Мини-бактенецины ChBac7.5Nα и ChBac7.5Nβ - антимикробные пептиды из лейкоцитов козы Capra hircus
- Авторы: Шамова O.В.1,2, Орлов Д.С.1,2, Жаркова M.С.1, Баландин С.В.3, Ямщикова E.В.1, Кнаппе Д.4, Хоффманн Р.4, Кокряков В.Н.1,2, Овчинникова T.В.3
-
Учреждения:
- Институт экспериментальной медицины
- Санкт-Петербургский государственный университет
- Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
- Лейпцигский университет
- Выпуск: Том 8, № 3 (2016)
- Страницы: 136-146
- Раздел: Экспериментальные статьи
- Дата подачи: 17.01.2020
- Дата публикации: 15.09.2016
- URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10436
- DOI: https://doi.org/10.32607/20758251-2016-8-3-136-146
- ID: 10436
Цитировать
Аннотация
Антимикробные пептиды (АМП) нейтрофилов играют важную роль в осуществлении защитных функций организма человека и животных. Из лейкоцитов домашней козы Capra hircus нами выделены два пептида (средние молекулярные массы 2895.5 и 2739.3 Да), обладающие высокой антимикробной активностью и представляющие собой N-концевые фрагменты (1-22 и 1-21) пролин-богатого пептида бактенецина 7.5 козы, структура гена которого представлена в базах данных, но соответствующий белковый продукт до настоящего времени не был выделен. Полученные АМП названы минибактенецинами (miniChBac7.5Nα и mini-ChBac7.5Nβ) по аналогии с описанным ранее С-концевым фрагментом бактенецина 7.5, выделенным из лейкоцитов овцы [Anderson, Yu, 2003]. Мини-бактенецины козы в концентрации 0.5-4 мкМ проявляют высокую антимикробную активность в отношении грамотрицательных бактерий, включая устойчивые к ряду применяемых в медицине антибиотиков штаммы Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Acinetobacter baumannii, а также некоторых штаммов грамположительных бактерий (Listeria monocytogenes EGD, Micrococcus luteus). Исследуемые пептиды, как и большинство пролин-богатых АМП, оказывают антимикробное действие без существенного повреждения бактериальных мембран, обладают липополисахарид-связывающей активностью. Минибактенецины не токсичны по отношению к культивируемым клеткам человека, что дает основание рассматривать их как перспективные прототипы новых антибактериальных терапевтических препаратов. Обнаружение высокоактивных фрагментов антимикробного пептида в нейтрофилах козы свидетельствует в пользу гипотезы о том, что фрагментация АМП кателицидинового семейства важна для образования функционально активных молекул, в ряде случаев более активных, чем полноразмерные пептиды, и может играть значимую роль в антиинфекционной защите.
Ключевые слова
Полный текст
ВВЕДЕНИЕ В защите человека и животных от возбудителей ин фекционных заболеваний участвуют антимикробные пептиды (АМП) - катионные молекулы, содержащи еся в лейкоцитах, клетках барьерного эпителия и не которых других типах клеток. Кроме антимикроб ной активности АМП обладают и иными свойствами, в том числе иммуномодулирующими, что позволяет рассматривать эти соединения как прототипы новых антибиотических лекарственных средств комплекс ного действия. С этой точки зрения особый интерес представляют АМП семейства кателицидинов - об ширной группы пептидов, широко распространен ных у позвоночных. Пептиды данного семейства образуются из белков-предшественников путем протеолитического отщепления N-концевой части (кателиноподобного домена) от С-концевого участ ка, представляющего собой зрелый АМП. Протеолиз происходит при активации нейтрофильных грануло цитов и клеток барьерного эпителия при инфекци онных процессах. У некоторых кателицидинов, на пример, кателицидина человека LL-37, процессингу подвергается и молекула зрелого АМП [1], что при водит к появлению фрагментов, каждый из которых имеет свой спектр биологических свойств, включая антибактериальную, противоопухолевую и другие виды активности. Подобное протеолитическое рас щепление пептидов описано и для бактенецинов овцы [2]. Предполагается, что фрагментация зрелых АМП имеет биологический смысл, и именно эти фрагменты могут играть ключевую роль в осуществлении мно жественных защитных реакций [1, 2]. Из известных к настоящему времени АМП ка телицидины животных отряда парнокопытных привлекают особое внимание благодаря высокой антимикробной активности и сочетанию свойств, де лающих эти пептиды перспективными для практи ческого применения. В число пептидов, полученных из лейкоцитов парнокопытных, входят такие АМП, как протегрины, PR-39 свиньи [3, 4]; бактенецины, ВМАР-27, -28, додекапептид, индолицидин быка [5-8]; SMAP-29 овцы [9] и др. Некоторые из этих пептидов стали объектами детальных исследований, направленных на разработку лекарственных препа ратов. Интересно, что в нейтрофилах ряда парноко пытных, в том числе коз, отсутствуют АМП семей ства дефенсинов [10], что свидетельствует о важной роли кателицидинов в защите этих животных от ин фекций. Таким образом, изучение АМП нейтрофилов парнокопытных актуально как для возможного об наружения новых биологически активных молекул, которые могут служить прототипами лекарствен ных средств, так и для развития фундаментальных представлений о роли кателицидинов в иммунитете. Целью представленной работы стал поиск и харак теристика новых АМП лейкоцитов домашней козы Capra hircus. Ранее из лейкоцитов козы нами уже были получены два пептида - бактенецины ChBac5 и ChBac3.4 [11, 12]. В данной работе изучены и другие АМП. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Реагенты Использовали хлорид натрия (S9625), трис( гидроксиметил) аминометан (T1503), агаро зу (Type I, low EEO, A6013), трифторуксусную (302031) и гептафтормасляную (52411) кислоты, о-нитрофенил-β-D-галактопиранозид (N1127), МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид; M5655), бромистый цетилтриметиламмоний (H6269) фирмы Sigma, США; нитроце фин (484400) фирмы Calbiochem, США; уксусную кислоту, хлористый аммоний, ацетат натрия фир мы «Вектон», Россия; эмбриональную телячью сы воротку (1.1.8.3.), питательные среды RPMI-1640 (1.3.4) и DMEM (1.3.5.1.) фирмы «Биолот», Россия для культивирования клеток; питательную среду Сабуро (бульон) сухой ЗАО НИФЦ, Россия; пита тельный бульон Мюллера-Хинтона (M391) фир мы HiMеdia, Индия. В качестве пептидов сравне ния использовали химически синтезированные пептиды - протегрин 1, любезно предоставлен ный Р. Лерером (Калифорнийский университет г. Лос-Анджелеса, США) и бактенецины ChBac5, ChBac5 20-43 и ChBac3.4, любезно предоставленные Н.И. Колодкиным («Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА). Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитов домашней козы Лейкоцитарную массу, обогащенную нейтрофилами, получали из крови взрослых здоровых коз (C. hircus). Гемолиз эритроцитов осуществляли раствором хло ристого аммония. Из 1 л цельной крови получали 2.5 г лейкоцитарной массы (на сырой вес). Использовали два варианта экстракции белков. В первом случае клетки разрушали гомогенизацией в 10% раство ре уксусной кислоты, гомогенат суспендировали на магнитной мешалке при 4оС в течение 18-24 ч, затем центрифугировали при 15000 g в течение 1 ч. Супернатант высушивали, перерастворяли в 0.1 М трис-HCl-буфере рН 7.5 и инкубировали при 37оС в течение 4 ч для расщепления предшественников кателицидинов. Во втором случае для экстракции использовали 0.3% раствор бромистого цетилтриме тиламмония в 0.02 М натрий-ацетатном буфере рН 4.5. При использовании данного метода экстракции создавались условия для осуществления фермен тативных реакций уже в ходе процесса экстракции. Полученный после экстракции материал подвергали ультрафильтрации через мембрану YM-10 (НОММ 10 кДа) фирмы Amicon (США) для отделения низ комолекулярной белковой фракции, далее концен трировали и обессоливали при ультрафильтрации через мембрану YM-1 (НОММ 1 кДа). Материал, содержащий кислоторастворимые полипептиды с молекулярной массой менее 10-15000 Да, наноси ли на электрофоретическую колонку для разделе ния с помощью препаративного электрофореза (ЭФ) в 12.5% полиакриламидном геле в кислой буферной системе в присутствии мочевины [13] в аппарате фирмы Bio-Rad (США) при непрерывной элюции белков из геля. Фракции, в которых была выявлена антимикробная активность, отбирали и разделяли содержащиеся в них пептиды с помощью несколь ких последовательных циклов обращенно-фазо вой высокоэффективной жидкостной хроматогра фии (ОФ ВЭЖХ) на установке Gold System фирмы Beckman (США) с использованием колонок Vydac C-18 (4.6 × 250 мм; диаметр частиц сорбента 5 мкм). Чистоту полученных после ОФ ВЭЖХ фракций оценивали с помощью аналитического ЭФ [14], масс спектрометрии, а также аналитической ОФ ВЭЖХ. Концентрацию белка в очищенных препаратах определяли по методу Брэдфорд, а также по мето ду Вольфа [15]. Концентрацию растворов химически синтезированных пептидов рассчитывали по сухому весу порошка пептида. Оценка антимикробной активности пептидов Для характеристики антимикробной активности мини-бактенецинов использовали два метода - ме тод радиальной диффузии в агарозном геле и метод серийных разведений в жидкой питательной среде. Штаммы микроорганизмов любезно предоставлены Р. Лерером (Калифорнийский университет г. Лос- Анджелеса, США), А. Тосси (университет г. Триеста, Италия), Е.И. Ермоленко («ИЭМ»); сотрудниками Военно-медицинской академии; Г.Е. Афиногеновым (РНИИТО им. Вредена Минздрава России). Использован клинический изолят Pseudomonas aeruginosa, устойчивый к азтреонаму, цефтазидиму, цефотаксиму, клинический изолят Klebsiella spp., устойчивый к тетрациклину (оба штамма получены из мочи больного циститом), клинический изолят Acinetobacter baumannii, устойчивый к меропене му (из инфицированной раны); клинический изолят Staphylococcus intermedius (из инфицированной раны, полученной после укуса собакой), устойчи вый к ципрофлоксациму, цефуроксиму, клиндами цину, эритромицину, рифампицину, гентамицину, бензпенициллину, оксациллину; клинический изо лят дрожжеподобного грибка Candida parapsilosis, устойчивый к амфотерицину и клотримазолу (соскоб с ногтевой пластины). Метод радиальной диффузии в агарозных гелях. Применяли методику, предложенную Лерером и др. [16] и подробно описанную [12]. Для количественной оценки антибиотического действия АМП измеряли диаметр зоны ингибирования роста микробов вокруг лунок в агарозном геле, в которые были внесены пептиды. За 1 условную единицу принимали размер 0.1 мм. Из измеренного значения вычитали 20 единиц, соответствующих диаметру лунки. Минимальную ингибирующую рост микробов концентрацию (МИК) АМП определяли, строя графики зависимости анти микробной активности пептидов от их концентра ции в программе Sigma Plot 11 (Systat Software Inc., США) и рассчитывая значение для точки пересе чения графика линейной регрессии с осью абсцисс (концентрация пептидов в мкМ), которое и прини мали за МИК. В каждом опыте использовали по две параллельных пробы. Опыты повторяли 3 раза, рас считывали среднее значение МИК ± среднеквадра тичное отклонение. Метод серийных разведений препаратов в жидкой питательной среде. Использовали стандартную ме тодику, применяемую в микробиологии для тести рования антибиотиков, но с небольшими модифика циями, разработанными с учетом специфики АМП [17] согласно [12]. За МИК принимали наименьшую концентрацию пептида, при которой полностью инги бировался видимый рост микроорганизмов в лунках 96-луночных планшетов. В каждом опыте использо вали по три параллельных пробы. Результаты пред ставлены как медианы, полученные по трем-пяти независимым экспериментам. Оценка влияния пептидов на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран E. coli ML35p для хромогенных маркеров Действие пептидов на барьерную функцию мембран грамотрицательной бактерии изучали с использова нием метода [18] в модификации [19]. Штамм E. coli ML35p характеризуется отсутствием пермеазы лак тозы, конститутивным синтезом β-галактозидазы в цитоплазме, а также содержит β-лактамазу в пе риплазматическом пространстве. О состоянии на ружной и цитоплазматической мембран клеток E. coli ML35p судили по их проницаемости для хромоген ных маркеров - нитроцефина и о-нитрофенил-β-D галактопиранозида (ONPG), субстратов β-лактамазы и β-галактозидазы соответственно. Пробы вносили в лунки 96-луночного планшета согласно [12] и из меряли оптическую плотность (OD) раствора, об условленную появлением продукта гидролиза нитроцефина или ONPG при λ = 486 и 420 нм соответ ственно с помощью спектрофотометра SpectraMax 250 (Molecular Devices, США) при 37°С и периодиче ском встряхивании планшетов в течение 2 ч. Данные обрабатывали в программе Sigma Plot 11. Оценка липополисахаридсвязывающей активности пептидов Липополисахаридсвязывающую (липополисахарид нейтрализующую) активность пептидов изучали с помощью количественного хромогенного Лимулюс теста (Quantitative Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate; Lonza Walkersvile, США). При проведе нии экспериментов и обработке результатов ис пользовали подходы, описанные Zhao и соавт. [20]. Приготавливали серийные двукратные разведения пептидов в воде с 0.01% уксусной кислоты и инку бировали АМП с липополисахаридом (ЛПС) E. coli O111:B4 в конечной концентрации 0.5 Ед/мл в те чение 30 мин при 37оС в планшетах Costar 3596 (Corning, США). Проводили количественное опре деление свободного ЛПС в соответствии с рекомен дациями производителя набора. Планшет помеща ли в термостатируемую камеру спектрофотометра SpectraMax 250 (Molecular Devices, США), инкуби ровали при 37оС, измеряя OD раствора при 405 нм; вычисляли разницу величин OD в начале инкубации и через 10 мин - ΔOD405. Долю связанного ЛПС (%) определяли по формуле: % связанного ЛПС = α(ЛПС без пептида) - - α(ЛПС с пептидом) / α(ЛПС без пептида), где α = ΔOD405(пептид (или вода) с ЛПС) - ΔOD405(пептид (или вода) без ЛПС). Строили кривые зависимости доли связанного ЛПС от концентрации АМП в инкубационной среде (программа Sigma Plot 11, Systat Software Inc., США) и определяли ЭК50 (эффективная концентрация 50% или концентрация пептидов, при которой 50% ЛПС находится в связан ном состоянии). Анализ гемолитической активности пептидов Эритроциты получали из крови здоровых доно ров по стандартной методике. Из осадка эритро цитов (считали, что осадок содержит 100% суспен зию клеток) получали 2.8% суспензию эритроцитов в забуференном физиологическом растворе (ЗФР). В анализируемые пробы вносили 27 мкл суспензии эритроцитов и 3 мкл исследуемого пептида (в разных концентрациях) в ЗФР или 3 мкл ЗФР (контроль). Пробы (по три повторности) инкубировали при 37°С в течение 30 мин, добавляли по 75 мкл охлажденного ЗФР и центрифугировали при 5000 g в течение 4 мин. Оптическую плотность супернатантов измеряли при λ = 540 нм. Оценка влияния пептидов на жизнеспособность культивируемых клеток Жизнеспособность культивируемых клеток человека после их 20-часовой инкубации с пептидами оцени вали с помощью стандартного МТТ-теста [21] соглас но [12]. Культивирование клеток, выделение нейтро филов и мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров проводили по стандартным методикам. Масс-спектрометрия Молекулярные массы выделенных пептидов опреде ляли на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Reflect III (Bruker, Германия), оснащенном УФ лазером с длиной волны 336 нм. В качестве матри цы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (Sigma, Германия) в 20% ацетонитриле, 0.1% ТФУ в концентрации 10 мг/мл. Указаны средние молеку лярные массы. Определение аминокислотной последовательности Аминокислотную последовательность определя ли, используя систему для секвенирования бел ков Procise cLC 491 (Applied Biosystems, США). Фенилтиогидантоиновые производные аминокис лотных остатков идентифицировали на анализаторе 120A PTH (Applied Biosystems, США). Синтез мини-бактенецинов Mini-ChBac7.5Nα и mini-ChBac7.5Nβ синтезиро вали с помощью твердофазного синтеза и Fmoc/ tBu-стратегии на пептидном синтезаторе Syro2000 (MultiSynTech GmbH, Германия) [22]. После за вершения синтеза пептиды снимали смесью 5% воды, 4% м-крезола, 5% тиоанизола и 2% этандити ола в ТФУ при комнатной температуре в течение 4 ч и осаждали охлажденным диэтиловым эфиром. Синтезированные пептиды очищали с использо ванием ВЭЖХ Äkta (Amersham Bioscience GmbH, Германия) на колонке Jupiter C18 (20 мм × 250 мм, Phenomenex Inc., США) в линейном градиенте ацето нитрила с 0.1% ТФУ. Молекулярные массы пептидов подтверждали с помощью MALDI-TOF-MS, чисто ту - ОФ ВЭЖХ. Статистическая обработка результатов Статистическую значимость различий между опытными и контрольными группами при опреде лении цитотоксической активности АМП для кле ток человека оценивали с применением t-критерия Стьюдента (p < 0.05), n = 6 в программе Prism 5 (GraphPad Software Inc., США). РЕЗУЛЬТАТЫ Выделение и очистка новых антимикробных пептидов из лейкоцитов козы При выделении пептидов обеспечивали условия, при которых возможен процессинг предшественни ков кателицидинов с высвобождением зрелых АМП. Для разделения катионных пептидов, полученных козы через мембрану YM-10, использовали препа ративный электрофорез. Фракции анализировали, измеряя оптическую плотность растворов при длине волны 280 нм, а также оценивая антимикробную ак тивность методом радиальной диффузии (рис. 1А). Фракции 17-24 содержали компоненты с наиболь шей электрофоретической подвижностью по направ лению к катоду - пептиды с молекулярными массами от 2.8 до 6 кДа, обладающие антимикробной активно стью (пик 1), в пиках 2 и 3 - бактенецины ChBac3.4 и ChBac5 (рис. 1А). Для получения индивидуальных пептидов, выхо дящих во фракциях, соответствующих пику 1, при меняли последовательные циклы ОФ ВЭЖХ с ис пользованием различных противоионов. На рис. 1Б представлены результаты, полученные при про ведении первого этапа хроматографического раз деления пептидов, содержащихся в объединенных фракциях 19-24. Антимикробная активность выяв лена во фракциях, отмеченных стрелкой (24-26-я минута) и содержащих два пептида со средними мо лекулярными массами 2895.5 и 2739.3 Да. Для раз деления пептидов проводили рехроматографию с применением в качестве противоиона гептаф тормасляной кислоты (рис. 1В). Получили инди видуальные пептиды (названные нами мини-бак тенецинами), выходящие с колонки во фракциях, соответствующих пикам, отмеченным стрелками на хроматограмме, - пептид со средней молекуляр ной массой 2895.5 Да - mini-ChBac7.5Nα и 2739.3 Да - mini-ChBac7.5Nβ. Анализ первичной структуры выделенных АМП показал, что оба пептида представляют со бой N-концевые фрагменты бактенецина 7.5 козы, информация о структуре которого, полученная пу тем клонирования гена, представлена в базе данных (Q9XSQ9, (Q9XSQ9_CAPHI) UniProtKB/TrEMBL) [23], но соответствующий белковый продукт не был выделен ранее из лейкоцитов (рис. 2). Описано вы деление фрагмента бактенецина 7.5 овцы (пептида, структурно сходного с бактенецином 7.5 козы), одна ко эта молекула представляла собой С-концевой уча сток бактенецина 7.5 [2]. Учитывая, что этот пептид был назван OaBac7.5mini, мы по аналогии назвали наши пептиды mini-ChBac7.5Nα и -β, добавив букву N, указывающую на то, что это N-концевые фраг менты (Ch - аббревиатура C. hircus, домашняя коза). Процедуру выделения и очистки повторя ли в нескольких сериях экспериментов, по лучая при этом одни и те же фракции ми ни-бактенецинов. Приведенные выше данные получены при использовании материала, в котором белки экстрагировали с помощью 10% уксусной кис лоты. Мини-бактенецины выявлены также при экс тракции белков детергентом - бромистым цетилтри метиламмонием. Ингибиторы протеаз не применяли, так как в этом случае не удается получить зрелые формы АМП семейства кателицидинов. Таким образом, из лейкоцитов козы впервые вы делены пептиды - N-концевые фрагменты бактене цина 7.5. Полноразмерный бактенецин 7.5 выявить не удалось, вероятно, бόльшая его часть подверглась протеолитическому расщеплению. Антимикробная активность мини-бактенецинов Антимикробную активность мини-бактенецинов, по лученных с помощью химического синтеза, анализи ровали с применением двух методов - радиальной диффузии в агарозном геле (РД) и метода серийных разведений в жидкой питательной среде (таблица). При оценке активности бактенецинов методом РД пептиды инкубировали с микроорганизмами в раз ных условиях: в среде с низкой ионной силой (0.01 М натрий-фосфатный буфер рН 7.4 без добавления со лей) и в той же среде, но с добавлением 100 мМ хло рида натрия. Установлено, что известные к настоящему вре мени пролин-богатые АМП (ПБ-АМП) обладают высокой антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий и сниженной в отно шении большинства грамположительных, особенно стафилококков [24]. Нами показано, что в среде с низ кой ионной силой мини-бактенецины проявляют ши рокий спектр антимикробного действия и высокую активность в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, включая ста филококков, а также C. albicans (таблица). Однако при повышении ионной силы среды активность АМП снижается в отношении как стафилококков, так и С. albicans. В случае грамотрицательных бактерий за висимость активности мини-бактенецинов от ионной силы среды менее выражена. При изучении антимикробной активности пепти дов методом серийных разведений в жидкой пита тельной среде (таблица) показана высокая анти микробная активность мини-бактенецинов против грамотрицательных бактерий, включая штаммы, устойчивые к ряду применяемых в клинике анти биотиков: P. aeruginosa (устойчивость к азтреонаму, цефтазидиму, цефотаксиму), Klebsiella spp. (устой чивость к тетрациклину), A. baumannii (устойчи вость к меропенему) - МИК 2-4 мкМ. Пептиды проявляют выраженную активность в отношении грамположительных бактерий Listeria monocytogenes и Micrococcus luteus, однако их антибакте риальное действие в отношении стафилококков, а также представителей рода Candida практиче ски не выявляется в диапазоне концентраций от 1 до 64 мкМ. Влияние АМП на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран E. coli ML35p для хромогенных маркеров Одна из важнейших задач изучения функциональ ных свойств АМП - обнаружение основной мишени их антимикробного действия. У большинства АМП это бактериальные мембраны - пептиды вызывают их быструю и необратимую дезинтеграцию. Однако некоторые АМП, в том числе ПБ-АМП, преимуще ственно нарушают внутриклеточные процессы в бак териальных клетках и повреждают их мембраны лишь в концентрациях, значительно превышающих МИК [25]. Нами изучено влияние мини-бактенецинов на проницаемость наружной и цитоплазматической мембраны E. coli ML35p. На рис. 3 представлена ки нетика действия mini-ChBac7.5Nα в концентрации 0.6-20 мкМ на мембраны E. coli ML35p. В качестве пептида сравнения использовали бактенецин козы ChBac3.4 (5 мкМ, что в 2 раза выше МИК), а поло жительным контролем служил мембраноактивный пептид протегрин 1 (PG-1) свиньи. Проницаемость наружной мембраны бактерии для хромогенного маркера повышается при действии мини-бактене цина практически во всем исследуемом диапазоне концентраций, хотя в случае PG-1 (2.5 мкМ, что в 2 раза выше МИК) эффект более выражен. Однако пептид лейкоцитов козы не оказывает существен ного воздействия на проницаемость цитоплазмати ческой мембраны E. coli для маркерной молекулы. Лишь при высоких концентрациях пептида (10 и 20 мкМ), значительно превышающих МИК (1-2 мкМ), данные несколько отличаются от значений в контро ле, где отсутствовали АМП. Эффект ChBac3.4, в от личие от мини-бактенецина, проявляется уже в кон центрации, в 2 раза превышающей МИК. Для второго мини-бактенецина и mini-ChBac7.5Nα результаты практически не отличались (данные не приведены). Полученные данные позволяют заключить, что бак териальные мембраны не являются основной ми шенью изучаемых нами мини-бактенецинов, как и других известных ПБ-АМП. Вероятно, подобно фрагментам Bac7 быка и OaBac7.5 овцы они могут связываться с шапероном DnaK и модулировать его ATP-азную активность, нарушая процесс белкового фолдинга в клетке [25, 26], или взаимодействовать с 70S рибосомами, нарушая процесс трансляции, как показано для апидецинов, онкоцинов, фрагмен та 1-35 Вас7 быка [27, 28]. Как и фрагменты 1-35 Вас7 быка, которые воздействовали на цитоплазма тическую мембрану E. coli ML35p в концентрациях, в несколько раз превышающих МИК [24], мини-бак тенецины влияют на проницаемость внутренней мем браны этой бактерии лишь в концентрациях, в 10-20 раз превышающих МИК. Липополисахаридсвязывающая активность мини бактенецинов козы Связывание с липополисахаридом (ЛПС) - ком понентом наружной мембраны грамотрицатель ных бактерий - одно из важных свойств АМП, так как от характера этого связывания во многом за висит и последующая эффективность антимикроб ного действия пептидов. При разработке лекарствен ных препаратов на основе АМП большое внимание наряду с антимикробными свойствами уделяют и ЛПС-связывающей (нейтрализующей) активно сти, учитывая важность получения соединения, ко торое может способствовать не только инактивации патогенных микроорганизмов, но и предотвращать или устранять последствия септического шока, вы зываемого грамотрицательными бактериями, - се рьезного осложнения инфекционных заболеваний, часто приводящего к смертельному исходу. В послед нее время опубликовано большое количество работ, в которых комплексно анализируется зависимость особенностей структуры пептидов - прототипов лекарственных средств от их антимикробного дей ствия, селективности по отношению к прокариоти ческим клеткам и ЛПС-нейтрализующим свойствам. Показано, что ЛПС-нейтрализующая активность пептида зависит от соотношения гидрофобности/ величины суммарного положительного заряда его молекулы [29]. Путем определения эффективной концентрации, при которой 50% ЛПС (ЛПС E. coli O111:B4) находится в связанном с пептидом состо янии [20], нами оценена ЛПС-связывающая актив ность мини-бактенецинов. Для сравнения приведены данные, полученные для других АМП лейкоцитов козы - бактенецинов ChBac3.4, ChBac5 и пептида с низкой антимикробной активностью - химически синтезированного С-концевого участка (аминокис лотные остатки 20-43) бактенецина ChBac5 (ChBac5 20-43). Положительным контролем служил полимик син В, известный как соединение, обладающее высо кой аффинностью к ЛПС (рис. 4). Мини-бактенецины характеризуются значительно более высокими по казателями рассматриваемого вида активности по сравнению с ChBac5 20-43, хотя и несколько уступают бактенецинам ChBaс3.4 и ChBac5, что мо жет объясняться бόльшим суммарным положитель ным зарядом молекул мини-бактенецинов и мень шей их гидрофобностью по сравнению с ChBaс3.4 и ChBac5 (рис. 4). Mini-ChBac7.5Nα содержит 12 остатков аргинина и лишь два остатка лейцина (mini- ChBac7.5Nβ - 11 остатков аргинина и два лейцина). Кроме того, мини-бактенецины не содержат остатков ароматических аминокислот, присутствие которых (в особенности остатка триптофана), как полагают, обу словливает повышенную ЛПС-нейтрализующую ак тивность [30]. ChBac3.4 и ChBac5, напротив, содержат относительно большое количество остатков аромати ческих аминокислот, главным образом, фенилалани на. Полученные данные предоставляют информацию для анализа закономерностей проявления различ ных видов биологической активности АМП, а также указывают на возможность разработки антибиотиче ских препаратов на основе мини-бактенецинов путем создания их аналогов, содержащих большее количе ство остатков гидрофобных аминокислот, в частности триптофана. Действие мини-бактенецинов на клетки млекопитающих Как известно, большинство ПБ-АМП не обладает вы раженной токсичностью для клеток млекопитающих [25]. Оценка гемолитической активности мини-бак тенецинов в отношении эритроцитов человека по казала, что в концентрации 1-100 мкМ оба пептида не оказывают выраженного действия на эритроциты. Показатели проб, содержащих пептиды в этих кон центрациях, не отличались статистически значимо от показателей в контрольных пробах, не содержа щих АМП (p > 0.05, t-критерий Стьюдента, n = 9). С применением МТТ-теста определено действие мини-бактенецинов в концентрации 1-30 мкМ на клетки человека. Установлено, что пептиды об ладают низкой цитотоксической активностью в отно шении различных типов культивируемых клеток че ловека, а именно, клеток эритромиелоидного лейкоза К-562, гистиоцитарной лимфомы U-937, промиело цитарного лейкоза HL-60, эпителиоидной карцино мы легкого А-549, эпидермоидной карциномы А-431, остеосаркомы человека MG-63, а также нормальных фибробластов кожи человека, фибробластов легко го эмбриона человека MRC-5, нейтрофилов и моно нуклеарных клеток периферической крови челове ка. Показатели цитотоксичности, полученные после 24 ч инкубации с пептидами, не отличались значимо от величин, рассчитанных для контрольных проб, не содержащих пептиды, во всем диапазоне концен траций - 1-30 мкМ (p > 0.05, t-критерий Стьюдента, n = 9). Эти данные свидетельствуют об избиратель ности действия мини-бактенецинов козы в отноше нии микробных клеток, что согласуется с наблюде ниями, в которых установлена низкая токсичность N-концевых фрагментов 1-16, 1-23, 1-35 Вас7 быка для клеток млекопитающих [24]. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Из лейкоцитов домашней козы C. hircus нами вы делены два антимикробных пептида, названных мини-бактенецинами mini-ChBac7.5Nα и mini- ChBac7.5Nβ, которые являются N-концевыми фраг ментами пептида ChBac7.5, впервые полученными из клеток крови. Из лейкоцитов овцы ранее были выделены несколько фрагментов бактенецинов - OaBac11, OaBac5, OaBac7.5 [2]. С-Концевой фраг мент (32-60), выделенный Андерсон и соавт. [2] и на званный OaBac7.5mini, имел относительно низкую антимикробную активность [31] по сравнению с ак тивностью N-концевых фрагментов бактенецина 7.5 козы. Мини-бактенецины козы имеют структурное сходство и с N-концевой частью Bac7 быка [5] (рис. 2). Для проявления антимикробной активности Вас7 быка необходим именно N-концевой участок моле кулы (не менее 16 аминокислотных остатков) [24], по длине примерно соответствующий выделенным нами пептидам. С-Концевые фрагменты Вас7 быка имели низкую антимикробную активность [24]. В мо лекулах бактенецинов 7.5 козы и овцы, а также бак тенецина 7 быка N-концевые участки имеют высокое структурное сходство, в то время как С-концевые области значительно различаются. Обнаружение фрагментов бактенецинов 7.5 овцы [2] и мини-бакте нецинов козы позволяет предположить, что именно после фрагментации образовавшиеся пептиды и вы полняют основные защитные функции: N-концевые производные - антимикробную, а С-концевые, воз можно, играют другую роль, которая еще до конца не выяснена. Предположение о важности фрагментации зре лых форм АМП, в том числе и для регуляции их биологических эффектов в ходе развития инфекци онного процесса, было выдвинуто при изучении про теолитического расщепления кателицидина LL-37 человека. В результате расщепления этого пептида образуются фрагменты, часть из которых облада ет более выраженной антимикробной активностью, чем полноразмерный LL-37 [1, 32]. Однако установ лено, что при высокой антимикробной активности иммуномодулирующая активность этих пептидов снижена по сравнению с полноразмерным кателици дином [32]. Характер фрагментации кателицидина зависит от многих факторов, но в наибольшей сте пени - от активности протеаз, осуществляющих его процессинг, и от активности их ингибиторов [1]. Эти факторы, в свою очередь, зависят от параметров, определяемых микроокружением, которое может изменяться в ходе инфекционного или других пато логических процессов. Поэтому фрагментация кате лицидина человека может рассматриваться как один из механизмов тонкой и многогранной регуляции функциональной активности АМП. С другой сторо ны, на основании изучения биологической актив ности фрагментов этого пептида разрабатываются разнообразные антибактериальные, а также и проти воопухолевые пептидные препараты - производные LL-37, которые рассматриваются как перспективные прототипы новых лекарственных средств. Фрагментации подвергаются и другие антими кробные полипептиды, при расщеплении которых образуются их укороченные варианты с выражен ной бактерицидной активностью. Например, при про цессинге лактоферрина, компонента специфических гранул нейтрофилов, образуется антимикробный пептид лактоферрицин, который рассматривается как соединение, играющее самостоятельную биоло гическую роль в осуществлении защитных функций нейтрофилов [33]. Из лейкоцитов и кожных покро вов ряда рыб и амфибий получены фрагменты ги стонов, обладающие антимикробной активностью и, как предполагается, выполняющие защитные функ ции [34, 35]. Представляют интерес ферменты, которые мо гут осуществлять подобный процессинг ПБ-АМП, в частности бактенецина 7.5 козы. Можно предпо ложить, что в этом процессе принимают участие несколько различных протеаз, а расщепление, воз можно, включает несколько стадий. В случае mini- ChBac7.5Nβ одним из таких ферментов может быть пролилэндопептидаза (PREP [КФ 3.4.21.26]) или про лилкарбоксипептидаза (PRCP [КФ 3.4.16.2]), рас щепляющие пептидную связь между остатками пролина и аргинина (в молекуле ChBac7.5 - между остатками пролина 21 и аргинина 22). Эти протеазы присутствуют в нейтрофильных гранулоцитах и, как показано, играют немаловажную роль в реакци ях воспалительного процесса [36]. Дальнейшее иссле дование с использованием ингибиторов протеаз раз личного типа позволит пролить свет на этот вопрос. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Получение из лейкоцитов домашней козы высоко активных антимикробных пептидов, названных нами мини-бактенецинами mini-ChBac7.5Nα и miniChBac7.5Nβ и представляющих собой N-концевые фрагменты бактенецина 7.5, свидетельствует в поль зу представления о важности фрагментации антими кробных пептидов врожденного иммунитета - одного из факторов, необходимых для реализации и регуля ции защитных реакций при развитии инфекционного или воспалительного процессов. Показано, что мини бактенецины проявляют высокую антимикробную активность в отношении грамотрицательных бакте рий, включая антибиотикоустойчивые штаммы, об ладают липополисахаридсвязывающей активностью, не проявляют токсичности по отношению к культи вируемым клеткам человека. Все это свидетельству ет о перспективности дальнейшего исследования антимикробной активности этих соединений на боль шем числе микроорганизмов и изучения возможно сти разработки на их основе новых антибактериаль ных терапевтических препаратов.
Об авторах
O. В. Шамова
Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет
Автор, ответственный за переписку.
Email: ovch@ibch.ru
Россия
Д. С. Орлов
Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет
Email: ovch@ibch.ru
Россия
M. С. Жаркова
Институт экспериментальной медицины
Email: ovch@ibch.ru
Россия
С. В. Баландин
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Email: ovch@ibch.ru
Россия
E. В. Ямщикова
Институт экспериментальной медицины
Email: ovch@ibch.ru
Россия
Д. Кнаппе
Лейпцигский университет
Email: ovch@ibch.ru
Германия
Р. Хоффманн
Лейпцигский университет
Email: ovch@ibch.ru
Россия
В. Н. Кокряков
Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет
Email: ovch@ibch.ru
Россия
T. В. Овчинникова
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Email: ovch@ibch.ru
Россия
Список литературы
- Yamasaki K., Schauber J., Coda A., Lin H., Dorschner R., Schechter N., Bonnart C., Descargues P., Hovnanian A., Gallo R.L. // FASEB J. 2006, V.20, №12, P.2068-2080
- Anderson R., Yu P.L. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, V.312, P.1139-1146
- Kokryakov V.N., Harwig S.S., Panyutich E.A., Shevchenko A.A., Aleshina G.M., Shamova O.V., Korneva H.A., Lehrer R.I. // FEBS Lett. 1993, V.327, P.231-236
- Agerbert B., Lee J.Y., Bergman T., Carlquist M., Boman H.G., Mutt V., Jörnvall H. // Eur. J. Biochem. 1991, V.202, P.849-854
- Gennaro R., Skerlavaj B., Romeo D. // Infect. Immun. 1989, V.57, P.3142-3146
- Skerlavaj B., Gennaro R., Bagella L., Merluzzi L., Risso A., Zanetti M. // J. Biol. Chem. 1996, V.271, P.28375-28381
- Romeo D., Skerlavaj B., Bolognesi M., Gennaro R. // J. Biol. Chem. 1988, V.263, P.9573-9575
- Selsted M., Novotny M., Morris W., Tang Y., Smith W., Cullor J. // J. Biol. Chem. 1992, V.267, №7, P.4292-4295
- Huttner K.M., Lambeth M., Burkin H., Burkin D., Broad T. // Gene. 1998, V.206, P.85-91
- Zhao C., Nguen T., Liu L., Shamova O., Brogden K.A., Lehrer R.I. // Infect. Immun. 1999, V.67, №11, P.6221-6224
- Shamova O., Brogden K.A., Zhao C., Nguen T., Turner J., Kokryakov V., Lehrer R.I. // Infect. Immun. 1999, V.67, №8, P.4106-4111
- Shamova O., Orlov D., Stegemann C., Czihal P., Hoffmann R., Brogden K., Kolodkin N., Sakuta G., Tossi A., Sahl H.G., Kokryakov V., Lehrer R.I. // Int. J. Pept. Res. Therap. 2009, V.15, №1, P.31-42
- Harwig S.S., Chen N.P., Park A.S.K., Lehrer R.I. // Anal. Biochem. 1993, V.208, P.382-386
- Schagger H., von Jagow G. // Anal. Biochem. 1987, V.166, P.368-379
- Wolf P. // Anal. Biochem. 1983, V.129, Pt1, P.145-155
- Lehrer R.I., Rosenman M., Harwig S.S., Jackson R., Eisenhauer P. // J. Immunol. Meth. 1991, V.137, №2, P.167-173
- Tossi A., Scocchi M., Zanetti M., Genaro R., Storici P., Romeo D. // In Antibacterial peptide protocols / Ed. Shafer W. Totowa, N.J.: Humana Press Inc., 1998. 1998, P.133-151
- Lehrer R.I., Barton A., Ganz T. // J. Immunol. Meth. 1988, V.108, P.153-158
- Artamonov A.Yu., Shamova O.V., Kokryakov V.N., Orlov D.S. // Vesnik Sankt-Peterburgskogo unuversiteta. Ser. 3. Biology. [in Russian] 2008, №2, P.139-142
- Zhao C., Nguyen T., Boo L., Hong T., Espiritu C., Orlov D., Wang W., Waring A., Lehrer R.I. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001, V.45, №10, P.2695-2702
- Mosmann T. // J. Immunol. Meth. 1983, V.65, P.55-63
- Singer D., Lehmann J., Hanisch K., Härtig W., Hoffmann R. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, V.346, P.819-828
- Zhao C., Nguyen T., Brogden K., Lehrer R. // EMBL/ GenBank/DDBJ databases. 1999
- Gennaro R., Zanetti M., Benincasa M., Podda E., Miani M. // Curr. Pharmaceut. Design. 2002, V.8, P.763-778
- Scocchi M., Tossi A., Gennaro R. // Cell. Mol. Life Sci. 2011, V.68, P.2317-2330
- Zahn M., Kieslich B., Berthold N., Knappe D., Hoffmann R., Strater N. // Protein Pept Lett. 2014, V.21, №4, P.407-412
- Krizsan A., Volke D., Weinert S., Sträter N., Knappe D., Hoffmann R. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2014, V.53, №45, P.12236-12239
- Mardirossian M., Grzela R., Giglione C., Meinnel T., Gennaro R., Mergaert P., Scocchi M. // Chem. Biol. 2014, V.21, №12, P.1639-1647
- Rosenfeld Y., Lev N., Shai Y. // Biochemistry. 2010, V.49, P.853-861
- Nan Y., Bang J., Jacob B., Park I., Shin S. // Peptides. 2012, V.35, №2, P.239-247
- Anderson R.C., Hancock R.E.W., Yu P. // Antimicrob. Agents Chemother. 2004, V.48, №2, P.673-676
- Braff M., Hawkins M., Di Nardo A., Lopez-Garcia B., Howell M., Wong C., Lin K., Streib J., Dorschner R., Leung D. // J. Immunol. 2005, V.174, P.4271-4278
- Gifford J., Hunter H., Vogel H. // Cell Mol. Life Sci. 2005, V.62, №22, P.2588-2598
- Park I.Y., Park C.B., Kim M.S., Kim S.C. // FEBS Lett. 1998, V.437, P.258-262
- Shamova O.V., Orlov D.S., Balandin S.V., Shramova E.I., Tsvetkova E.V., Panteleev P.V., Leonova Yu.F., Tagaev A.A., Kokryakov V.N., Ovchinnikova T.V. // Acta Naturae. 2014, V.6, №4(23), P.99-109
- Waumans Y., Baerts L., Kehoe K., Lambeir A., De Meester I. // Front. Immunol. 2015. V. 7. № 6. 387. 2015, V.7, №6.387, doi: 10.3389/fimmu.2015.00387