом часть ге нов транскрибируется по P-TEFb/7SK-зависимому механизму [5]. Предложена модель совместной ре гуляции транскрипции этих генов белками HMGA1 и CTIP2. Предполагается, что HMGA1 может при влекать к промоторам регулируемых генов сам CTIP2 или комплекс CTIP2/P-TEFb/7SK мяРНП (рис. 11) [5]. Показано, что HMGA1 и CTIP2, взаимодействуя с промотором ВИЧ-1, синергически репрессируют базальную транскрипцию [5]. Нокдаун гена HMGA1 приводит к значительному снижению количества CTIP2 и P-TEFb/7SK мяРНП, привлеченного на ви русный промотор, и, таким образом, восстанавливает уровень транскрипции с него. Таким образом, пред полагается, что на 5’-LTR запускается механизм опосредованной HMGA1 отрицательной регуляции транскрипции, подобный приведенному на рис. 11. Тем не менее в случае ВИЧ-1 остается непонят ным, какой участок ДНК или фактор, связанный c LTR, участвует в привлечении комплекса HMGA1/ CTIP2/7SK мяРНП. Не ясна и роль связывания TAR и HMGA1 в опосредованной HMGA1/CTIP2 репрес сии базальной транскрипции. Не изучено также, влияет ли HMGA1 непосредственно на связывание CTIP2 с вирусной ДНК, как в случае с активатором транскрипции AP-1 [69]. Таким образом, HMGA1 может служить как ак тиватором, так и репрессором транскрипции ВИЧ- 1. При этом показано его положительное действие на индуцируемую транскрипцию, в то время как от рицательное - на базальную. Возможно, действие внешних индукторов запускает смену белков-пар тнеров HMGA1 и последующее изменение пути HMGA1-опосредованной регуляции транскрипции. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несмотря на активное изучение особенностей транс крипции ВИЧ-1, многие моменты остаются не до кон ца понятными. Хорошо известно, что элонгация транскрипции вирусного генома происходит после связывания TAR РНК с вирусным регуляторным белком Tat, который, взаимодействуя с мультибел ковым фактором элонгации транскрипции P-TEFb, привлекает его на вирусный промотор. Входящая в состав P-TEFb циклинзависимая киназа Cdk9 осу ществляет необходимое для элонгации фосфорили рование РНКП II. Однако возникает вопрос, каким образом активируется транскрипция «спящего» ин тегрированного вируса, когда в клетке отсутствует белок Tat? Тем не менее провирус способен транс крибироваться на базальном уровне. Предполагается, что в таких случаях фосфорилирование РНКП II, необходимое для снятия транскрипционного блока и перехода в стадию элонгации, может активиро ваться с помощью клеточных факторов. Возможно также, что какие-то клеточные факторы привлекают P-TEFb на промотор. Регуляция транскрипции ВИЧ-1 - процесс, в кото ром участвует множество клеточных белков, однако роль не всех из них полностью понятна. К числу та ких «непонятых» факторов относятся два клеточных белка - Ku и HMGA1, описанные в настоящем об зоре. Получены данные и о стимулирующем, и о ре прессирующем влиянии обоих белков на экспрессию генов ВИЧ-1. Зачастую их роль особенно заметна при базальной транскрипции. Большая часть исследований, выполненных на клетках человека, показывает, что гетеродимер Ku активирует транскрипцию с промотора ВИЧ- 1. В ряде работ описана важность каталитической субъединицы DNA-PK для активации транскрип ции. Предложена гипотеза об участии DNA-PK на стадии элонгации транскрипции [10]. Отметим, что способность DNA-PK фосфорилировать РНКП II делает эту киназу привлекательным кандидатом на роль белкового фактора, активирующего элон гацию транскрипции вирусных генов в отсутствие Tat. В процессе регуляции транскрипции ВИЧ-1 ар хитектурный фактор HMGA1 может воздействовать на состояние хроматина. В этом случае наблюдается положительное действие HMGA1. С другой стороны, показанное in vitro взаимодействие HMGA1 и TAR, по-видимому, приводит к подавлению базальной транскрипции генов ВИЧ-1 и важно для поддержа ния латентности [4]. Еще одним способом HMGA1 опосредованного подавления транскрипции может быть привлечение к промотору репрессирующего транскрипционного фактора, входящего в состав 7SK мяРНП, с которым способен связываться HMGA1. Возможно, не существует единого механизма уча стия HMGA1 в регуляции транскрипции генов ВИЧ- 1, а функция этого белка зависит от фазы инфекции и активности других клеточных белков. Так или ина че, выяснение механизмов влияния Ku и HMGA1 на транскрипцию ВИЧ-1 может привести к созда нию новых путей воздействия на репликацию этого опасного вируса.

Об авторах

O. A. Шадрина

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: gottikh@belozersky.msu.ru
Россия

E. С. Княжанская

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: gottikh@belozersky.msu.ru
Россия

С. П. Королев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: gottikh@belozersky.msu.ru
Россия

M. Б. Готтих

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: gottikh@belozersky.msu.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы