Идентификация новых структурных фрагментов для дизайна ингибиторов лактатдегидрогеназы A

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Лактатдегидрогеназа A играет важную роль в метаболизме глюкозы в опухолевых клетках человека и представляет собой перспективную мишень для химиотерапии. С использованием компьютерного скрининга сульфонатов и экспериментальной проверки ингибиторных свойств выявлены молекулярные фрагменты, способные связываться в активном центре данного фермента и реализовать водородные связи заряженной сульфогруппы с гуанидиновой группой Arg168, а также дополнительные взаимодействия с петлей 96-111 в закрытой конформации. Показано, что сульфогруппа занимает положение, соответствующее карбоксильной группе субстрата и его структурных аналогов, а присоединенная посредством линкера бензотиазольная группа располагается на участке связывания кофермента NADH. Показана важность объединения отдельных структурных элементов ингибитора с помощью линкера, установлены пути дальнейшей модификации структуры для создания более эффективных ингибиторов лактатдегидрогеназы А.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует пре вращение продукта гликолиза пирувата в лактат, сопровождающееся окислением NADH до NAD+ (рис. 1). В здоровом организме человека изоформа А ЛДГ (ЛДГ-А) находится преимущественно в ске летных мышцах, изоформа B - в сердечной мышце, С - в яичках [1, 2]. Во многих опухолевых клетках наблюдается изменение метаболизма, называемое эффектом Варбурга: активация превращения пиру вата с помощью ЛДГ и снижение окисления пирувата в митохондриях [3, 4]. Одна из причин усиления гли колитической активности - увеличенная экспрессия ЛДГ-А [5, 6]. Этот фермент считается перспектив ной мишенью в терапии опухолей, так как играет важную роль в обеспечении жизни и пролиферации опухолевых клеток [7-9]. В этой связи представляет интерес поиск селективных ингибиторов ЛДГ-А че ловека и изучение их влияния на клеточном уровне. Известно несколько классов ингибиторов [10, 11], большинство из которых содержат в своей струк туре карбоксильную группу. В качестве примера можно привести структурный аналог субстрата ок самат и его многочисленные производные [12, 13]. Ключевыми для связывания пирувата и оксамата являются водородные связи карбоксильной группы с консервативным остатком Arg168 [14, 15]. Также в связывании субстрата, кофермента и ингибиторов участвуют остатки подвижной петли 96-111 [16], среди которых можно отметить Arg105 (стабилизи рует переходное состояние в ходе превращения суб страта). Установлены кристаллические структуры комплексов ЛДГ-А человека, в которых петля 96-111 представлена в закрытой или открытой конформа ции в зависимости от строения ингибитора [17-19]. В последнее время при разработке ингибиторов ЛДГ-А предприняты попытки поиска соединений, способных взаимодействовать с участками связыва ния субстрата и кофермента [20, 21]. Перспективным путем решения этой задачи представляется поиск молекулярных фрагментов - небольших молекул, способных образовать специфические взаимодей ствия с выбранными участками белка. В дальнейшем такие фрагменты, соединенные посредством подхо дящего линкера, могут стать основой новых, более эффективных ингибиторов фермента. Анализ опу бликованных данных о связывании субстрата, а так же производных оксаминовой и малоновой кислоты указывает на важность электростатических взаимо действий с гуанидиновой группой Arg168 в активном центре ЛДГ-А. С учетом этого фактора была постав лена цель - изучить возможность использования от рицательно заряженной сульфогруппы при дизайне структуры новых ингибиторов. Сульфозамещенные производные нафтали на 2 и 3 (рис. 1) упоминались в работе, посвящен ной поиску ингибиторов ЛДГ из малярийного паразита Plasmodium falciparum, однако они про явили лишь слабую ингибиторную активность [22]. Кристаллографическая структура комплекса 2 с ЛДГ из P. falciparum (PDB ID 1u4s) показала, что сульфо группа ингибитора взаимодействует с Arg171 (соот ветствует Arg168 в ЛДГ-А человека). Предположили, что ингибитор 2 связывается схожим образом с апо формой и комплексом ЛДГ-кофермент, не конкури руя с NADH. Необходимо отметить важные различия в устройстве активного центра ЛДГ паразита и чело века, главным образом, связанные с расположением кофермента и подвижной петли активного центра, которая в ЛДГ человека короче на пять остатков [23]. Это позволяет предположить, что структурные фрагменты ингибиторов ЛДГ-А человека на основе сульфонатов должны отличаться от соединений 2 и 3. В ранее проведенном исследовании мы создали моде ли ЛДГ-А человека для поиска ингибиторов, конку рентных по отношению к субстрату и к коферменту, а также определили структурные критерии отбора потенциальных ингибиторов [24]. Разработанная методика использована для скрининга молекуляр ных фрагментов с сульфогруппой, которые могли бы стать аддитивными компонентами дизайна более эф фективных ингибиторов ЛДГ-А. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Компьютерный скрининг ингибиторов ЛДГ-А прово дили среди низкомолекулярных соединений из би блиотеки Vitas-M [25]. С помощью программы ACD/ Spectrus DB 14.0 [26] отобрали соединения, содер жащие сульфогруппу и удовлетворяющие правилу трех [27, 28]. Это правило определяет диапазон фи зико-химических параметров, которым характери зуются молекулярные фрагменты (молекулярная масса < 300, log P ≤ 3, доноры водородной связи ≤ 3, акцепторы водородной связи ≤ 3, вращаемые связи ≤ 3). Молекулярный докинг соединений из созданной сфокусированной библиотеки проводили с использо ванием программы Lead Finder 1.1.15 [29, 30] в режи ме «extra precision» и моделей ЛДГ-А человека (со связанной молекулой NADH и без нее), полученных в нашей предыдущей работе [24]. На первом этапе отбор ингибиторов осуществляли путем отбраковки соединений, при связывании которых с ЛДГ-А рас стояние между серой сульфогруппы и углеродом гу анидиновой группы Arg168 составляло более 5.5 Å. В дальнейшем проверяли способность соединений, соответствующих критериям проведенной струк турной фильтрации, образовывать водородные связи и гидрофобные контакты с остатками петли 96-111 [24]. Визуализацию и анализ структур осуществляли с помощью VMD 1.9.2 [31]. Ферментативную активность ЛДГ определя ли с использованием препарата из мышц кроли ка (Sigma-Aldrich). Для приготовления растворов и проведения измерений использовали 0.1 М калий фосфатный буфер, pH 7.0. Раствор фермента, содер жащий 1% (г/мл) бычьего сывороточного альбумина (БСА), готовили непосредственно перед измерени ями. Активность ЛДГ-А измеряли спектрофотоме трически при 340 нм по уменьшению поглощения NADH в реакции превращения пирувата в лактат. Измерения проводили с использованием спектро фотометра Shimadzu UV-1800. В кювету помещали реакционную смесь, содержащую буфер, пируват (400 мкМ), NADH (20 мкМ) и ингибитор, термоста тировали в течение 5 мин при 37°С, после чего на чинали реакцию добавлением аликвоты фермента. Начальную скорость ферментативной реакции опре деляли в двух независимых опытах. Значения IC50 (концентрация ингибитора, при которой активность фермента снижена на 50%) определяли при варьи ровании концентрации ингибитора в диапазоне от 0 до 8 мМ. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Кристаллографические исследования показали, что сульфозамещенное производное 2 способно свя зываться только с открытой конформацией ЛДГ из P. falciparum с неупорядоченной петлей актив ного центра. Очевидно, что структурные фрагменты, содержащие сульфогруппу и способные связываться с ферментом в закрытой конформации, т.е. в тех ус ловиях, когда можно ожидать эффективного взаи модействия с петлей 96-111, должны весьма сильно отличаться от соединений 2 и 3. Для выявления но вых фрагментов из библиотеки низкомолекулярных соединений были отобраны сульфоновые кислоты и их соли (71 соединение). Соединения докировали в активный центр разработанных ранее моделей ЛДГ-А человека, после чего анализировали их спо собность осуществлять важное электростатическое взаимодействие с остатком Arg168, а также допол нительные взаимодействия с остатками петли 96-111 в закрытой конформации. В результате проведенного скрининга выбран наиболее перспективный ингиби тор - соединение 4, способное эффективно связы ваться с апоформой ЛДГ-А (ΔGcalc = -9.9 ккал/моль). Экспериментально изучали ингибиторные свой ства соединения 4 в отношении к ЛДГ из мышц кролика, активный центр которой обладает вы соким структурным сходством с ЛДГ-А человека [32], определенное значение IC50 составило 1.2 мМ. Интересно, что ингибитор 4 связывается схожим об разом с исследованным ранее производным оксамата STK381370 (ΔGcalc = -7.9 ккал/моль, IC50 5 мМ) [24], образуя дополнительные контакты с петлей 96-111, однако эффективность его взаимодействия выше. Полученные результаты свидетельствуют о том, что используемая модель закрытой конформации фермента адекватно симулирует связывание соеди нений разных классов. Локализация структурного фрагмента с заря женной сульфогруппой на участке связывания субстрата приводит к стабилизации положения ингибитора за счет образования водородных свя зей с гуанидиновыми группами Arg168 и Arg105 (рис. 2А). Чрезвычайно большое значение для ди зайна ингибиторов ЛДГ-А имеет способ соединения отдельных элементов структуры. Так, например, благодаря гибкости линкера, связывающего сульфо группу и бензотиазольную группу, возможна реали зация одновременных взаимодействий соединения 4 как с участком связывания субстрата, так и никоти намидного нуклеотида NADH. Тиоэфирный линкер образует водородную связь с боковой цепью Gln99, а бензотиазольная группа, расположенная на участ ке первого остатка рибозы кофермента, образует выгодный гидрофобный контакт с Сβ-атомом боко вой цепи Arg98. Необходимо отметить, что перечис ленные взаимодействия с остатками Arg98, Gln99 и Arg105 реализуются только при переходе петли активного центра в закрытую конформацию и важны для ее стабилизации. Также при связывании сульфо ната имеют место дополнительные взаимодействия: характерные для оксамата водородные связи между сульфогруппой, Asn137 и Thr247, гидрофобные кон такты линкера с Ile241 и бензотиазольной группы с Val30, водородная связь гетероатома кольца с кар боксамидом Asn137 (на рисунке не показаны). Среди изученных в ходе скрининга сульфопроиз водных представлены структуры без гибкого линке ра (в том числе, производные нафталина), с линке ром, удлиненным на одно метиленовое звено, а также с бензолом, пирролом и пиридином на участке бен зотиазола 4. Все эти соединения характеризова лись худшей энергией связывания и не обладали способностью вступать во взаимодействия, доста точные для стабилизации петли 96-111 в закрытой конформации. Это указывает на то, что структура остова 4 является наиболее оптимальной для связы вания в активном центре и может служить основой для дальнейших модификаций. Так, например, вве дение гидроксильной группы в положение 7 позво ляет этому заместителю занять место 3’-OH-группы первого остатка рибозы NADH и образовать соот ветствующие водородные связи с остовами Ala97 и Asn137 (соединение 5, рис. 2Б). Расчет энергии связывания (ΔGcalc = -10.9 ккал/моль) показывает, что данная модификация приводит к дополнитель ному энергетическому выигрышу. Увеличение эф фективности ингибирования фермента при введении заместителей в бензотиазольную группу говорит о перспективности дальнейшего поиска структурных фрагментов и путей их объединения с целью полу чения аддитивного (а, может быть, и синергического) эффекта при создании новых ингибиторов ЛДГ-А. ВЫВОДЫ Целью настоящей работы был поиск новых моле кулярных фрагментов для дизайна ингибиторов ЛДГ-А, способных реализовать характерное для суб стратов и ранее описанных ингибиторов взаимо действие заряженной кислотной группы с Arg168 и аминокислотными остатками петли активного цен тра на участке связывания субстрата, а также вза имодействие с участком связывания кофермента. В результате компьютерного скрининга и экспери ментальной проверки ингибиторных свойств обнару жены новые фрагменты, включающие сульфогруп пу, линкер и бензотиазольную группу. Проведенные исследования позволили выявить наиболее значимые взаимодействия и аминокислотные остатки, кото рые принимают участие в стабилизации положения ингибиторов с сульфогруппой (Ala97, Arg98, Gln99, Arg105, Arg168) в закрытой конформации фермен та. Таким образом, апробирована методология поис ка новых ингибиторов ЛДГ-А, и установлены пути дальнейшей оптимизации их структуры.

×

Об авторах

Д. K. Нилов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: nilov@belozersky.msu.ru
Россия

A. В. Куликов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nilov@belozersky.msu.ru
Россия

E. A. Прохорова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nilov@belozersky.msu.ru
Россия

В. K. Швядас

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nilov@belozersky.msu.ru
Россия

Список литературы

  1. Kolappan S., Shen D.L., Mosi R., Sun J., McEachern E.J., Vocadlo D.J., Craig L. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2015, V.71, P.185-195
  2. Everse J., Kaplan N.O. // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1973, V.37, P.61-133
  3. Warburg O. // Science. 1956, V.124, P.269-270
  4. Hamanaka R.B., Chandel N.S. // J. Exp. Med. 2012, V.209, P.211-215
  5. Goldman R.D., Kaplan N.O., Hall T.C. // Cancer Research 1964, V.24, P.389-399
  6. Koukourakis M.I., Giatromanolaki A., Sivridis E., Bougioukas G., Didilis V., Gatter K.C., Harris A.L. // Br. J. Cancer. 2003, V.89, P.877-885
  7. Fantin V.R., St-Pierre J., Leder P. // Cancer Cell. 2006, V.9, P.425-434
  8. Le A., Cooper C.R., Gouw A.M., Dinavahi R., Maitra A., Deck L.M., Royer R.E., Vander Jagt D.L., Semenza G.L., Dang C.V. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010, V.107, P.2037-2042
  9. Miao P., Sheng S., Sun X., Liu J., Huang G. // IUBMB Life. 2013. V. 65, 2013, V.65, P.904-910
  10. Granchi C., Bertini S., Macchia M., Minutolo F. // Curr. Med. Chem. 2010, V.17, P.672-697
  11. Granchi C., Paterni I., Rani R., Minutolo F. // Future Med. Chem. 2013, V.5, P.1967-1991
  12. Yu Y., Deck J.A., Hunsaker L.A., Deck L.M., Royer R.E., Goldberg E., Vander Jagt D.L. // Biochem. Pharmacol. 2001, V.62, P.81-89
  13. Choi S.R., Beeler A.B., Pradhan A., Watkins E.B., Rimoldi J.M., Tekwani B., Avery M.A. // J. Comb. Chem. 2007, V.9, P.292-300
  14. Dunn C.R., Wilks H.M., Halsall D.J., Atkinson T., Clarke A.R., Muirhead H., Holbrook J.J. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1997, V.332, P.177-184
  15. Read J.A., Winter V.J., Eszes C.M., Sessions R.B., Brady R.L. // Proteins. 2001, V.43, P.175-185
  16. Gerstein M., Chothia C. // J. Mol. Biol. 1991, V.220, P.133-149
  17. Ward R.A., Brassington C., Breeze A.L., Caputo A., Critchlow S., Davies G., Goodwin L., Hassall G., Greenwood R., Holdgate G.A. // J. Med. Chem. 2012. 2012, V.55, P.3285-3306
  18. Dragovich P.S., Fauber B.P., Corson L.B., Ding C.Z., Eigenbrot C., Ge H., Giannetti A.M., Hunsaker T., Labadie S., Liu Y. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, V.23, P.3186-3194
  19. Fauber B.P., Dragovich P.S., Chen J., Corson L.B., Ding C.Z., Eigenbrot C., Giannetti A.M., Hunsaker T., Labadie S., Liu Y. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, V.23, P.5533-5539
  20. Moorhouse A.D., Spiteri C., Sharma P., Zloh M., Moses J.E. // Chem. Commun. (Camb.). 2011, V.47, P.230-232
  21. Kohlmann A., Zech S.G., Li F., Zhou T., Squillace R.M., Commodore L., Greenfield M.T., Lu X., Miller D.P., Huang W.S. // J. Med. Chem. 2013, V.56, P.1023-1040
  22. Conners R., Schambach F., Read J., Cameron A., Sessions R.B., Vivas L., Easton A., Croft S.L., Brady R.L. // Mol. Biochem. Parasitol. 2005, V.142, P.137-148
  23. Dunn C.R., Banfield M.J., Barker J.J., Higham C.W., Moreton K.M., Turgut-Balik D., Brady R.L., Holbrook J.J. // Nat. Struct. Biol. 1996, V.3, P.912-915
  24. Nilov D.K., Prokhorova E.A., Švedas V.K. // Acta Naturae. 2015, V.7, №2(25), P.57-63
  25. // ST(K/L) collection. Vitas-M Laboratory, Ltd 2012, url http://www.vitasmlab.com
  26. // ACD/Spectrus DB, version 14.01. Advanced Chemistry Development, Inc 2012, url http://www.acdlabs.com
  27. Congreve M., Carr R., Murray C., Jhoti H. // Drug Discov. Today. 2003, V.8, P.876-877
  28. Lipinski C.A. // Drug Discov. Today Technol. 2004, V.1, P.337-341
  29. Stroganov O.V., Novikov F.N., Stroylov V.S., Kulkov V., Chilov G.G. // J. Chem. Inf. Model. 2008, V.48, P.2371-2385
  30. Novikov F.N., Stroylov V.S., Stroganov O.V., Kulkov V., Chilov G.G. // J. Mol. Model. 2009, V.15, P.1337-1347
  31. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. // J. Molec. Graphics. 1996, V.14.1, P.33-38
  32. Swiderek K., Panczakiewicz A., Bujacz A., Bujacz G., Paneth P. // J. Phys. Chem. B. 2009, V.113, P.12782-12789

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Нилов Д.K., Куликов A.В., Прохорова E.A., Швядас В.K., 2016

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах