Индуцированный адъювантом артрит у морских свинок

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Ревматоидный артрит (РА) - гетерогенное ауто иммунное заболевание, характеризующееся си стемным воспалением соединительной ткани. Морфологически при РА наблюдаются воспалитель ные явления в тканях суставной сумки, пролифера ция и гиперплазия клеток синовиальной оболочки, формирование паннуса, структурное разрушение хряща и субхондральной кости. РА характеризуется неуклонно прогрессирующим поражением суставов и внутренних органов, приводящим к ранней потере трудоспособности и сокращению продолжительно сти жизни. РА болеют около 70 млн жителей земного шара, чаще всего болезнь поражает людей старшего возраста. Причины, обуславливающие развитие ар трита, до сих пор четко не определены, возможно, вследствие их множественности [1-4]. Для изучения патогенеза РА и разработки лекар ственных средств, эффективных при данном забо левании, используют различные животные модели. При этом подавляющее большинство исследований по индукции и терапии РА выполняют на определен ных линиях мышей и крыс [1, 2, 5, 6]. Это обуслов лено, в первую очередь, хорошей генетической изу ченностью и гомогенностью данных линий животных и большим числом имеющихся иммунологических реагентов и тест-систем. Однако ни одна из моделей не отражает полностью всех аспектов развития РА человека [1, 5, 7], поэтому доклинические исследова ния потенциальных противоартритных препаратов необходимо проводить одновременно на разных жи вотных моделях. Генетическая гетерогенность людей и вероятная множественность механизмов индукции развития артрита делают актуальным использование в каче стве моделей РА лабораторных животных, прибли женных по своим физиологическим и иммунологиче ским свойствам к человеку. Считается, что морские свинки представляют более адекватную модель для изучения и разработки методов терапии различ ных воспалительных и инфекционных заболеваний человека, чем мыши и крысы [8-10]. Целью нашей работы было создание воспроизво димой модели адъювант-индуцированного артрита (АИА) у беспородных морских свинок. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Животные Использовали самок беспородных морских сви нок массой 200-250 г (возраст 3-4 недели), полу ченных из питомника животных ГНЦ ВБ «Вектор». Животных содержали при естественном световом режиме и постоянном доступе к воде и пище. Индукция артрита адъювантом Фрейнда Животным в стопу задней левой лапы подкожно вводили раствор полного адъюванта Фрейнда (CFA) в объеме 50, 100 или 200 мкл, формируя группы «50», «100» и «200» соответственно. Морским свин кам контрольной группы («К») вводили 200 мкл на трий-фосфатного буфера (PBS). В контрольной груп пе и группе «50» было по 9 морских свинок, в группе «100» - 14, в группе «200» - 10 животных. Через 1 сут после инъекции CFA, а затем каждые 3-4 сут измеряли ширину дистального района плюс ны обеих задних лап. По 2-3 особи групп «К», «50» и «200» выводили из эксперимента под эфирным нар козом согласно правилам использования животных с соблюдением принципов гуманности, изложенным в Директивах Европейского сообщества (86/609/ ЕЕС) и Хельсинкской декларации в сроки 16, 28, 42 и 56 сут. Патологические изменения, вызванные введением CFA, оценивали путем гистологическо го исследования тканей обеих задних конечностей опытных и контрольных животных. Всех животных группы «100» вывели из эксперимента на 28 сут по сле инъекции CFA. Гистологический анализ Задние конечности морских свинок фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина для гисто логических исследований («БиоВитрум», Россия) в течение 48 ч. Затем образцы, содержащие кость, декальцинировали препаратом BioDec R (Bio Optica Milano, Италия) в течение 48-72 ч. После декальцина ции для приготовления гистологических препаратов задние стопы животных рассекали в сагиттальном направлении как описано в [2]. Дальнейшую обработ ку материала проводили по общепринятой для гисто логических препаратов методике: последовательно обезвоживали в спиртах возрастающей концентра ции, пропитывали в смеси ксилолпарафин и залива ли в парафиновые блоки. Парафиновые срезы тол щиной 4-5 мкм готовили с помощью автоматического ротационного микротома НМ-360 (Германия). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для диффе ренцированного окрашивания соединительной ткани применяли окраску по Ван Гизон. Светооптическое исследование и микрофотосъемку проводили на ми кроскопе AxioImager Z1 (Carl Zeiss, Германия), осна щенном цифровой камерой высокого разрешения HRc (Carl Zeiss, Германия) с использованием пакета про грамм AxioVision 4.8.2 (Carl Zeiss, Германия). Для статистической обработки результатов ги стологического анализа образцов животных группы «100» применяли балльную оценку степени патоло гических проявлений заболевания в разных группах. Тяжесть заболевания оценивали по четырем при знакам: наличие воспалительной реакции в тканях суставной сумки, степень выраженности синовита (образование паннуса), эрозия хрящевой ткани и де струкция суставной поверхности кости. Воспалительную реакцию оценивали в 1 балл при инфильтрации единичными лимфоцитами и гра нулоцитами тканей, окружающих сустав; 2 бал ла - при выраженной инфильтрации, образовании небольших лимфоцитарно-гистиоцитарных узелков, умеренно выраженном отеке околосуставных тканей. При выраженной диффузной инфильтрации мягких тканей клетками макрофагального ряда, лимфоци тами, гранулоцитами и плазматическими клетками, образовании плотного инфильтрата, выраженном от еке степень воспалительной реакции считали равной 3 баллам. Степень развития синовита оценивали следующим образом: 1 балл - отмечаются признаки набухания синовиальной оболочки и пролиферация синовио цитов; 2 балла - в местах соприкосновения синови альной оболочки и хряща, образующего суставную поверхность, активно пролиферирующая грануля ционная ткань формирует паннус; 3 балла - паннус «наползает» на суставной хрящ и разрушает его. Разрушение хряща оценивали по глубине повреж дения: 1 балл - эрозия поверхностного слоя (сустав ной поверхности) либо появление полей, лишенных клеток; 2 балла - повреждения распространяются на половину толщины хряща; 3 балла - деструкция захватывает весь хрящ. Степень деструкции кости: 1 балл - появление не больших участков резорбции в эпифизарных участ ках костей, образующих сустав; 2 балла - локальные повреждения кортикального слоя в области эпифи за; 3 балла - обширное повреждение кортикального слоя, разрушение трабекул губчатого вещества, де формация кости. РЕЗУЛЬТАТЫ Клинические проявления артрита при инъекции CFA морским свинкам Беспородным морским свинкам подкожно в стопу задней левой лапы вводили CFA в объеме 50, 100 или 200 мкл. Измерения ширины дистального района плюсны обеих задних лап показали, что размер зад ней конечности, в которую вводили адъювант, уве личивается в результате развития воспалительной реакции (рис. 1). Реакция (отек и воспаление) на инъ екцию CFA проявлялась уже в первые сутки после инъекции, отек обработанной лапы активно увеличивался в первые 2 недели, затем этот показатель практически выходил на плато. При этом в группе «200» отек был сильнее и охватывал почти всю лапу (рис. 2). Гистологический анализ задних лап морских свинок с АИА, группа «200» Патоморфологические проявления артрита были однотипными во всех группах животных с АИА. Наиболее интенсивные изменения выявлены в зад ней левой лапе (на стороне инъекции индуцирующе го препарата CFA) в группе «200», поэтому дальней шее описание в данном разделе касается именно этой группы. К 16 сут эксперимента на фоне неизмененных поверхностных слоев кожи в сетчатом слое дермы, в подкожной жировой клетчатке и между волокнами мышечной ткани обнаруживали диффузную плот ную клеточную инфильтрацию. В составе инфиль трата преобладали гранулоциты (преимущественно нейтрофилы), макрофаги и небольшое количество плазматических клеток. В центральной части осо бенно крупных областей инфильтрации иногда обна руживали зоны некротического распада. В области суставов наблюдали выраженный отек, воспалитель но-клеточную инфильтрацию (рис. 3В), гемодина мические расстройства в виде резкого полнокровия сосудов мелкого и среднего калибра, стаза и тромбо за мелких сосудов венозного русла. Синовиальная оболочка была набухшей и резко утолщенной за счет пролиферации клеток. В краевой зоне синовиальной оболочки, в месте, где она прилежит к хрящу, наблю дали развитие грануляционной ткани и распростра нение ее на суставную поверхность хряща (рис. 3Г). Повреждения хряща ограничивались различной ве личины эрозиями, трещинами и образованием в хря ще бесклеточных зон (рис. 4В). Изменений субхон дральной костной ткани на этом сроке эксперимента не обнаружено (рис. 4Г). К 28 сут нарастали явления отека и воспали тельно-клеточной инфильтрации в мягких тканях, окружающих сустав (рис. 3Д). Поражения суставов прогрессировали. Воспалительный процесс преиму щественно затрагивал крупные суставы: голено стопный и таранно-ладьевидный. Мелкие суставы предплюсны и плюсны были повреждены в меньшей степени. Наблюдали резкое утолщение синовиальной оболочки, покрывающей ворсины, пролиферирую щие синовиальные клетки располагались в несколь ко слоев. В некоторых случаях синовиальные клетки слущивались в полость сустава (рис. 3Е). В подэпи телиальном слое пространство вокруг сосудов было расширено, наблюдался выраженный периваску лярный отек, отек и расслоение мышечной оболочки сосудов, отек и утолщение эндотелия, маргинация и адгезия нейтрофилов на эндотелиоцитах. По краям суставного хряща обнаруживали разрастание грану ляционной ткани, которая в виде паннуса «наполза ла» на хрящ (рис. 4Д). Хрящевая ткань повреждалась в разной степени, как правило, выявляли довольно обширные поля эрозии поверхностного слоя и участ ки деструкции, иногда распространявшиеся на всю толщину хряща. Обнаруживали истончение субхон дральной костной пластинки и появление доволь но обширных зон деструкции кортикального слоя (рис. 4Е). Через 42 сут после введения CFA на стороне вве дения обнаруживали массивную инфильтрацию мягких тканей стопы с участками некроза в центральной части инфильтрата. По периферии очагов инфиль трации наблюдали ангиоматоз, полнокровие, боль шое количество фибробластов, что свидетельство вало о начале активного процесса репарации тканей суставной сумки (рис. 3Ж). Синовиальная оболочка была резко отечной, ее гипертрофированные вор сины глубоко вдавались в полость сустава. Под обо лочкой и в ворсинах наблюдали активный процесс новообразования сосудов и регенерации соедини тельной ткани (рис. 3З). Поражения хряща и кости были множественными и захватывали как крупные суставы, так и мелкие суставы плюсны. Степень де градации также была различной - от маргинальной деформации хряща (рис. 4Ж) до полной потери хря ща на значительной площади суставной поверхности и локального разрушения костных трабекул губчато го вещества кости (рис. 4З). На 56 сут эксперимента наблюдали некоторое снижение активности воспалительного процесса и при этом усиление склероза тканей, окружающих воспалительный инфильтрат (рис. 3И). В некоторых случаях соединительная ткань прорастала в инфиль трат, образуя более мелкие клеточно-фиброзные гра нулемы, окруженные фиброзной капсулой. Несмотря на снижение воспалительной реакции в окружаю щих тканях, воспалительный процесс в синовиаль ной оболочке оставался активным. Проявления сино вита различной степени выраженности наблюдали у всех животных. Под синовиальной оболочкой, кро ме диффузной инфильтрации, нередко обнаружи вали небольшие грануломатозные узелки (рис. 3К). Наблюдали глубокую деструкцию суставного хряща (рис. 4И) и прорастание грануляционной ткани в губ чатое вещество кости (рис. 4К). В правых задних необработанных конечностях воспаление проявлялось в виде небольших очагов воспалительно-клеточной инфильтрации, в основном по ходу сосудов небольшого калибра. Тем не менее проявления синовита, хотя и в гораздо меньшей сте пени, чем на стороне инъекции CFA, обнаруживали через 42 и 56 сут после введения адъюванта. Кроме того, через 56 сут в этих конечностях выявляли эро зивные поражения суставного хряща. Гистологический анализ задних лап морских свинок с АИА, группа «50» Патологические изменения в задних конечностях морских свинок группы «50» отличались от изме нений в группе «200» в основном степенью их про явлений. В группе «50» воспалительные явления в околосуставной сумке и окружающих тканях до стигали максимума через 28 сут после инъекции CFA, в то время как в группе «200» активный воспа лительный процесс продолжался и на протяжении 42 сут эксперимента. К 28 сут в обеих группах появ лялись первые признаки регенерации вокруг очага воспаления в виде пролиферации сосудов и разрас тания рыхлой неоформленной соединительной ткани. В суставе наблюдались глубокие эрозии хряща и де структивные поражения кортикального слоя кости, усиливающиеся в более поздние сроки. Однако сте пень проявления этих признаков была значительно меньше, чем в группе «200». Кроме того, патологи ческий процесс захватывал, как правило, один су став, в то время как в группе «200» поражались два или даже три сустава задней конечности. Воспроизводимость АИА у морских свинок, группа «100» У всех 14 морских свинок группы «100», которую мы использовали для оценки воспроизводимости АИА, на стороне инъекции CFA (левая задняя лапа) развивалось характерное для ревматоидного артрита поражение синовиальной оболочки и суставного хря ща. Кроме эрозии поверхности хряща, обнаруженной у всех животных этой группы, в половине случаев деструкция распространялась на половину толщи ны суставного хряща, а в двух случаях на отдельных участках хрящ был разрушен полностью, и наблю далось повреждение подлежащей кости. У четырех животных, несмотря на довольно выраженное вос паление в тканях суставной сумки и в синовиальной оболочке, суставной хрящ голеностопного сустава не был поражен. В то же время у этих животных на блюдалась деструкция хряща других суставов. В симметричных месту введения CFA конечностях воспаление практически отсутствовало. Выявляли лишь небольшие очаги воспалительно-клеточной инфильтрации по ходу сосудов небольшого кали бра. Тем не менее у половины животных отмече ны умеренно выраженные проявления синовита, а у двух - эрозивные поражения суставного хряща. Причем в одном случае на ограниченном участке де струкция хрящевой ткани распространялась на всю толщину суставного хряща, что, однако, не уклады вается в общую картину поражения в этой группе животных. Степень различных патологических про явлений у отдельных животных, оцененная по трех балльной шкале (см. раздел «Экспериментальная часть»), приведена в таблице, а средние суммарные значения для всей группы «100» приведены на рис. 5. ОБСУЖДЕНИЕ Известно, что РА - заболевание, для которого ха рактерны различия как в молекулярных механизмах возникновения, так и в чувствительности отдельных индивидов к разным терапевтическим препаратам. Поэтому при тестировании потенциальных противо артритных препаратов рекомендуется использовать разные лабораторные модели [1-3, 5, 6, 11]. В насто ящее время наиболее хорошо изучены модели инду цированного артрита, в которых используются неко торые линии мышей и крыс [1, 2, 5, 6]. Однако ни одна из этих моделей не отражает все особенности РА у человека [5], поэтому поиск дополнительных экс периментальных моделей РА остается актуальным. Мы оценили эффективность индукции артрита по сле инъекции CFA подкожно в стопу задней конечно сти беспородных морских свинок и воспроизводимое развитие у них АИА. Показано, что в результате введения индуциру ющего артрит препарата CFA на стороне инъекции развивается гранулематозное воспаление мягких тканей стопы, распространяющееся на суставные сумки крупных и мелких суставов. Активная фаза воспаления в околосуставных тканях стихает к 42 сут эксперимента. Через 28 сут появляются, а в даль нейшем усиливаются явления склероза, приводящие к инкапсуляции очага воспаления. В то же время па тологический процесс в самом суставе, приводящий к глубокой деструкции суставного хряща и подле жащей кости, не прекращается и на последнем сроке наблюдения (56 сут), что может свидетельствовать о переходе артрита в хроническую форму. Несмотря на довольно выраженное воспаление в околосустав ных тканях, патологические процессы развивают ся не во всех суставах задней конечности. При этом частота и степень поражения суставов явно зависят от введенной дозы. В группе «200», где индуцирую щая доза была самой высокой, отмечены наиболее тяжелые поражения суставов. В данной модели присутствуют характерные для РА в острой фазе отложения фибрина на по верхности синовиальной оболочки, лейкоцитарная инфильтрация синовиальной оболочки и окружающих тканей, продуктивная реакция в виде разрас тания грануляционной ткани и появление участков ангиоматоза. Клеточная реакция, выражающаяся увеличением количества плазмоцитов и образовани ем фолликулоподобных лимфоидных инфильтратов, эрозивным поражением суставной поверхности хря ща, нередко с его глубокой деструкцией на больших участках, и поражением эпифизов костей, дополняет картину системного заболевания. Известно, что даже использование линейных мы шей или крыс обычно не приводит к индукции экс периментального артрита у всех исследуемых жи вотных [1, 2]. Это снижает информативность данных, полученных при доклинических испытаниях новых методов терапии РА. Поэтому поиск хорошо воспро изводимых моделей индуцированного артрита оста ется важным направлением исследований [2, 11, 12]. Мы количественно оценили воспроизводимость АИА у морских свинок в группе «100». Показано (табли ца), что введение CFA в дозе 100 мкл вызывало вы раженное поражение тканей суставов (на стороне введения препарата), что свидетельствует о хорошей воспроизводимости индукции артрита в использо ванной модели РА и ее перспективности для оцен ки противоартритных препаратов и схем их приме нения. Следует отметить, что через 28 сут в правой (необработанной) задней лапе всех морских свинок группы «100», за исключением животного № 12 (та блица), патологические изменения отсутствовали либо были существенно менее выражены, чем в ле вой (обработанной) лапе. По-видимому, дистрофические процессы в подле жащей костной ткани животных группы «100» к это му времени (28 сут) не успевают развиться в полной мере, вследствие чего выраженность воспалительно го процесса, довольно заметная в суставных тканях, не всегда коррелирует с поражением субхондраль ной кости. Однако в модели, которая будет исполь зоваться для оценки эффективности перспективных препаратов, это скорее преимущество, чем недоста ток, так как далеко зашедший деструктивный про цесс в суставе труднее поддается воздействию терапевтических препаратов и соответственно за трудняет оценку результатов лечения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Предложена лабораторная модель РА, основанная на подкожной инъекции CFA беспородным морским свинкам. Показана высокая эффективность и воспро изводимость АИА у этих животных. Разработанная модель расширит возможности доклинического те стирования противоартритных препаратов.

Об авторах

O. С. Таранов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: snshchel@rambler.ru
Россия

С. Н. Якубицкий

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: snshchel@rambler.ru
Россия

T. С. Непомнящих

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: snshchel@rambler.ru
Россия

A. E. Нестеров

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: snshchel@rambler.ru
Россия

С. Н. Щелкунов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Автор, ответственный за переписку.
Email: snshchel@rambler.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы