Анализ доменов белков капсида и NS5A вируса гепатита С, активирующих каскад Nrf2/ARE

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Инфицирование вирусом гепатита С (ВГС) вызывает хроническое заболевание печени, которое сопровождается развитием различных патологий и метаболических нарушений. Одним из механизмов па- тогенеза ВГС считается возникновение в инфицированных клетках окислительного стресса, вызываемого белками вирусного капсида и NS5A. Оба белка активируют систему защиты клетки от окислительного стресса, регулируемую фактором транскрипции Nrf2. В настоящей работе установлено, что данная активация опосредована доменом 1 белка NS5A и двумя фрагментами белка капсида. Показано, что активация фактора Nrf2 каждым белком осуществляется с использованием двух механизмов, один из которых опосредован активными формами кислорода (АФК) и протеинкиназой С, а второй - АФК-независимой активацией казеинкиназы 2 и фосфоинозитид-3-киназы. АФК-зависимый механизм стимулировался фрагментом 37-191 а.о. белка капсида, а АФК-независимый - фрагментом 1-36 а.о., что впервые показало независимость двух механизмов активации фактора Nrf2. Кроме того, сделан вывод о том, что внутриклеточная локализация белков ВГС и различия в их биологических свойствах не играют роли в регуляции системы защиты клетки от окислительного стресса.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Вирус гепатита С (ВГС) вызывает широко распро страненное и опасное заболевание печени человека. В большинстве случаев заражение ВГС приводит к хроническому гепатиту, при котором велик риск развития фиброза и цирроза печени, а также гепа тоцеллюлярной карциномы и различных метаболи ческих нарушений (стеатоз, сахарный диабет типа 2, нарушения метаболизма железа и другие патологии) [1]. Многочисленные фундаментальные и клиниче ские исследования выявили ряд патогенетических механизмов ВГС, среди которых важную роль играет окислительный стресс (ОС) [2]. ОС представляет со бой состояние клетки, при котором нарушается ба ланс между активными формами кислорода (АФК) и нейтрализующими их низкомолекулярными соеди нениями (антиоксидантами) и ферментами, вовле ченными в защиту от ОС (так называемые ферменты фазы II). Биосинтез многих ферментов метаболизма антиоксидантов и ферментов фазы II контролиру ется фактором транскрипции Nrf2 (nuclear factor erythroid-2 - related factor 2), который связывается с общим регуляторным элементом ARE (Antioxidant Response Element) в промоторах генов [3]. В отсут ствие стресса фактор Nrf2 находится в цитоплазме в комплексе с белком-партнером Keap1. При повы шении уровня АФК комплекс разрушается либо вследствие фосфорилирования фактора Nrf2 раз личными протеинкиназами, либо в результате мо дификации Keap1, после чего свободный фактор транскрипции перемещается в ядро и активирует транскрипцию генов ферментов метаболизма анти оксидантов и ферментов фазы II, в частности, гемок сигеназы 1 (HO-1) и NADPH:хиноноксидоредуктазы 1 (Nqo1) [3, 4]. Вирус гепатита С не только вызывает ОС, но и ак тивирует фактор Nrf2 [2]. Ключевую роль в обо их случаях играют вирусные белки - капсидный и NS5A [4-7]. Ранее мы установили, что эти бел ки активируют систему защиты при помощи двух механизмов, один из которых опосредован АФК и протеинкиназой С, а другой заключается в АФК независимой активации фактора Nrf2 казеинкиназой 2 и фосфоинозитид-3-киназой [4]. Однако нельзя ис ключать, что оба пути активации Nrf2 индуцируют ся неким общим регулятором, расположенным выше в каскаде, все участники которого до сих пор не из вестны. Задача настоящей работы состояла в том, чтобы выявить наличие (или отсутствие) такой регу ляции и определить структурные элементы белков капсида и NS5A, принимающие участие в механиз мах активации Nrf2/ARE-каскада. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Линия клеток гепатомы человека Huh7.5 любезно предоставлена C. Rice (Рокфеллеровский универ ситет, США). Плазмида pCMV-core, кодирующая полноразмерный белок капсида ВГС генотип 1b (274933RU), описана ранее [4]. Плазмиды, кодиру ющие фрагменты 1-36, 37-191 и 1-151 а.о. белка капсида, сконструированы на основе вектора pVax1 [8], а плазмиды, кодирующие полноразмерный бе лок NS5A ВГС генотип 1b (AJ238799) и его индиви дуальные домены D1 (1-249 а.о.), D2 (250-355 а.о.) и D3 (356-447 а.о.), созданы на основе вектора pCMVTag3B [7]. В качестве ингибиторов протеинкиназ использо вали Ro 31-8220, вортманнин и 5,6-дихлор-1-β-D рибофуранозилбензимидазол (DRB) (Sigma). Культуральные работы Клетки Huh7.5 культивировали в среде DMEM, со держащей 10% фетальную сыворотку крупного рогатого скота (HyClone, США), 2 мМ глутамина, 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, при 37°С во влажной атмосфере 5% CO2. Работа с репортерной плазмидой Клетки Huh7.5 высевали на 24-луночные планше ты, трансфицировали смесью репортерной плазмиды pP-ARE (0.25 мкг) [4] и целевой экспрессионной плаз миды (0.25 мкг) с использованием реагента Turbofect. Через 30 ч лизировали клетки и измеряли актив ность люциферазы как описано ранее [4]. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени Клетки Huh7.5 трансфицировали описанным выше методом, через 40 ч отбирали культуральную сре ду, выделяли суммарную РНК, проводили обратную транскрипцию и ПЦР в реальном времени согласно [4]. Вестерн-блотинг Клетки Huh7.5 трансфицировали на 6-луноч ных планшетах, лизировали через 40 ч после трансфекции, дальнейшие манипуляции про водили как описано ранее [4], используя моно клональные антитела мыши к гемоксигена зе 1 (ab13248), NADPH:хиноноксидоредуктазе 1 (ab28947) и β-актину (ab3280) фирмы Abcam (Великобритания), а также вторичные антитела к IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хре на (sc-2005) компании Santa-Cruz (США). Для ана лиза внутриклеточной локализации фактора Nrf2 клетки лизировали, фракции цитоплазматических и ядерных белков разделяли с использованием ком мерческого набора NE-PER (Thermo Scientific). Nrf2 детектировали в каждой фракции методом иммуно блотинга, используя поликлональные антитела кро лика к Nrf2 (sc-722) и вторичные антитела к IgG кро лика (sc-2004) фирмы Santa-Cruz. Статистическая обработка данных Данные обрабатывали, используя программу StatPlus (AnalystSoft, Канада). Результаты представ лены как среднее значение ± стандартное отклоне ние. Статистическую значимость различий вычисля ли, используя парный критерий Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Участие фрагментов белков капсида и NS5A в ак тивации каскада Nrf2/ARE анализировали тре мя методами: оценивали относительные уровни экспрессии двух ферментов фазы II (Nqo1, HO-1) и определяли внутриклеточную локализацию фак тора Nrf2. Показано, что из всех описанных доменов белка NS5A только домен 1 (остатки 1-249 а.о.) об ладает способностью активировать фактор Nrf2, т.е. вызывать его транслокацию из цитоплазмы в ядро (рис. 1А) и усиливать экспрессию Nrf2-зависимых генов (рис. 1Б,В). Примечательно, что из трех доме нов белка NS5A лишь домен 1 обладает определен ной трехмерной структурой [9], в то время как доме ны 2 и 3 неструктурированные [10, 11]. Наши данные также свидетельствуют о том, что именно домен 1 об ладает прооксидантной активностью [7]. Кроме того, показано, что способность белка NS5A активировать каскад Nrf2/ARE не связана ни с его посттрансляци онной модификацией - фосфорилированием доменов 2 и 3 [12], ни со способностью нарушать экспрессию интерферона β в ответ на ВГС-инфекцию [1]. Для изучения вклада различных фрагментов белка капсида (1-191 а.о.) в активацию каскада Nrf2/ARE использовали его укороченные фрагменты 1-36 и 37-191 а.о., каждый из которых проявил спо собность вызывать окислительный стресс с помощью различных механизмов [8]. Кроме того, использовали фрагмент 1-151 а.о., который активировал все АФК продуцирующие ферменты, как и полноразмерный белок капсида, но локализовался не на эндоплазма тическом ретикулуме, а в ядре, как и форма 1-36. Установлено, что все укороченные формы белка капсида активировали фактор Nrf2 (рис. 2А) и экс прессию Nrf2-зависимых генов (рис. 2Б,В). Таким об разом, в структуре белка капсида есть как минимум два участка, обладающих способностью активиро вать каскад Nrf2/ARE. Известно, что активация каскада Nrf2/ARE может происходить при участии разнообразных протеин киназ, включая протеинкиназу С, казеинкиназу 2, фосфоинозитид-3-киназу, р38, митоген-активиру емые протеинкиназы ERK1/2 и JNK и киназу гли когенсинтазы 3 (GSK3), причем вклад каждой кина зы зависит от стимула и типа клеток ([3, 4] и ссылки в них). В случае каждого фрагмента белка для уста новления механизма активации использовали анти оксидант пирролидиндитиокарбамат (PDTC), а так же ингибиторы протеинкиназы С (Ro 31-8220, Ro), казеинкиназы 2 (DRB) и фосфоинозитид-3-киназы (вортманнин, Wo), т.е. тех ферментов, которые, по нашим данным, участвуют в активации Nrf2 полноразмерным белком NS5A. Используя репор терную плазмиду pP-ARE, кодирующую люцифе разу под контролем минимального ARE-элемента гена Nqo1 человека [4], показано, что и фрагмент 1-36, и фрагмент 37-191 действительно активиру ют транскрипцию ARE-зависимых генов. Обработка антиоксидантом или ингибитором протеинкиназы С снижала уровень экспрессии люциферазы в случае полноразмерного белка капсида (рис. 3A) и предот вращала активацию в случае фрагмента 37-191 а.о. (рис. 3В). В клетках, экспрессирующих N-концевой фрагмент, экспрессию люциферазы блокировали только ингибиторы казеинкиназы и фосфоинозитид- 3-киназы (рис. 3Б). Аналогичные результаты полу чены и при изучении действия ингибиторов проте инкиназ на транслокацию фактора Nrf2 (рис. 3Г). Примечательно, что в случае полноразмерного белка капсида ингибиторы всех трех протеинкиназ не пре дотвращали перенос Nrf2 в ядро, а лишь примерно в 2 раза снижали его, что свидетельствует о сопо ставимом вкладе двух рассмотренных механизмов активации каскада. Полученные нами данные о том, что N-концевой домен белка капсида ВГС активирует Nrf2 по АФК независимому механизму при участии казеинкиназы 2 и фосфоинозитид-3-киназы, а фрагмент 37-191 - по АФК-зависимому пути при участии протеинки назы С, позволили подтвердить полную независи мость этих двух механизмов. Более того, активация казеинкиназы 2 и фосфоинозитид-3-киназы проис ходит под действием того же домена белка капсида, который взаимодействует с различными белками клетки-хозяина, включая хеликазу DDX3, фактор транскрипции STAT1 и рецептор лимфотоксина β ([1, 8] и ссылки в них). Кроме того, оба механизма акти вации каскада Nrf2/ARE запускались как при лока лизации различных вариантов белка капсида в ядре (фрагменты 1-36 и 1-151), так и при локализации на поверхности эндоплазматического ретикулума (фрагменты 37-191 и 1-191). Это говорит о возмож ном запуске каскада в процессе биосинтеза белка капсида в эндоплазматическом ретикулуме. ВЫВОДЫ В данной работе впервые установлены участки пер вичной структуры белков капсида и NS5A, акти вирующие каскад Nrf2/ARE. Показано, что АФК зависимый и АФК-независимый механизмы этой активации не имеют общих регуляторов.

×

Об авторах

O. A. Смирнова

Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН

Email: aivanov@yandex.ru
Россия

O. Н. Иванова

Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН

Email: aivanov@yandex.ru
Россия

Ф. Ш. Мухтаров

Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН

Email: aivanov@yandex.ru
Россия

В. Л. Туницкая

Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН

Email: aivanov@yandex.ru
Россия

Ю. Янсонс

Рижский университет им. Страдыня

Email: aivanov@yandex.ru
Латвия

M. Г. Исагулянц

Рижский университет им. Страдыня; Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика М.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ

Email: aivanov@yandex.ru
Латвия

С. Н. Кочетков

Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН

Email: aivanov@yandex.ru
Россия

A. В. Иванов

Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: aivanov@yandex.ru
Россия

Список литературы

  1. Lemon S.M., Walker C.M., Alter M.J., Yi M.K. // Hepatitis C virus // Fields Virology. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2007. 2007, P.1253-1304
  2. Ivanov A.V., Bartosch B., Smirnova O.A., Isaguliants M.G., Kochetkov S.N. // Viruses. 2013, V.5, №2, P.439-469
  3. Zhang M., An C., Gao Y., Leak R.K., Chen J., Zhang F. // Prog. Neurobiol. 2013, V.100, P.30-47
  4. Ivanov A.V., Smirnova O.A., Ivanova O.N., Masalova O.V., Kochetkov S.N., Isaguliants M.G. // PLoS One. 2011, V.6, №9, e24957
  5. Okuda M., Li K., Beard M.R., Showalter L.A., Scholle F., Lemon S.M., Weinman S.A. // Gastroenterology. 2002, V.122, №2, P.366-375
  6. Gong G., Waris G., Tanveer R., Siddiqui A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, V.98, №17, P.9599-9604
  7. Smirnova O.A., Ivanova O.N., Bartosch B., Valuev-Elliston V.T., Mukhtarov F., Kochetkov S.N., Ivanov A.V. // Oxid Med. Cell Longev. 2016, V.2016, P.8341937
  8. Ivanov A.V., Smirnova O.A., Petrushanko I.Y., Ivanova O.N., Karpenko I.L., Alekseeva E., Sominskaya I., Makarov A.A., Bartosch B., Kochetkov S.N. // Viruses. 2015, V.7, №6, P.2745-2770
  9. Tellinghuisen T.L., Marcotrigiano J., Rice C.M. // Nature 2005, V.435, №7040, P.374-379
  10. Hanoulle X., Verdegem D., Badillo A., Wieruszeski J.M., Penin F., Lippens G. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009, V.381, №4, P.634-638
  11. Liang Y., Ye H., Kang C.B., Yoon H.S. // Biochemistry. 2007, V.46, №41, P.11550-11558
  12. Huang Y., Staschke K., De Francesco R., Tan S.L. // Virology 2007, V.364, №1, P.1-9

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Смирнова O.A., Иванова O.Н., Мухтаров Ф.Ш., Туницкая В.Л., Янсонс Ю., Исагулянц M.Г., Кочетков С.Н., Иванов A.В., 2016

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах