Влияние дофамина, секретируемого мозгом в общую систему циркуляции, на синтез пролактина гипофизом в онтогенезе

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ У взрослых животных головной мозг и особенно ги поталамус являются центральным звеном системы нейроэндокринной регуляции важнейших функций и поддержания постоянства внутренней среды ор ганизма. Особое внимание привлекают формирова ние и функционирование нейроэндокринной системы регуляции в онтогенезе, поскольку в процессе раз вития гипоталамические нейрогормоны и гормоны эндокринных желез контролируют не столько функ циональную активность органов-мишеней, сколько их развитие. В последнем случае действие этих сиг нальных молекул носит необратимый (импринтинго вый, морфогенетический) характер [1-3]. Согласно сложившейся к концу 1980-х годов концепции, до своего полного созревания, т.е. до формирования межнейронных синаптических связей и гематоэнце фалического барьера (ГЭБ), мозг не участвует в ней роэндокринной регуляции периферических органов. Только после окончательной дифференцировки ней ронов и установления синаптической нейротранс миссии он берет под свой контроль гипофиз, а через него и все остальные эндокринные железы [4, 5]. В последние годы представления о роли мозга в нейроэндокринной регуляции в онтогенезе пре терпели существенные изменения. При анализе опубликованных данных и результатов собственных исследований в нашей лаборатории было замечено, что нейроны начинают синтезировать и выделять сигнальные молекулы задолго до формирования межнейронных синаптических связей и ГЭБ [6-8]. Это наблюдение позволило сформулировать гипо тезу, согласно которой до формирования ГЭБ мозг функционирует как эндокринный орган, выделяя в общую систему циркуляции физиологически ак тивные вещества и влияя таким образом на развитие и функционирование периферических органов и кле ток-мишеней [8]. В данной гипотезе можно выделить два основных положения: 1) мозг является источником сигнальных молекул в общей системе циркуляции с момента образования нейронов и до окончательного формирования синап тических связей и закрытия ГЭБ; 2) сигнальные молекулы, секретируемые мозгом в общую систему циркуляции в данный период онто генеза, способны оказывать прямое парааденогипо физарное эндокринное влияние на периферические органы-мишени. Первое положение гипотезы нашло подтверж дение в работах нашей лаборатории. На модели об ратимого специфического ингибирования синтеза катехоламинов в мозге неонатальных животных [9] получены прямые доказательства того, что в раннем постнатальном периоде, еще до формирования ГЭБ, мозг является источником дофамина в общей системе циркуляции. В ходе проверки справедливости второго положе ния в экспериментах in vitro и ex vivo в нашей ла боратории получены данные, согласно которым до фамин в той концентрации, в которой он находится в общей системе циркуляции, оказывает ингибирую щее влияние на выделение пролактина лактотрофа ми гипофиза [10]. У взрослых животных нейроэндокринная регу ляция осуществляется в основном через гипотала мо-гипофизарную портальную систему циркуляции. В перинатальном периоде развития крыс в отсут ствие ГЭБ теоретически регуляция может осущест вляться как через портальную, так и через общую систему циркуляции. Однако до сих пор не получе ны данные о вкладе каждого из путей в нейроэндо кринную регуляцию функционирования и развития периферических органов. Ответ на данный вопрос принципиально важен не только для доказательства эндокринной функции мозга, но и для понимания развития и функционирования системы нейроэндо кринной регуляции в онтогенезе. В связи с этим цель нашей работы состояла в из учении влияния дофамина, секретируемого мозгом в общую систему циркуляции, на синтез пролакти на гипофизом в онтогенезе. На модели хроническо го специфического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс с помощью нейротоксина 6-гидроксидофамина мы попытались оценить: 1) морфофункциональное состояние дофаминерги ческих нейронов тубероинфундибулярной системы мозга; 2) эндокринное влияние дофамина мозгового происхождения через общую систему циркуляции на синтез и выделение пролактина лактотрофами ги пофиза. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Животные, эксперименты В работе использовали 90 самцов крыс Вистар на вто рой день постнатального развития (П2). Для получе ния модели хронического специфического выключе ния синтеза ДА в мозге крысам в боковые желудочки мозга стереотаксически вводили 100 мкг 6-гидрок сидофамина (6-ГДА, Sigma, США) - специфический нейротоксин катехоламинергических нейронов, а кон трольным животным - 0.9% NaCl [11]. Для того чтобы вызвать избирательную гибель только дофаминер гических нейронов и сохранить норадренергические, за 30 мин до введения 6-ГДА подкожно вводили 25 мг/ кг десметилимипромина (ДМИ) - ингибитор обрат ного захвата норадреналина и, следовательно, 6-ГДА в норадренергические нейроны. Через 72 ч после инъ екции 6-ГДА у крыс под наркозом (хлоралгидрат, 400 мг/кг, Sigma, США) выделяли отделы мозга согласно рис. 1. Образцы замораживали в жидком азоте и хра нили при температуре -70°С до проведения высоко эффективной жидкостной хроматографии с электро химической детекцией (ВЭЖХ-ЭД). Для определения активности тирозингидроксила зы (ТГ) через 72 ч после стереотаксической инъекции 6-ГДА и за 30 мин до получения образцов всем жи вотным (опытным и контрольным) внутрибрюшинно вводили ингибитор декарбоксилазы ароматических аминокислот (ДАА) - 3-дигидроксибензилгидразин (NSD-1015, Sigma, США) в концентрации 100 мг/кг веса тела [12]. Затем под наркозом выделяли медиобазальный гипоталамус и остальную часть мозга. Активность ТГ в собранных образцах оценивали по накоплению L-диоксифенилаланина (L-ДОФА), измеренному с помощью ВЭЖХ-ЭД. Количество моно- и биферментных нейронов в аркуатном ядре крыс оценивали иммуногисто химическим методом. С этой целью через 72 ч по сле стереотаксической инъекции 6-ГДА проводили транскардиальную перфузию сначала 0.02 М фос фатно-солевым буфером (ФСБ, рН 7.2-7.4) в течение 10-15 мин, а затем охлажденным (до +4°С) 4% пара формальдегидом на 0.2 М фосфатном буфере (рН 7.3) в течение 15 мин. Затем выделяли мозг и проводили постфиксацию в 4% параформальдегиде в течение 12 ч при +4°C. После этого мозг промывали в 0.02 М ФСБ (3 раза по 15 мин), инкубировали в 20% сахарозе в течение 24 ч при +4°С и замораживали в гексане при -40°С. До проведения иммуногистохимического анализа образцы хранили в кельвинаторе при -70°С. У животных под наркозом собирали кровь из серд ца, центрифугировали (7000 об/мин, 20 мин, +4°С), а затем в плазме крови иммуноферментным методом определяли пролактин (ПРЛ). При определении ПРЛ в ткани гипофиза гормон предварительно экстрагировали в 0.05 M карбонатно бикарбонатном буфере [10]. Содержание мРНК ПРЛ определяли в передней доле гипофиза, выделенной после стереотаксиче ских инъекций. Каждая проба содержала материал от трех крыс. До выделения РНК образцы хранили в кельвинаторе при -70°С. Высокоэффективная жидкостная хроматография Содержание катехоламинов и метаболитов в ткани мозга определяли при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ с электрохимической детекцией [11]. Иммуногистохимия ТГ и ДАА выявляли на срезах медиобазального гипоталамуса толщиной 20 мкм, приготовленных на криостате и монтированных на стекла. Срезы по следовательно инкубировали с: (а) 3% бычьим сыво роточным альбумином (Sigma, США) и 0.3% Triton Х-100 (Sigma, США) на 0.02 М ФСБ в течение 30 мин при +20°С; (б) 1% лаурилсульфатом натрия (SDS, Sigma, США) на 0.02 М ФСБ в течение 3 мин при +20°С; (в) поликлональными антителами овцы к ТГ (1 : 700) (Chemicon, США) и поликлональными антителами кролика к ДАА (1 : 300) (Abcam, США) на 0.02 М ФСБ, содержащем 1% бычий сывороточ ный альбумин и 0.1% Triton Х-100 в течение 24 ч при +20°С; (г) с FITC-конъюгированными антитела ми осла против гамма-глобулинов овцы (1 : 40) (FITC antisheep, Sigma, США) и Су3-конъюгированными антителами козы против гамма-глобулинов кроли ка (1 : 500) (CY3 antirabbit, Sigma, США) на 0.02 М ФСБ в течение 2 ч при +20°С. После каждой инкуба ции, кроме последней, срезы отмывали в 0.02 М ФСБ в течение 15 мин. После последней инкубации срезы промывали в 0.02 М ФСБ в течение 1 ч, а затем за ключали в гидрофильную среду Mowiol (Calbiochem, Германия). Срезы гипоталамуса после двойного мечения на ТГ и ДАА исследовали с помощью флуоресцентного ми кроскопа Zeiss Observer Z1, оснащенного фильтрами для FITC (для ТГ), Cy3 (для ДАА), с использованием программного обеспечения AxioVision 4.8. Иммуноферментный анализ Cодержание ПРЛ в ткани передней доли гипофи за, образцах плазмы определяли иммунофермент ным методом c использованием коммерческих на боров SPIbio-Rat Prolactin EIA Kit (Bertin Pharma, Франция). ПЦР в реальном времени Суммарную РНК выделяли с применением TRI Reagent (Sigma, США) согласно протоколу произ водителя. Для удаления примеси геномной ДНК вы деленную РНК обрабатывали ДНКазой (Fermentas, США). РНК переосаждали в 4 М LiCl, концентра цию РНК измеряли на спектрофотометре Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, США). кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLV и гексамерных олигонуклеотидов (Fermentas, США). ПЦР в реальном времени проводили на ав томатическом амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с ис пользованием смеси qPCRmix-HS SYBR+ROX (Fermentas, США) и специфических олигонуклео тидов («Литех», Россия): смысловая последователь ность 5’-ATAGATGATTGGGAGGGGAAGAG-3’; а н т и с м ы с л о в а я п о с л е д о в а т е л ь н о с т ь 5’-CATCATCAGCAGGAGGAGTGTC-3’. Значения, полученные для каждого образца, нормирова ли на экспрессию гена «домашнего хозяйства» GAPDH. Уровень экспрессии гена GAPDH опреде ляли с использованием праймеров: смыслового - 5’-CTGACATGCCGCCTGGAGAAA-3’и антисмыс лового - 5’-TGGAAGAATGGGAGTTGCTGTTGA-3’. Относительную экспрессию гена рассчиты вали методом ΔΔCt с учетом эффективности ПЦР. Эффективность ПЦР определяли методом построения стандартных кривых [13]. Статистическая обработка Статистическую обработку данных выполняли при помощи интегрированных программ GraphPad Prism Version 6.0 для Windows (GraphPad Software, США). Данные представлены в виде: среднее арифметическое ± средняя ошибка среднего (M ± m). Статистическую значимость результатов определяли с использованием параметрического t-критерия Стьюдента (t-тест) и непараметрического U-критерия Манна-Уитни (U-тест). РЕЗУЛЬТАТЫ Концентрация дофамина в различных отделах мозга Через 72 ч после введения 6-ГДА концентрация ДА в стриатуме снижалась на 92%, в среднем мозге на 40%, в стволе на 44%. В то же время в гипоталаму се концентрация ДА не менялась по сравнению с кон тролем (рис. 2). Активность ТГ в различных отделах мозга Активность ТГ оценивали по уровню накопления L-ДОФА после введения ингибитора ДАА - NSD 1015. При моделировании дефицита синтеза ДА в мозге неонатальных крыс концентрация L-ДОФА в гипоталамусе не менялась по сравнению с контро лем, в то время как в остальной части мозга наблю далось ее статистически значимое снижение (рис. 3). Количество моно- и биферментных нейронов в аркуатном ядре Через 72 ч после введения 6-ГДА в боковые же лудочки мозга крыс количество моноферментных ТГ+ДАА-, моноферментных ТГ-ДАА+ и бифермент ных ТГ+ДАА+ нейронов в аркуатном ядре не меня лось по сравнению с контролем (рис. 4, 5) Пролактин в гипофизе и плазме крови Через 72 ч после введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крыс концентрация пролактина в плазме крови статистически значимо увеличива лась на 70%, а в гипофизе на 48%. В то же время со держание мРНК пролактина в гипофизе увеличилось в 2.5 раза (рис. 6). ОБСУЖДЕНИЕ У взрослых животных ДА, поступающий из гипота ламуса к гипофизу, регулирует функционирование периферических мишеней только через портальную систему циркуляции. В то же время согласно нашей гипотезе у неонатальных животных ДА в отсутствие ГЭБ может также поступать из всех популяций ней ронов непосредственно в общую систему циркуля ции. Ранее в экспериментах in vitro мы показали, что дофамин в той концентрации, в которой он со держится в периферической крови неонатальных крыс, ингибирует секрецию пролактина гипофизом [10, 14]. Однако в условиях in vivo лактотрофы на ходятся под постоянным тоническим воздействием ДА, тогда как в условиях in vitro клетки гипофиза долгое время содержатся в среде без ДА, что, по мне нию некоторых ученых, может качественно менять физиологию клетки [15]. Кроме того, этот подход не позволяет однозначно сказать, что регуляция осу ществляется именно через общую систему цирку ляции, так как концентрации ДА в периферической и портальной крови на данном этапе онтогенеза мо гут быть сопоставимыми. Анализ опубликованных данных позволил нам предположить, что эту проблему можно решить пу тем ингибирования синтеза ДА в мозге с помощью 6-ГДА - специфического нейротоксина катехолами нергических нейронов, который попадает в клетку с помощью специфических переносчиков ДА и но радреналина и ингибирует процесс окислительного фосфорилирования [16]. В связи с тем, что уровень экспрессии мембранного переносчика дофамина в нейронах медиобазального гипоталамуса достаточно низкий и механизмы за хвата у неонатальных животных развиты еще доста точно слабо [17, 18], мы предположили, что исполь зование 6-ГДА при моделировании дефицита ДА в мозге неонатальных крыс позволит нам разобщить описанные выше пути регуляции функциональной активности лактотрофов гипофиза. В связи с этим нами разработана модель специфического выключе ния синтеза дофамина в мозге новорожденных крыс. В этой модели уровень дофамина в мозге снижался на 54%, при этом в плазме крови снижение было еще более резким (70%) [11]. На основании имеющихся данных нельзя сделать однозначный вывод о том, что эффекты, которые будут наблюдаться на модели, обусловлены только ДА, поступающим из мозга в об щую систему циркуляции. Для того чтобы оценить, влияет ли нейротоксин на ДА-синтезирующие ней роны медиобазального гипоталамуса, мы, в первую очередь, определили содержание ДА и его метаболи тов в этой области после введения 6-ГДА. Показано, что в нашей модели уровень ДА в медиобазальном гипоталамусе не меняется по сравнению с контролем, в то время как в стриатуме, среднем мозге и стволе снижается статистически значимо. Эти данные мож но рассматривать как интегральный показатель того, что секреторная активность гипоталамуса не меняет ся под действием токсина. ДА синтезируется из аминокислоты тирозина с по мощью двух ферментов: ТГ и ДАА. В данной цепи реакций скоростьлимитирующим этапом является синтез L-ДОФА из тирозина под действием ТГ [19]. Поэтому в качестве прямого показателя синтеза ДА в нашей модели мы оценивали активность ТГ, опре деляя накопление L-ДОФА в медиобазальном ги поталамусе после ингибирования второго фермента синтеза ДА - ДАА. Оказалось, что уровень L-ДОФА в данной области не менялся по сравнению с контро лем, т.е. активность ТГ не меняется под действием нейротоксина. В то же время в остальной части мозга концентрация L-ДОФА снижалась в 2 раза по срав нению с контролем. Степень деградации нейронов мозга под действи ем 6-ГДА оценивают в основном методом иммуно мечения по ТГ. Однако известно, что, помимо истин но ДАергических нейронов, экспрессирующих оба фермента синтеза ДА, существуют также нейроны, содержащие только один из ферментов [20-22]. В на шей лаборатории ранее было показано, что в аркуат ном ядре у крыс в перинатальном периоде развития число моноферментных нейронов значительно пре вышает число биферментных. Так, на Э21 количество моноферментных нейронов в этой области составля ет 99%, а биферментных всего 1%. На стадии П9 би ферментные нейроны составляют 38% [23]. При этом показано, что моноферментные нейроны способны осуществлять совместный синтез ДА [24, 25]. Кроме того, при функциональной недостаточности туберо инфундибулярной системы гипоталамуса, вызванной введением в мозг 6-ГДА, у взрослых животных уве личивается число как ТГ-, так и ДАА-содержащих моноферментных нейронов [26]. По-видимому, такая реакция представляет собой проявление компен саторных процессов. В связи с этим на модели де фицита ДА мы оценили количество нейронов в ар куатном ядре с помощью двойного иммуномечения по ТГ и ДАА. Оказалось, что количество бифермент ных, моноферментных ТГ-содержащих и монофер ментных ДАА-содержащих нейронов не менялось по сравнению с контролем. Таким образом, мы получили доказательство того, что специфическое выключение синтеза ДА в мозге с помощью нейротоксина 6-ГДА не меняет морфо функциональное состояние медиобазального гипота ламуса. Это означает, что если на этой модели будут наблюдаться изменения в синтезе ПРЛ, то они будут обусловлены влиянием ДА исключительно через об щую систему циркуляции. В следующей серии экспериментов мы оценили влияние ДА, секретируемого мозгом в общую систе му циркуляции, на синтез пролактина гипофизом. Ранее в нашей лаборатории было показано, что инги биторное влияние ДА на секрецию пролактина впер вые обнаруживается на Э21 [27], т.е. в анализируе мый период этот механизм должен быть достаточно зрелым. Оказалось, что при снижении уровня ДА в плазме крови на 73% концентрация ПРЛ увеличи лась на 70%. Этот показатель характеризует уровень выделения ПРЛ лактотрофами гипофиза. Столь зна чительное увеличение концентрации ПРЛ в плазме в ответ на снижение концентрации ДА говорит о том, что дофамин, секретируемый мозгом в общую систе му циркуляции, оказывает ингибирующее влияние на выделение пролактина лактотрофами гипофиза. При этом концентрация ПРЛ в гипофизе увеличива ется на 48%. По-видимому, ДА, поступающий к гипо физу через общую систему циркуляции, не только ингибирует выделение ПРЛ, но и влияет на его син тез. Чтобы подтвердить влияние ДА на синтез ПРЛ в нашей модели, мы оценили уровень мРНК ПРЛ. Оказалось, что уровень экспрессии мРНК ПРЛ в ги пофизе животных с дефицитом ДА в 2.5 раза выше, чем в контроле. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, нам удалось показать, что в раннем постнатальном периоде до формирования ГЭБ ДА, выделяемый мозгом в общую систему циркуляции, оказывает ингибирующее влияние на синтез и выде ление ПРЛ лактотрофами гипофиза. Согласно нашей гипотезе об эндокринной функции мозга до формиро вания ГЭБ в раннем постнатальном периоде возмож ны два пути дофаминовой регуляции секреции ПРЛ гипофизом: ДАергическими нейронами гипотала муса через портальную систему циркуляции и дру гими популяциями ДАергических нейронов через общую систему циркуляции. Можно предположить, что на протяжении исследуемого нами периода онто генеза регуляция функционирования лактотрофов гипофиза через общую систему циркуляции вносит существенный вклад в регуляцию секреции ПРЛ.

Об авторах

Ю. O. Никишина

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: anna_sapronova@mail.ru
Россия

A. Я. Сапронова

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: anna_sapronova@mail.ru
Россия

M. В. Угрюмов

Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики»; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: mugrumov@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы